Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 512, № 1, стр. 500-505

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе исследования проведен молекулярно-генетический анализ ДНК, выделенной из музейных образов черепов амурского тигра, хранящихся в коллекциях Зоологического музея МГУ и Зоологического института РАН, и проб экскрементов, волос и крови животных этого вида, собранных нами в ходе выполнения “Программы изучения амурского тигра на Российском Дальнем Востоке“ в рамках Постоянно действующей экспедиции РАН по изучению животных Красной книги Российской Федерации и других особо важных животных фауны России.

Проанализирован 61 образец от черепов амурских тигров, собранных в период с 1938 по 1994 г. в Хабаровском и Приморском краях (табл. 1). Эти образцы представляли историческую выборку. Для дальнейшего сравнения с данными от 44 животных из современной выборки 2009–2013 гг., опубликованными ранее [5], использованы результаты молекулярно-генетического анализа музейных образцов только от 22 амурских тигров с наиболее полными генетическими профилями. Результаты молекулярно-генетического анализа этих образцов отражают генетическую изменчивость этого подвида в 1938–1994 гг. XX в.

Для исторической и современной выборок исследование проведено на одних и тех же микросателлитных локусах только на территории сихотэ-алинской субпопуляции (рис. 2).

Рис. 2.

Места сбора черепов из музейных коллекций и проб амурского тигра для генетического анализа.

Пробы костной ткани брали из нижней челюсти с помощью дрели Proxxon (Германия) и сверла по металлу диаметром 1–1.2 мм. Измельченную костную ткань хранили при –20°C. Выделение ДНК проводили с помощью набора QIAamp DNA investigator kit (Qiagen, Германия) по протоколу выделения ДНК из костной ткани.

Ядерную ДНК анализировали по описанной ранее методике [5]. ПЦР со всеми праймерами повторяли 4 раза. Обобщенный генотип животных принимали, если гетерозиготные аллели повторялись дважды, а гомозиготные трижды. Изменения в частоте встречаемости аллелей определяли с помощью критерия Фишера, принимая достоверными при уровне значимости p < 0.05. Прохождение популяцией бутылочного горлышка оценивали, используя тесты для определения избытка гетерозигот в программе Bottleneck, v.1.2.0.2 и моделями мутаций I.A.M., T.P.M. и S.M.M. [6]. Ожидаемую гетерозиготность (He), наблюдаемую гетерозиготность (Ho) и М-статистику [7] рассчитывали в программе Arlequin v3.5.1.2. [8]. Эффективный размер популяции Ne рассчитывали методом linkage disequilibrium (LD) в программе NeEstimator V2 [9]. Аллельное разнообразие (allelic richness) рассчитывали в программе Fstat 294 [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Всего получены генетические профили для 22 музейных и 44 современных особей амурского тигра.

Для амурского тигра нами получены данные по частотам 9 микросателлитных локусов (табл. 2), аллельному разнообразию (Ar), ожидаемой гетерозиготности (He), наблюдаемой гетерозиготности (Ho) и значение коэффициента Гарза-Вильямсона (М) (табл. 3).

Уменьшение аллельного разнообразия Аr при резком уменьшении численности приводит к уменьшению редких аллелей [11]. Анализ исследуемых выборок показал его увеличение на одну аллель для 3 локусов и уменьшение также для 3 локусов (табл. 3). Во всех случаях частоты таких аллелей были меньше 7%. Разнонаправленное изменение значений аллельного разнообразия свидетельствует о том, что выборка проанализированных образцов, по-видимому, не в полной мере отражает генетическое разнообразие исследуемой популяции в разные исторические периоды, так как увеличение числа аллелей в современной выборке по сравнению с исторической в данные малые периоды времени могло произойти только за счет миграций и не могло появиться за счет накопления мутаций в геноме. Достоверное изменение частот аллелей между двумя выборками отмечено для 5 аллелей из 3 локусов.

Эффективный размер популяции (Ne), рассчитанный для исторической выборки, составил 11.4 (95% интервал 5.1–28.8), для современной – 34.4 (95% интервал 17–106.8). Сравнимое значение Ne, рассчитанное LD методом для выборки 2001–2002 гг., составило 26 животных (95% интервал 12–79) [12]. Значительно более низкий эффективный размер популяции для исторической выборки может свидетельствовать о значительно меньшей численности популяции в этот период по сравнению с современной.

Анализ прохождения популяцией бутылочного горлышка по современной выборке по тесту Вилкоксона (Wilcoxon test) при анализе избытка гетерозигот показывает достоверные результаты по всем мутационным моделям I.A.M. (P = = 0.00098), T.P.M. (P = 0.00098), S.M.M. (P = = 0.00098). По исторической выборке по моделям I.A.M. (P = 0.00098) T.P.M. (P = 0.00098), S.M.M. (P = 0.00195) результаты аналогичные. Другие тесты также подтверждают наличие бутылочного горлышка в недавнем историческом прошлом. Достоверное значение теста Вилкоксона при анализе избытка гетерозигот по мутационной модели T.P.M. (P < 0.001) обнаружено также для современной выборки из 15 животных 1999–2000 гг. [13].

Коэффициент M для теста Гарза-Вильямсона, оценивающий бутылочное горлышко в более раннем историческом периоде (больше 100 поколений назад), для обеих выборок составил 0.38, что значительно ниже пороговой величины M = = 0.68, характерной для предположительно стабильных популяций [7]. В других исследованиях бутылочное горлышко в этот период не подтверждается, при этом значение М составило 0.67 [12] и 0.835 [13]. По данным митохондриальной ДНК в современной популяции описано 3 гаплотипа, что также подтверждает бутылочное горлышко [14]. Это может быть также связано с изначально низкой численностью особей основателей, пришедших на современную территорию обитания амурского тигра около 10 000 лет из Центральной Азии [15].

Таким образом, в отличие от предыдущих исследований в нашей работе впервые подтверждено прохождение популяцией периода низкой численности сразу двумя принципиально разными моделями. Предполагается, что популяция проходила как минимум два таких периода – в историческом (около 10 000 лет назад [14]) и в недавнем (середина ХХ в. [2]) прошлом.