Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2019, T. 55, № 1, стр. 37-42

ВВЕДЕНИЕ

Изучение эритроцитов (ЭЦ) осуществляется вот уже более 300 лет с момента их открытия во второй половине XVII века (около 1670 г.) Антоном Левингуком (1623–1732 г.). Результаты обширных морфологических исследований сравнительного (эволюционного) плана представлены в ряде обзоров и монографий более позднего времени [1–3]. В дальнейшем исследование эритроцитов приобрело химико-физиологический характер. В 1747 г. в крови было обнаружено железо (Fe), красящее вещество крови получило название гемоглобин(1884 г.), затем в крови были обнаружены газы, в 1886 г. установлено связывание кислорода крови гемоглобином [4]. В начале XX века началось изучение “дыхательной функции крови” – термин, введенный Дж. Баркрофтом, внесшим значительный вклад в изучение этой проблемы [5, 6]. В 60-е годы возобновляется интерес к исследованию липидов, так как были разработаны новые эффективные методы их выделения из тканей, разделения на классы, определения их жирных кислот и методы субклеточного фракционирования. Также окончательно было сформировано модельное представление о структуре клеточной мембраны, указывающее на значительную роль липидов в мембране. В этот же период был разработан метод выделения эритроцитарной мембраны (теней эритроцитов) [7]. Все это способствовало широкому изучению как липидного состава [8], так и других биохимических параметров эритроцитов различных видов организмов [9] в норме, и при различных патологиях и воздействиях [10, 11]. В частности, в ИЭФБ им. И.М. Сеченова РАН проводились работы по влиянию различных стрессовых воздействий (иммобилизация, гипотермия, голодание, физическая нагрузка, бег на тредмиле и др.) на активность Na,K-АТФазы эритроцитов [12, 13].

Известно, что физическая нагрузка вызывает усиленное потребление организмом кислорода. Это приводит к изменению рН крови в капилляре и в клетке эритроцита, что может оказывать влияние на экстракцию фосфолипидов и на их жирнокислотный состав [14]. Эритроцит является системой, состоящей из воды, неорганических и органических веществ, свойства которой отличаются от свойств составляющих ее компонентов. Таким образом, в эритроците возникают гидрофильные и гидрофобные кислотно-основные среды, в которых диффундирует кислород. Теоретические основы искажения кислотно-основных свойств молекул гемоглобина при взаимодействии с внутренней средой эритроцита во всех деталях неизвестны. Во-первых, гемоглобин находится в гидрофильной среде. Известно, что скорость поглощения кислорода взвесями эритроцитов значительно ниже, чем растворами гемоглобина, следовательно, плазматическая мембрана замедляет диффузию [4]. В эритроците во время нахождения в капиллярах в результате перемещения ионов возникает перемещение цитоплазмы вблизи мембраны, что создает локальное изменение рН и температуры, которые влияют на диффузию кислорода. Во-вторых, плазматическая мембрана эритроцита является гидрофобной средой, образованной из фосфолипидов и содержит канальные белки (аквапоры), через которые осуществляется диффузия кислорода. Предполагают, что мембранный потенциал эритроцитов влияет на конформацию канальных белков, что приводит к их открытию и закрытию. Следовательно, сродство и отторжение кислорода гемоглобином в эритроцитах, а также его диффузия зависят от строения всей системы, о которой говорилось выше, а не только от одного фактора – изменения кислотности в водной среде [14, 16]. Кроме того, во время экстракции из эритроцитов происходит также омыление небольшой части липидов смесью хлороформ:метанол и их перекисное окисление [15, 16], которое может отразиться на составе ЖК.

Целью данной работы было определение влияния сильного стрессового воздействия – плавание в холодной воде (до потопления) на жирнокислотный состав фосфолипидов эритроцитов крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись белая крыса (Rattus rattus). Крысу содержали в обычных условиях вивария на стандартном пищевом рационе. Отобранных крыс (самцов) весом 180–200 г с грузом, составляющим 7% веса крысы, опускали в ванну с температурой воды 28°C (холодной), которая на 10°С ниже температура тела крысы (38–39°С). Нагрузка в 7% веса является лишь эмпирически подобранным техническим (методическим) приемом для сокращения длительности эксперимента (потопления). Крысa интенсивно плавала, обычно в течение 6–10 мин, до момента, после которого она в течение 5–10 с не могла подняться наверх со дна (потопление). Затем крысу вынимали, обсушивали и собирали кровь для анализа. Из собранной крови (по 2–3 мл из каждой особи) выделяли эритроциты центрифугированием в течение 5 мин при 3000 об/мин (на центрифуге LMC-3000, Biosan) в ACD-растворе (96 мМ лимонной кислоты, 120 мМ цитрата Na и 200 мМ глюкозы) и гепарине, охлажденных до 0°С. Полученный осадок дважды промывали двукратным объемом 0.9% NaCl, чтобы уменьшить рН внешней среды эритроцитов и предотвратить возможное омыление фосфолипидов (ФЛ) во время последующей экстракции их в смеси хлороформ-метанол (2 : 1). В исследовании было использовано 5 особей контрольных и 5 опытных крыс. Экстракцию ФЛ из полученной фракции, определение фосфолипидного фосфора, метилирование жирных кислот и их газохроматографический анализ проводили, как описано нами ранее в статье 2012 г. Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики (с использованием программы Excel). Данные представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего. Статистическую значимость различий средних величин вычисляли с помощью t-критерия Стьюдента, достоверными считались результаты при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты по влиянию изученного стрессового воздействия представлены в табл. 1. Обращает внимание практически одинаковое среднее содержание в эритроцитах контрольных и опытных животных основных в количественном отношении (более 10%) жирных кислот (ЖК). Это касается как насыщенных, так и моноеновых и полиеновых кислот. Вместе с тем следует отметить, что другой статистический параметр – коэффициент вариабельности (КВ) содержания отдельных кислот – у опытных животных значительно превышает его величину у контрольных крыс, что свидетельствует о влиянии на среднюю величину различных дополнительных причин, вызывающих варьирование основного параметра, и что степень этого варьирования специфична для каждой кислоты. Наиболее стабильной (при стрессовом воздействии) является насыщенная стеариновая (С18:0), кислота, у которой КВ почти такой же, как у контрольных крыс, тогда как у пальмитиновой (С16:0) КВ снижен на 30% по сравнению с контролем. Что касается моноеновой олеиновой (С18:1) кислоты, то ее КВ в условиях эксперимента увеличивается в 3 раза. Такое же увеличение КВ в 3 раза характерно и для эссенциальной, не синтезируемой в организме линолевой (С18:2ω6) кислоты, тогда как КВ ее производной высоко ненасыщенной арахидоновой (С20:4ω6) кислоты меняется в меньшей степени. При этом, как отмечено выше, среднее содержание всех кислот не изменяется.

Таким образом, представленные данные показывают, что вариабельность содержания основных насыщенных кислот эритроцитов – пальмитиновой (С16:0) и стеариновой (С18:0) – мало подвержена влиянию стрессового воздействия. То же можно сказать и о полиненасыщенной арахидоновой кислоте (С20:4 ω6), вариабельность которой сравнима с насыщенными кислотами. Такая “устойчивость” к внешним воздействиям этих основных в количественном отношении ЖК (вместе они составляют 70% всех кислот) указывает на их определяющее значение как основы (“матрицы”) липидного бислоя мембраны, которую необходимо сохранить в любых условиях (в частности при стрессовых воздействиях), чтобы обеспечить существование самой мембраны. Вместе с тем высокая вариабельность ненасыщенных кислот – (С18:1 и С18:2ω6) – по-видимому, связана с участием их метаболитов в регулировании необходимой в условиях стресса интенсивности обменных процессов.

Другая длинноцепочечная и высоко ненасыщенная ЖК – докозогексаеновая (С22:6ω3), является производной эссенциальной кислоты ω-3 типа линоленовой (С18:3ω3). В последние двадцать лет в литературе много внимания уделяется кислотам ω-3 типа (С20:5ω3 и С22:6ω3) в связи с изменением их содержания при ряде “заболеваний века”. В 2004 г. [17, 18] предложен ω-3 – индекс (О3I) как фактор риска при ряде заболеваний. Этот индекс выражает отношение суммы С20:5ω3 + С22:6ω3 кислот к общему количеству ЖК в эритроцитарной мембране в процентах. Высокий индекс О3I ≥ 8% обеспечивает значительную кардиопротекцию, тогда как О3I ≤ 4% не обладает таким свойством [18]. Обнаружена также связь содержания ω-3 кислот в эритроцитарной мембране при нервных заболеваниях, таких как депрессия [19], при этом в острых случаях содержание ω-3 кислот уменьшается. Аналогичная картина наблюдается при нарушении когнитивных способностей людей пожилого возраста [20], а увеличение ω-3 кислот приводит к улучшению памяти у этих людей [21]. Причина такого влияния ω-3 кислот на разные клетки и ткани организма кроется в трансформации их под влиянием ряда ферментов (липоксигеназ, циклогеназ, растворимой эпоксигидролазы) в широкое разнообразие локально действующих биоактивных метаболитов [22, 23]. Приведенные в табл. 2 данные показывают, что примененное авторами стрессовое воздействие сопровождается значительным снижением ω-3-индекса (О3I) с 3.7% до 2.2%, т.е. на 50%. Эти данные согласуются с литературными данными, приведенными выше, поскольку разные патологические состояния можно рассматривать как частный случай стресса. Вместе с тем очень высокая вариабельность ω-3кислот как у контрольных, так и у опытных животных (хотя и несколько сниженной) отражает, по-видимому, определяющую роль этих кислот в функционировании липидной компоненты эритроцитарной мембраны.

В заключение следует отметить, что полученные данные свидетельствуют об отсутствии прямого, непосредственного влияния изученного стрессового воздействия на содержание основных ЖК (С16:0, С18:0, С18:1, С18:2ω6 и С20:4ω6) мембран эритроцита. Это согласуется с данными наших более ранних исследований, не обнаруживших существенных изменений содержания ЖК при других стрессовых воздействиях, таких как бег на тредмиле, голодание разной длительности и сочетание этих двух воздействий [14, 24]. Вместе с тем само варьирование в широких пределах содержания ЖК у подвергнутых стрессу животных может иметь отношение к каким-либо другим мембранным функциям эритроцита, например, механизму усиленного дыхания в условиях стрессового воздействия.

В настоящее время одной из проблем стрессовых воздействий на ЖК состав ФЛ является выяснение природы сил, действующих как между отдельными участками ЖК разных ФЛ, так и частями белковых молекул. Из литературы известно, что распределение ФЛ в плазматической мембране эритроцитов ассиметрично, ФХ и СФМ преобладают в наружном монослое, а во внутреннем – ФЭА, ФС и п-ФЭА. Благодаря ассиметрии ФЛ зона изолирующего слоя между двумя поверхностными зарядами плазматической мембраны содержит более ненасыщенные ЖК во внутреннем монослое. Согласно Г. Льюису, ненасыщенные связи жирных кислот являются основаниями, т.е. донорами электронных пар в гидрофобной зоне плазматической мембраны эритроцита. Следовательно, внутри в гидрофобной зоне ЖК ФЛ возникает потенциал, который, возможно, влияет на аквапоры и Na⁺/K⁺ насосы, через которые диффундируют молекулы кислорода, а не только разность электрических потенциалов с двух сторон плазматической мембраны эритроцита [15]. Между молекулами ЖК ФЛ в плазматической мембране эритроцитов действует взаимное притяжение, которое возникает в результате взаимного действия электронов и ядер. Свойства ненасыщенных молекул ЖК ФЛ определяются π-электронами. Они подвижнее σ-электронов и с легкостью вступают в химические реакции, так как являются более удаленными от оси связи, чем электроны простой ковалентной связи, что придает им заряд и возможность отдавать электроны. Известно, что каждая молекула ФЛ меняет своих соседей в результате латеральной диффузии миллион раз в секунду, благодаря чему осуществляется образование неустойчивых комплексов, которые называют комплексами с переносом заряда. Их движущиеся заряды образуют электрический ток и магнитное поле. Магнитное поле представляет собой особую форму материи. Известно, что поток электромагнитного излучения – это совокупность отдельных квантов. Лидер “квантовой революции” М. Борн сделал заключение, что волновая функция характеризует вероятность состояния реальной частицы – кванта, (а не какую-то реальность типа электромагнитной волны), для которого нет траектории. Следовательно, при физической нагрузке (плавание) возможны сбои с переносом заряда в ненасыщенных жирных кислотах фосфолипидов в плазматической мембране эритроцита, а также влияние на белки аквапор и Na⁺/K⁺ насосов, через которые диффундируют молекулы кислорода. Полученные данные о чрезвычайной вариабельности ЖК состава ФЛ, в особенности ненасыщенных кислот (С18:1 и С18:2), эритроцитарной мембраны на стрессовые воздействия позволяют предположить, что возможны разные механизмы ответа на стресс. Одним из механизмов является ПОЛ, косвенным проявлением которого выражается уменьшение содержания ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов у части опытных животных. Однако у других животных наблюдается их увеличение, что возможно связано с наличием другого механизма ответа на стресс, т.е. сбой с переносом заряда в ненасыщенных жирных кислотах фосфолипидов в плазматической мембране эритроцита у отдельных особей. Следовательно, эритроцит подчиняется закону биологии Э.С. Бауэра [25], так как основная доля эритроцитов сохраняет без изменения свой основной жирнокислотный состав (С16:0, С18:0 и С20:4ω6) в фосфолипидах плазматической мембраны.