Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2019, T. 55, № 3, стр. 179-187

ВВЕДЕНИЕ

Работа посвящена одной из проблем физиологии – изучению механизмов регуляции ритмической организации физиологических функций. В настоящее время существует большое количество информации по различным аспектам развития холинергической системы [1–4]. Известно, что характер межсистемной интеграции неразрывно связан с развитием регуляторных систем организма.

Ранее было установлено, что у крысят в первые часы после рождения усиливается взаимосвязь между активностью соматомоторной и сердечнососудистой систем. С этого момента происходит кардинальное изменение функционирования и дыхательной системы, соответственно, меняется характер ее взаимодействия с другими возбудимыми системами организма [5]. Известно, что в раннем постнатальном онтогенезе млекопитающих спонтанная периодическая моторная активность, являющаяся отражением процессов возбуждения в соматической нервной системе, оказывает значительное влияние на работу сердечно-сосудистой и дыхательной систем. Координация деятельности этих систем является необходимым условием обеспечения гомеостаза организма и важнейшим элементом механизма адаптивных перестроек при изменениях факторов внутренней и внешней среды. Важность холинергической системы для развивающегося организма не вызывает сомнения.

Целью данной работы является получение более полного представления об онтогенетических особенностях холинергических регуляторных влияний на деятельность соматомоторной, дыхательной и сердечно-сосудистой систем в условиях активации холинореактивных структур, а также на фоне блокады мускариновых холинорецепторов (М-ХР).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Опыты проводили на лабораторных крысах линии Вистар. На новорожденных 1-дневных (Р1) и 16-дневных (Р16) крысятах исследовали функциональную активность сердечной, дыхательной и соматомоторной систем в норме и в условиях активации холинореактивных структур после применения ингибитора ацетилхолинэстеразы (АХЭ) эзерина. Для выявления роли периферических M-ХР в развитии патологических реакций осуществляли премедикацию животных метацином с последующим введением эзерина. Опыты выполняли в соответствии с правилами, рекомендованными Физиологической секцией Российского национального комитета по биологической этике.

Были выбраны два возрастных срока, Р1 и Р16 (период прозревания), в которые кардинально меняется функциональная активность исследуемых систем. Каждая возрастная группа состояла из 30‑ти животных без разделения по половому признаку. Регистрацию проводили на ненаркотизированных крысятах в условиях мягкой фиксации животных, которая позволяла осуществлять альтернирующие движения лап. Во время эксперимента крысят помещали в термостатированную камеру, температуру в которой стабильно поддерживали на уровне 28 ± 0.5°С (температура в гнезде). Контроль температуры осуществляли с помощью цифрового термометра RST-02100 (RST, Швеция).

Исследовали ЭКГ, показатели внешнего дыхания, ЭМГ мышц задней лапы (икроножная мышца). Регистрацию начинали после адаптации животного к условиям эксперимента. В целях снижения уровня шумов при регистрации ЭКГ применяли нестандартное отведение от теменной части головы и крестцовой области. Для анализа частоты дыхания осуществляли регистрацию перкуссии грудной клетки с использованием пьезоэлектрического датчика VP-102 (RFT, Германия).

В экспериментах использовали усилители биопотенциалов ИУ-40 (производство ЭПМ НИИЭМ РАМН). ЧДД регистрировали при полосе пропускания усилителя от 0.15 до 30 гц, ЭКГ – от 5 до 50 Гц, ЭМГ – от 5 до 150 Гц. Для ввода аналоговых сигналов в компьютер использовали АЦП E14-440 (L-card, Россия) с периодом дискретизации 0.5 мс. Общее время исследования каждого животного составляло от 90 до 120 мин. Анализ регистрируемых сигналов проводили в программе “PowerGraph 3.3.9”.

У интактных крысят перед введением препаратов в течение 30 мин определяли показатели моторной активности (МА), сердечного и дыхательного ритмов. Вычисляли коэффициент регулярности дыхания [6] только для интактных животных, так как эзерин вызывает значительную дестабилизацию дыхательного ритма. В программе “Origin 7.5” проводили спектральный анализ прореженной периодограммы ритма сердца по алгоритму быстрого преобразования Фурье (БПФ) с применением окна Ханна. При наличии высокоамплитудных брадикардических комплексов сердечных сокращений использовали 32768 точечное БПФ (33 с) с последующим усреднением спектров. В остальных случаях применяли 131072 точечное БПФ (2.2 мин). Анализ вариабельности сердечного ритма (ВСР) выполняли по трем частотным диапазонам: HF 0.8–2.5 Гц, LF 0.3–0.8 Гц, VLF 0.03–03 Гц. Данные частотные диапазоны были выбраны нами на основании литературных и собственных экспериментальных данных [5, 7]. Рассчитывали мощности спектров в диапазонах HF, LF, VLF в процентах к общей мощности спектра (To), а также показатели LF/HF, HF/To. Для анализа ВСР 16-дневных крысят подбирали животных, у которых в фоне ЧДД не превышала верхнюю границу диапазона HF.

В ходе исследования было проведено две серии экспериментов. В первой серии после 30-минутной регистрации показателей у интактных животных крысятам вводили антихолинэстеразное вещество обратимого действия эзерин. Для 1-дневных крысят опытным путем нами была определена LD₅₀ эзерина (1.75 мг/кг внутрибрюшинно (в/бр)), и на ее основе была установлена рабочая доза 1.3 мг/кг в/бр (¾ LD₅₀), которая позволяла получить четкую реакцию исследуемых систем на действие эзерина при минимальном уровне смертности животных (менее 20%). Доза 1.3 мг/кг оказалась летальной для крысят старшего возраста, гибель которых наступала из-за остановки дыхания. Поэтому для 16-дневных животных нами была индивидуально определена LD₅₀ эзерина, равная 0.95 мг/кг, рабочая доза составила 0.7 мг/кг в/бр (¾ LD₅₀).

Регистрацию физиологических показателей начинали сразу после инъекции, анализу подвергались фрагменты записей с 10-й по 30-ю мин (период максимального эффекта эзерина) и два последующих 30-минутных фрагмента – период последействия. Такой подход к рассмотрению данных связан с высокой вариативностью исследуемых ритмов после активации холинореактивных структур.

Во второй серии экспериментов осуществляли премедикацию животных М-холинолитиком метацином (1 мг/кг, в/бр) с последующей (через 10 мин) инъекцией эзерина. Анализ данных после инъекции эзерина проводили по описанной выше схеме (20+30+30 мин). Известно, что метацин, являясь четвертичным производным бензацина, обладает, помимо выраженного периферического М-холинолитического действия, слабым ганглиоблокирующим эффектом, который проявляется при увеличении дозы препарата. В предварительных исследованиях, выполненных на новорожденных крысятах, нами установлено, что инъекция метацина в дозе 1 мг/кг в/бр не вызывает значимых изменений ЧСС и ЧДД, увеличение дозы препарата до 2 мг/кг в/бр приводит к реакциям, сходным с последствиями блокады никотиновых холинорецепторов [8].

Моторную активность животных оценивали по интегральным показателям ЭМГ. Для анализа индивидуальных изменений интенсивности ЭМГ использовали показатели: (Time_act) – суммарная длительность потенциалов действия в процентах к общему времени регистрации; (Power_EMG) – суммарная величина амплитуд потенциалов действия мышцы, зарегистрированных в период активности “Time_act” и нормированных к одной минуте. Для оценки изменений сердечного ритма ЭКГ преобразовывали в периодограмму, а дыхательный ритм оценивали по спектрам дыхательных движений. Рассчитывали частоту сердечных сокращений (ЧСС) и дыхательных движений (ЧДД).

Статистическую обработку данных осуществляли в программе “Origin 2015”. Использовали парный тест Стьюдента с поправками Холма. Статистически обработанные данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. Все изменения рассматривали по отношению к фоновым показателям до введения препаратов. Различия считали статистически значимыми при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сердечная деятельность и дыхание. У большинства интактных крысят регистрируется правильный синусовый ритм с амплитудно-частотными модуляциями. Cреднее значение ЧСС у крысят на Р1 практически в два раза ниже, чем на Р16 (табл. 1). У 25% интактных крысят обоих возрастов наблюдаются нерегулярные брадикардические колебания сердечного ритма с длительностью в несколько секунд. Подобные результаты были получены и у крысят в первые часы после рождения (Р0) [9].

Анализ ВСР показал, что у 1-дневных интактных крысят вагосимпатический баланс смещен в сторону преобладания парасимпатических влияний, в то время как на 16 сут в регуляции сердечного ритма доминируют гуморально-метаболические и симпатоадреналовые влияния (рис. 1).

Рис. 1.

Изменения показателей ВСР у 1-дневных и 16-дневных крысят после инъекции эзерина в дозе ¾ LD50 (а, в) (в норме, в ПМЭ и в последействии) и после инъекции эзерина на фоне премедикации метацином (б, г) (в норме, после инъекции метацина, эзерина и в последействии).

По оси абсцисс – показатели ВСР, по оси ординат – значения сдвигов для показателей VLF, LF, HF даны в % по отношению к значению To данного периода обследования; значения LF/HF, HF/To (у.е.).

У интактных крысят дыхание нестабильно, с выраженными колебаниями как частоты, так и глубины дыхательных движений. Ритм дыхания связан с характером двигательной активности, он дестабилизируется не только комплексами и вспышками МА, но и отдельными вздрагиваниями (джерками). У 1-дневных крысят присутствуют множественные апноэ. В разных возрастных группах колебания частоты дыхания, связанные с характером МА, имеют разную направленность [5]. Средняя ЧДД и регулярность дыхания 16-дневных крысят значительно выше, чем у 1-дневных (коэффициент регулярности на Р16 составляет 0.51 ± 0.04, коэффициент регулярности на Р1 – 0.34 ± 0.01).

Ингибирование ацетилхолинэстеразы (АХЭ) эзерином и последующая активация холинореактивных структур провоцирует развитие нарушений сердечного ритма, которые у 1-дневных крысят становятся выраженными примерно через 10 мин после инъекции. Длительность периода максимального эффекта эзерина (ПМЭ) составляет около 20 мин, и в это время наблюдается феномен, который можно обозначить как “стадия брадикардической аритмии”. У животных происходит значительное урежение сердечного ритма, на фоне которого возникают комплексы еще более выраженной брадикардии, следующие в декасекундном и околоминутном ритме (рис. 2д, 4). Характерной особенностью брадикардических комплексов (БК) в этот период является то, что при максимально низкой частоте сердцебиений их амплитуда может достигать размера более 1 с (~600–700% по сравнению с фоновым уровнем), так называемые высокоамплитудные комплексы. Периодограмма ритма сердца 1-дневного крысенка на стадии брадикардической аритмии представлена на рис. 2б, 2. По окончании ПМЭ у животных наблюдается стадия постаритмии (последействия), во время которой размах БК уменьшается, а период их возникновения составляет несколько минут [10].

Рис. 2.

Спонтанная моторная активность (1), периодограмма сердечного ритма (2) у интактного 1-дневного животного (а), после инъекции эзерина в дозе 1.3 мг/кг (б) и после инъекции эзерина на фоне премедикации метацином (в).

На г, д, е: фрагменты одновременной регистрации моторной активности (1), дыхания (3), ЭКГ (4).

По оси абсцисс – время наблюдения (мин), по оси ординат 1, 3, 4 – нормированная амплитуда, (у.е.); 2 – амплитуда периодограммы сердечного ритма, (с).

Эзерин, введенный 16-дневным крысятам, начинает действовать позже, через 12–13 мин. Стадия брадикардической аритмии на Р16 в 67% случаев полностью отсутствует, а в остальных – укорачивается. Амплитуда БК в среднем на 150–200% больше, чем до введения препарата. Урежение сердечного ритма на этой стадии на 35.7% меньше, чем у 1-дневных крысят. Периодограмма ритма сердца 16-дневного крысенка в ПМЭ представлена на рис. 3б, 2. Стадия постаритмии представлена низкоамплитудными, уменьшенными по размаху комплексами. Восстановление правильного синусового ритма происходит быстрее, чем у 1-дневных животных. Показатели ЧСС и ЧДД у крысят на разных стадиях действия эзерина представлены в табл. 1.

Рис. 3.

Спонтанная моторная активность (1), периодограмма сердечного ритма (2) у интактного 16-дневного животного (а), после инъекции эзерина в дозе 0.7 мг/кг (б) и после инъекции эзерина на фоне премедикации метацином (в).

На г, д, е: фрагменты одновременной регистрации моторной активности (1), дыхания (3), ЭКГ (4).

По оси абсцисс – время наблюдения (мин), по оси ординат 1, 3, 4 – нормированная амплитуда (у.е.); 2 – амплитуда периодограммы сердечного ритма (с).

Анализ ВСР показал (рис. 1а, 1в), что инъекция эзерина крысятам обеих возрастных групп приводит к перераспределению регуляторных влияний и их усилению со стороны центральных и гуморально-метаболических факторов. Вместе с тем имеются определенные возрастные различия, заключающиеся в том, что в ПМЭ на Р1 вклад парасимпатических влияний снижается на 46.9%, а гуморально-метаболических увеличивается на 43.2%. На Р16 это соотношение составляет 20.7% и 22.9% соответственно. Доля симпатических влияний со стороны симпатической нервной системы после введения эзерина увеличивается на 3.7% на Р1 и снижается на 2.2% на Р16. Сдвиг вагосимпатического баланса сопровождается нарушениями синусового ритма сердца, особенно выраженными у крысят младшего возраста.

У животных обеих возрастных групп дыхательная система реагирует на введение эзерина на несколько минут раньше, чем сердечнососудистая система. Происходит снижение ЧДД и дестабилизация ритма дыхания (табл. 1; рис. 2б, 3; рис. 3б, 3). На Р16 прослеживается тенденция к восстановлению ритма дыхания, в то время как на Р1 снижение ЧДД в ПМЭ более глубокое и восстановления не происходит даже к концу наблюдения (90 мин после инъекции).

Блокада М-ХР метацином не приводит к значимым изменениям ЧСС и ЧДД у крысят обоих возрастов, хотя и есть качественные различия в направленности сдвига ЧДД на Р1 и Р16 (табл. 2, 3). Введение животным эзерина на фоне блокады М-ХР вызывает замедление ЧСС у крысят обоих возрастов без нарушений самого ритма. Наиболее эффективно отрицательное хронотропное действие эзерина купируется блокадой М-ХР у 1-дневных крысят. В ПМЭ на Р1 стадия выраженной брадикардической аритмии полностью отсутствует, наблюдаются незначительные, близкие к фоновым, около- и многоминутные модуляции сердечного ритма (рис. 2г, 2). У 16-дневных крысят в 67% случаев сохраняются низкоамплитудные БК (рис. 3г, 2), а в остальных случаях регистрируются околоминутные модуляции сердечного ритма.

Показатели ВСР после инъекции метацина незначительно изменяются по отношению к фоновым значениям (рис. 1б, 1г). Однако имеются возрастные различия, заключающиеся в тенденции к снижению доли парасимпатических влияний на Р1 и в их усилении на Р16. Несмотря на то что у 16‑дневных крысят наблюдается некоторое усиление парасимпатических влияний, преимущественно за счет снижения вклада гуморально-метаболических факторов, последние все равно остаются доминирующими.

После инъекции эзерина у крысят на Р1 продолжает развиваться тенденция, ведущая к усилению роли центральных и гуморально-метаболических влияний за счет уменьшения парасимпатических. На Р16 наблюдается дальнейшее снижение низкочастотных (VLF) составляющих модулирующих ритмов при незначительном росте симпатических и парасимпатических влияний.

Наблюдаемые нами возрастные различия в направленности сдвигов вагосимпатического баланса могут быть связаны с гетерохронией развития различных подтипов холинорецепторов. Известно, что между М- и Н-холинорецепторами (Н-ХР) существуют реципрокные отношения [11]. Блокада М-ХР вызывает активацию структур, имеющих в своем составе Н-ХР. Учитывая широкую представленность последних в различных структурах, включая кору надпочечников, нельзя исключить участие Н-ХР в механизмах регуляции сердечного ритма посредством изменения вклада гуморально-метаболических влияний.

Инъекция метацина приводит к снижению ЧДД, более выраженному у 16-дневных крысят. Ингибирование АХЭ, осуществленное на фоне блокады М-ХР, практически не изменяет пониженную ЧДД у крысят на Р1 (табл. 2) и вызывает восстановление частоты дыхания у животных на Р16 (табл. 3). Дизритмия дыхания отсутствует после введения животным метацина и возникает у 1‑дневных после инъекции эзерина. На Р16 мы не обнаружили у крысят значимых нарушений ритма дыхания.

Двигательная активность. У новорожденных интактных крысят спонтанная моторная активность представлена совокупностью длительных моторных комплексов, моторных вспышек и джерков (вздрагиваний) в различных сочетаниях и разделена периодами покоя (а, 1 на рис. 2, 3). Чередование циклов “активность-покой” создает декасекундные, околоминутные и многоминутные колебания этой активности [5]. У большинства животных старшей возрастной группы за короткими высокоамплитудными моторными вспышками наблюдается длительная низкоамплитудная активность (рис. 3а, 1).

После инъекции эзерина у 1-дневных крысят длительность периодов моторного возбуждения увеличивается на 48% без увеличения мощности ЭМГ (табл. 1). У отдельных животных она становится практически непрерывной с минимальными периодами покоя (рис. 2б, 1,  2д, 1). В период последействия вновь увеличивается длительность периодов покоя и паттерн МА приобретает характер периодической активности, при этом у нескольких крысят отмечалось снижение амплитуды ЭМГ. Инъекция эзерина 16-дневным животным сопровождается депрессией МА с существенным падением амплитуды ЭМГ (табл. 1, рис. 3б, 1,  3д, 1).

Блокада М-ХР метацином у 1-дневных животных провоцирует усиление, а у 16-дневных – угнетение МА. Ингибирование АХЭ не вызывает значимых изменений паттерна МА, но несколько снижает амплитуду ЭМГ. У 16-дневных животных продолжается депрессия МА (рис. 2в, 1, 2е, 1; рис. 3в, 1, 3е, 1). Как в случае применения одного эзерина, так и в условиях премедикации метацином паттерн и интегральные показатели МА не возвращаются к исходному уровню. Показатели МА представлены в табл. 2, 3.

Сравнительный анализ полученных нами данных показал, что ингибирование АХЭ эзерином и последующая активация холинореактивных структур сопровождаются сходными нарушениями синусового ритма сердца, как у 1-дневных, так и у 16‑дневных животных. Подобные нарушения сердечного ритма были описаны нами ранее у 4-дневных крысят после воздействия малых доз ингибитора холинэстераз фосфакола [12]. Блокада М-ХР у крысят обоих возрастов предотвращает возникновение выраженных нарушений сердечного ритма, вызванных введением ингибитора АХЭ.

Отравление эзерином вызывает патологические реакции со стороны дыхательной системы и определенные изменения в работе соматомоторной системы. Следует отметить, что несмотря на то, что величина LD₅₀ эзерина для 16-дневных крысят существенно меньше, чем для однодневных, развивающаяся на Р1 дисфункция носит более глубокий и длительный характер, чем на Р16. Исключением является соматомоторная система, в которой угнетение двигательной активности сильнее у животных старшего возраста.

Наблюдаемые нами возрастные различия могут быть связаны с целым рядом факторов, обусловленных как морфологическими, так и функциональными особенностями холинергической регуляции возбудимых структур на разных этапах развития крыс. Парасимпатическая иннервация в сердце крыс выявляется еще в эмбриональный период и полностью формируется ко второму месяцу постнатального онтогенеза [13, 14]. Известно, что в сердце крыс концентрация М-ХР резко увеличивается между 15-м и 19-м днями пренатального развития, а с момента рождения и в течение послеродовой жизни плотность М-ХР в сердце уменьшается [15]. Кроме того, в ходе онтогенеза в миокарде изменяется качественный состав М-ХР. В опытах in vitro показано, что степень воздействия стимуляции М3-рецепторов на электрическую активность желудочкового миокарда максимальна у однодневных крысят и в 3 раза превышает реакцию миокарда взрослых животных. Авторы исследования пришли к выводу, что вклад М3-рецепторов в реализацию холинергических воздействий на миокард снижается в постнатальном онтогенезе и связывают это с уменьшением экспрессии гена М3-рецепторов по сравнению с геном М2-рецепторов [16].

Проведенное нами ранее исследование показателей гемодинамики у 3-30–дневных крыс в условиях блокады М- или Н-холинорецепторов с последующим введением животным эзерина показало, что на ранних стадиях постнатального онтогенеза блокада М-ХР вызывает отрицательный, а Н-ХР, наоборот, положительный инотропный эффект. Наиболее значимые перестройки холинергических влияний на сократительную способность миокарда происходят в период между 10‑ми и 16-ми сут. Начиная с 30-х сут введение холинолитиков не вызывает значимых изменений величины сердечного выброса. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у крыс существует гетерохрония вовлеченности различных холинореактивных структур, участвующих в регуляции сократительной способности миокарда. Часть сдвигов показателей гемодинамики, наблюдаемых в ответ на изменение уровня холинергической активации, обусловлена гетерохронией становления реципрокных взаимодействий между М- и Н‑холинорецепторами [8].

Таким образом, показано, что у крысят в первые 16 сут постнатального онтогенеза изменение уровня активации холинореактивных структур, связанное с блокадой М-ХР и накоплением ацетилхолина вследствие ингибирования АХЭ, приводит к нарушениям функциональной активности сердечно-сосудистой, дыхательной и соматомоторной систем. Имеющиеся возрастные различия связаны со становлением дефинитивного уровня холинергической регуляции. Блокада М-ХР оказывает преимущественное влияние на функциональную активность сердечно-сосудистой системы, предотвращая возникновение выраженных нарушений сердечного ритма, вызванных введением ингибитора холинэстеразы. Премедикация холинолитиком не влияет на параметры МА, разнонаправлен-но изменяющейся у 1- и 16-дневных крысят после введения им эзерина.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в рамках государственного задания ФАНО России (“Механизмы формирования физиологических функций в фило- и онтогенезе и влияние на них эндогенных и экзогенных факторов”, тема № АААА-А18-118012290373-7).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов изучения.