Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2019, T. 55, № 4, стр. 242-248

ВВЕДЕНИЕ

Антимикробные пептиды (АМП) или пептиды защиты организма-хозяина (host defense peptides) были описаны в середине прошлого века [1], и с тех пор из организмов разной степени сложности выделено и идентифицировано несколько тысяч таких веществ [2, 3]; они широко распространены в мире живого [4]. АМП не вызывают развития резистентности или вызывают его в минимальной степени, тогда как рост устойчивости патогенных микроорганизмов к традиционным антибиотикам становится все более серьезной проблемой. К такой ситуации привели продолжающееся десятилетиями скармливание сельскохозяйственным животным субтерапевтических доз антибиотиков и некорректное медицинское применение лекарственных препаратов [5].

АМП – часть системы врожденного иммунитета [6, 7], они присутствуют у всех эукариот [8]) и прокариот [9]. Они выступают как медиаторы конкуренции между микроорганизмами [4, 10, 11], в том числе, и между родственными таксонами. Некоторые АМП, например дефензины, считаются переносчиками информации между системами врожденного и приобретенного иммунитета [12]. АМП активны против вирусов, бактерий, грибов, простейших [1, 13] и даже против архей, в принципе менее восприимчивых к антимикробным агентам [14]. АМП способны накапливаться в области распространения инфекции, они избирательно цитотоксичны для микроорганизмов и минимально – для макроорганизмов [2].

Некоторые авторы оценивают количество уже известных семейств и субсемейств АМП трехзначными числами [15]. К АМП функционально близки белковые молекулы, обладающие антимикробным действием, например, растительные белки липидного переноса (plant lipid transfer proteins, PLTPs) или лактоферрины.

Растущее количество обзоров, посвященных антимикробным пептидам, привело нас к решению написать “обзор обзоров”, сделав акцент на механизмах взаимодействия АМП с микроорганизмами.

СТРУКТУРА И БИОСИНТЕЗ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ

Конформации молекул АМП. Среди АМП различают молекулы, характеризующиеся четырьмя видами вторичной структуры [16]:

α-спирали, например человеческий кателицидин LL-37;

β-листы, или β-складчатые структуры, например, полифемузин;

смешанные структуры, например, человеческий β-дефензин-2;

ни α-, ни β-структуры, например, индолицидин.

Белки-предшественники АМП покидают продуцирующую их клетку по тем же путям, что и другие белки, выходящие из цитоплазмы в межклеточную жидкость. В жидкостях организм молекулы АМП могут циркулировать в иных конформациях и лишь при взаимодействии с мембраной бактериальной клетки принимать формы α-спирали или β‑складчатой структуры [16]. Самая распространенная из конформаций АМП – α-спираль. Она снижает селективность связывания АМП с клеточными мембранами [16]. В α-спиралях широко представлены обладающие высокой спиральной тенденцией аминокислотные остатки: аланин (A), лейцин (L), аргинин (R) и лизин (K) [16]. Строение молекулы дефензинов получило название “мотив стабилизированной цистеином α-спирали/β-складчатой структуры” (cysteine-stabilized α-helix/β-sheet motif, Csαβ) [4].

Биосинтез АМП. Бóльшая часть АМП (а у высших животных – все) образуется путем классического рибосомального синтеза: ДНК → РНК → рибосома → синтез белка → ограниченный протеолиз (ферментами) → пептиды (в том числе, АМП). Молекула пептида может претерпевать разнообразные посттрансляционные изменения: гликозилирование, амидирование, галогенирование, фосфорилирование, включение D-аминокислот, в том числе непротеиногенных, и циклизацию [16].

Бактерии синтезируют АМП как в рибосомах, так и вне их [17, 18]. Микроорганизмы сохранили способность, которую более сложные организмы утратили, – в своей цитоплазме (вне рибосом) с помощью набора специальных ферментов соединять аминокислоты (числом до нескольких десятков) в линейную цепочку. Иногда такая цепочка также ферментативно замыкается в цикл. Самый известный пример: циклоспорин A – циклический пептид из 11 аминокислотных остатков, синтезируемый в цитоплазме микроорганизмов циклоспоринсинтетазой [19]. В состав нерибосомальных пептидов, как правило, входят наряду с протеиногенными L-аминокислотами и D-формы аминокислот, аминомасляные и другие кислоты. Некоторые из таких нерибосомальных пептидов обладают антимикробными свойствами: грамицидин S, липопептиды [16] и упомянутые выше циклоспорины.

ПРОДУЦЕНТЫ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ

Спектр организмов, продуцирующих АМП, простирается от почвенных бактерий, грибов и растений до млекопитающих, включая человека [1, 8, 20]. Бактерии продуцируют АМП путем как рибосомального, так и нерибосомального (ферментативного) синтеза [18] и с их помощью взаимодействуют с другими микроорганизмами, в том числе обитающими внутри организма-хозяина [11].

Растения. АМП растений обнаружены в начале 1990-х годов [21]. Они являются компонентами защитного барьера растений и присутствуют в корнях, семенах, цветах, стеблях и листьях [22]. Молекулы АМП растений имеют положительный заряд и богаты цистеином; образуемые дисульфидные мостики стабилизируют структуру пептида [21, 22]. Некоторые из растительных АМП действуют и на бактерии, патогенные для человека [22].

Беспозвоночные. Морские беспозвоночные [4] и особенно ракообразные [4, 7] продуцируют множество АМП. Антимикробные пептиды обнаружены у моллюсков [4], присутствуют они и в яде скорпиона [23]. Антимикробные пептиды пиррокорицин, дрозоцин и апидецин продуцируются клопами, мухами и пчелами соответственно. АМП, выделяемые личинками насекомых, исследованы и доведены до практического применения [24, 25].

Низшие позвоночные. АМП морских костных рыб нацелены на липополисахариды оболочки грамотрицательных бактерий [26]. Один из самых богатых источников АМП – кожа амфибий, особенно бурых лягушек рода Rana [13]. Например, Rana esculenta продуцируют эскулентины (esculentin-1a и -1b) – одни из самых длинных (46 аминокислотных остатков) АМП в природе [13]. Кожа жаб рода Bombina продуцирует катионные АМП, названные бомбининами H [27]. Некоторые члены этого семейства сосуществуют в секретах кожи как изомеры, в которые одна D-аминокислота (аллоизолейцин или лейцин) включается в ходе посттрансляционной модификации. Такая замена придает пептиду устойчивость к расщеплению протеазами и препятствует потере биологической активности [27].

Млекопитающие синтезируют в своем организме АМП, в том числе противогрибковые [8]. Человеческие дефензины инактивируют бактериальные токсины и обладают противовирусным действием [28]. В ротовой полости человека обнаружено более 40 антимикробных пептидов и белков [3]. В частности, из белка человеческой слюны BPIFA2 получен действенный антимикробный пептид GL13K [27].

ДЕФЕНЗИНЫ – НАИБОЛЕЕ ИЗУЧЕННЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ

Впервые обнаруженные в 1985 г. в нейтрофилах человека, дефензины (от англ. defense: защита) – наиболее изученные антимикробные пептиды, имеющиеся у представителей всех типов эукариот [4, 29]. Все три типа дефензинов (α-, β- и θ-) проявляют антимикробную активность, благодаря способности взаимодействовать с оболочками микроорганизмов [30]. Молекула дефензина содержит не менее шести остатков цистеина (C), соединенных попарно дисульфидными мостиками (S–S). При этом относительно длинные пептидные цепочки α- и β-дефензинов (у человека это соответственно 29 и 41 аминокислотный остаток) имеют линейную форму; α- и β-дефензины млекопитающих существенно отличаются по структуре от дефензинов насекомых.

Циклические молекулы θ-дефензинов состоят из 18 аминокислотных остатков и обладают бȯльшим структурным сходством. В протеомах организмов они содержатся в виде двух (иногда идентичных, иногда различных) нонамотивов. Формирование θ-дефензина происходит, предположительно, в таком порядке: (1) рибосомальный синтез белка(ов)-предшественника(ов); (2) ограниченный протеолиз с высвобождением двух “пригодных” нонапептидов; (3) соединение двух нонапептидов по принципу “голова–хвост” в единый линейный октадекапептид; (4) замыкание трех пар SН-групп, и наконец (5) замыкание свободных концов молекулы с образованием уникальной эллиптической структуры. Первичная структура дефензинов линейных (α- и β-) и циклических (θ-) представлена на рис. 1. Циклическая структура θ‑дефензинов придает им особые свойства [31]: они не вызывают гемолиза и практически нецитотоксичны in vitro [32]. Все три дисульфидных мостика в молекуле θ‑дефензина расположены в одной плоскости, благодаря чему молекула способна изгибаться вокруг своей короткой оси и менее гибка относительно длинной оси. Искусственно произведенный разрыв циклической молекулы θ-дефензина-1 (RTD-1) макаки-резус между глицином в 1-м положении (G1) и аргинином в 18-м (R18) приводит к образованию так называемого открытого θ-дефензина, антимикробная активность которого втрое ниже, чем его замкнутого аналога [33, 34] (рис. 2).

Рис. 1.

Типовые структурные формулы дефензинов: A – α-дефензин человека-2, HNP2; B – β-дефензин человека-2, BD2; C – θ-дефензины макаки-1 и -2, RTD-1 и RTD-2 (см. [16, 35]). В формуле θ-дефензина скобками обозначены обычные пептидные связи между остатками глицина и аргинина, образующими полюса трехосного эллипсоида. Прямые линии – дисульфидные мостики (–S–S–), соединяющие попарно остатки цистеина.

Рис. 2.

θ-Дефензин-1 (RTD-1) макаки-резус в его естественной циклической (А) и искусственной “открытой” (Б) формах.

θ-Дефензины – единственные известные рибосомально синтезируемые циклические пептиды высших позвоночных. Считается, что θ-дефензины есть у приматов только у макак Macaca, орангутанов Pongo и гиббонов Hylobates [4], но у горилл Gorilla, шимпанзе Pan и человека Homo способность синтезировать белок – потенциальный предшественник θ-дефензинов – утрачена. Анализ генома человека показал, что в результате изменчивости в кодирующем гене появился стоп-кодон, и из необходимых 18 аминокислотных остатков в пептидную цепочку встраиваются только 12 (RCICGRGICRLL), чего для построения циклической молекулы θ-дефензина недостаточно [35]. Соответственно ген θ-дефензина рассматривается как псевдоген [4]. Авторы полагают, что приматы Старого и Нового Света занимают разные экологические ниши и сталкиваются с “разными микробными вызовами” [35]. Между тем, входящие в состав семейства гоминид (Hominidae) роды горилл (Gorilla) и орангутанов (Pongo) разошлись в своем развитии лишь 15.2 млн. лет назад [36], что представляется нам слишком коротким сроком для беспричинной утраты столь важного и явно полезного (защитного) механизма; мы полагаем, что мотив для синтеза θ-дефензина в протеоме человека обнаружен будет.

Синтезированы искусственные гомологи θ-дефензинов – ретроциклины; применение в клинике доказало их высокую антимикробную активность и способность инактивировать бактериальные токсины [37].

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ С КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНОЙ

АМП взаимодействуют с клеточной стенкой бактерий в дискретных фокусах [9]. Лизис клеточной стенки считается главным среди механизмов действия АМП на микроорганизмы: пептиды формируют поры в стенке и частично разрушают ее [6, 17, 18, 38–40]. Организованный дефект мембраны может иметь одну из трех форм: “тороид” (thoroid), “ковер” (carpet) и “бочарная клепка” (barrel stave). Через образовавшиеся поры происходит утечка ионов и, возможно, некоторых метаболитов; за этим следуют деполяризация, нарушение клеточного дыхания и гибель клетки [22]. Перед тем, как образовать поры в клеточной мембране, молекулы АМП должны связаться с ней одним из двух способов: (а) взаимодействием с находящимися на ее поверхности специфическими рецепторами или (б) взаимодействием с собственно мембраной за счет электростатического и других видов слабого взаимодействия.

Связывание с рецепторами на клеточной мембране. Так действуют бактериоцины класса IIa [41], вырабатываемые бактериями для подавления бактерий-конкурентов. Другой пример: микроцины, проникающие в цитоплазму грамотрицательных энтеробактерий после связывания с мембранными железо-сидерофорными рецепторами [4].

Электростатическое притяжение АМП к клеточной мембране. Катионные АМП часто амфифильны, что облегчает связывание их с соответствующими – гидрофобными и гидрофильными – участками мембраны бактерий [3, 4]. Катионные остатки аминокислот молекул АМР электростатически притягиваются к отрицательно заряженным молекулам оболочки, например, анионным группам фосфолипидов, липополисахаридов или тейхоевых кислот [4, 9].

Молекулы АМП накапливаются на поверхности клеточной мембраны, образуют липид-пептидные комплексы и создают ионные каналы, а молекулы AMP выполняют роль внутренней выстилки таких каналов [38, 41, 42]. Например, с анионными областями на поверхности бактерий связываются человеческий кателицидин и бактериоцины, продуцируемые одними бактериями против других [9]. За этим следуют утечка ионов и метаболитов, деполяризация, нарушение клеточного дыхания и гибель клетки [22, 43].

ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ

Нелитические механизмы описаны пока лишь для немногих АМП [6]. Например, на белковые мишени внутри бактериальной клетки нацелены антимикробные пептиды пиррокорицин, дрозоцин, апидецин и Bac7 [44]. Противогрибковое действие АМП также требует проникновения пептидов в клетку [8]. Главными мишенями для АМП внутри бактериальной клетки служат рибосомы [45]. Контактируя с нуклеиновыми кислотами, АМП изменяют синтез белков – структурных и ферментов [3, 6, 20, 31].

Действуя в рамках макроорганизма, АМП стимулируют апоптоз [20, 38], продукцию хемокинов, ангиогенез и заживление ран [20]. Некоторые АМП инактивируют токсины, вырабатываемые патогенными микроорганизмами [46].

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К АНТИМИКРОБНЫМ ПЕПТИДАМ

АМП могут действовать и там, где к обычным антибиотикам уже развилась резистентность. В отношении развития резистентности у микроорганизмов АМП обладают преимуществами перед конвенциональными антибиотиками: повышение устойчивости к АМП затрудняется тем, что для каждого такого пептида мишень в клетке может быть не одна [44].

Тем не менее, и АМП не гарантированы от развития резистентности микроорганизмов к ним. Патогены выработали стратегии преодоления эффектов АМП, такие как модификация поверхности клеточной оболочки, экспрессия эффлюксных насосов и секреция протеаз [20, 40].

У бактерий есть механизмы, способные противостоять действию катионных АМП, например, лизинилирование фосфатидилглицерина для образования катионного лизилфосфатидилглицерина и аланилирования липотейхоевой кислоты [9]. Для защиты от АМП в клетке-мишени экспрессируются соответствующие гены и синтезируются детерминанты специфической резистентности (specific resistance determinants). Подробности механизмов, с помощью которых микроорганизмы защищаются от пептидов-антибиотиков (как собственных, так и экзогенных), представлены в обзоре Вольфа и Машера [10].

Клиническое применение АМП может вызывать развитие резистентности к ним, а вместе с этим и к собственным антимикробным пептидам защиты организма-хозяина человека, однако, искусственное внесение небольших модификаций в молекулы АМП позволяет преодолеть это препятствие [3].

ВЫВОДЫ

Пептиды-антибиотики продуцируются организмами, стоящими на всех ступенях биологической эволюции – от прокариот до человека. Они действуют на патологические микроорганизмы всех типов – археи, бактерии, грибы и простейшие. Синтез пептидных антибиотиков осуществляется как рибосомальным, так и внерисобомальным путем. Контакт пептидов-антибиотиков с оболочкой микроорганизма осуществляется путем связывания со специфическими рецепторами или силами электростатического взаимодействия. В результате в мембране образуются поры, сквозь которые в клетку проникают сами пептиды-антибиотики или другие вещества из состава внеклеточной жидкости. Мишенью пептидов-антибиотиков могут быть и органоиды клетки, например рибосомы. Преимущество пептидов-антибиотиков перед традиционными антибиотиками – в меньшей способности стимулировать развитие резистентности. Некоторые пептиды-антибиотики доведены до практического применения.

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ

Преимущества АМП перед традиционными антибиотиками следующие:

В применении пробиотиков (бактерий-продуцентов АМП) накоплен огромный опыт [11], начало которому положил еще И.И. Мечников. Естественные антимикробные пептиды потенциально имеют широкий спектр антимикробной активности (действуют на вирусы, бактерии, грибы и простейших); механизмы их действия разнообразны [7]. Все острее ощущается потребность в новых антибиотиках, особенно против патогенов с множественной лекарственной устойчивостью, например Pseudomonas aeruginosa. АМП действуют и на резистивные формы патогенных микроорганизмов [39], при этом сами либо не вызывают резистентности, либо вызывают низкую [47]. АМП могут действовать и там, где к обычным антибиотикам уже развилась резистентность. Например, такими свойствами обладает низин, продуцируемый бактерией Lactococcus lactis и присутствующий в коровьем молоке [48]. Некоторые АМП амфибий обладают большей антимикробной активностью, чем АМП млекопитающих. Эти и другие АМП низших позвоночных – кандидаты для разработки новых противомикробных препаратов [13].

Рост числа аллергических заболеваний и резистентности патогенных микроорганизмов к антибиотикам требует отказа от практики скармливания сельскохозяйственным животным традиционных антибиотиков. АМП могли бы стать частью решения этой проблемы [5, 18, 49]. Низкая эффективная концентрация в отношении грибов (0.1–10 мкМ) и безопасность для млекопитающих и птиц дают некоторым АМП (например, растительным дефензинам) преимущества перед химическими веществами в деле борьбы с грибковыми инфекциями сельскохозяйственных культур [21]. Принципиально возможно применение АМП в сочетании с уменьшенными дозами обычных антибиотиков, и такие стратегии уже разрабатываются [14].

За последние десятилетия создано немного новых классов антибиотиков [50, 51]. Разработка АМП могла бы ускорить прогресс в этой области. Варьируя гликозилирование, амидирование, галогенирование, фосфорилирование и включение D‑аминокислот, фармакологи создают новые формы АМП [16].

Выявленные ограничения к применению АМП немногочисленны [47]: АМП подвержены расщеплению протеазами и имеют короткий период полураспада. Лишь немногие АМП допущены к клиническому применению из-за недостаточной изученности вопроса об их токсичности. Высоко оцениваются перспективы клинического применения таких АМП, как дефензины, кателицидин LL-37 [46], пептид GL13K [3] применяются АМП и при туберкулезе [52].