Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2019, T. 55, № 5, стр. 363-366

Используемые в настоящее время в медицине препараты гонадотропинов имеют ряд существенных недостатков, которые приводят к развитию побочных эффектов и ограничивают применение гонадотропинов в клинике как стимуляторов стероидогенеза, сперматогенеза и фолликулогенеза. Среди таких недостатков – гиперактивация рецепторов лютеинизирующего гормона (ЛГ), вызывающая их даун-регуляцию и способствующая развитию резистентности к гонадотропинам, необходимость исключительно парентерального введения гонадотропинов, гетерогенность препаратов хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), широко используемого в репродуктологии гомолога ЛГ, при его выделении из мочи беременных женщин, а также значительные отличия структуры и активности рекомбинантных форм ЛГ и ХГЧ от их природных форм [1]. Ключевой причиной развития резистентности к гонадотропинам является активация сразу нескольких внутриклеточных сигнальных каскадов. Так ЛГ и ХГЧ, наряду с аденилатциклазной системой, включающей гетеротримерный G_s-белок, ферменты аденилатциклазу (АЦ) и протеинкиназу А, и контролирующей стероидогенез в клетках Лейдига, активируют аррестиновые пути, через посредство которых осуществляется эндоцитоз рецептора ЛГ и его последующая деградация в протеосомах [1, 2]. На протяжении последних лет ведется разработка низкомолекулярных агонистов рецептора ЛГ, наибольший интерес среди которых представляют тиенопиримидиновые производные (ТП). Показано, что низкомолекулярные агонисты взаимодействуют с аллостерическим сайтом рецептора ЛГ, расположенным в его трансмембранном канале, и активируют целевой сигнальный каскад, в то время как значительные по размеру гонадотропины связываются с ортостерическим сайтом, расположенным во внеклеточном домене рецептора ЛГ [3, 4].

Преимуществами ТП является не только селективность их действия по отношению к внутриклеточным эффекторам, но также отсутствие заметного влияния на чувствительность клеток-мишеней к гонадотропинам и сохранение активности при пероральном введении [5, 6]. Наряду с полными агонистами, в клинике востребованы инверсионные агонисты рецептора ЛГ, способные подавлять стимулированную гонадотропинами активность рецептора ЛГ и тем самым предотвращать стимулирующее влияние гонадотропинов на гормон-зависимые опухоли [1, 4]. Ранее нами была синтезирована и изучена серия ТП с активностью полных агонистов рецептора ЛГ, которые активировали АЦ в тестикулярных мембранах и повышали продукцию тестостерона (Т) при различных способах введения самцам крыс [1, 5, 6]. Цель настоящей работы состояла в изучении активности трех новых ТП с активностью как полных (ТП34 и ТП35), так и инверсионных (ТП33) агонистов рецептора ЛГ, а также в оценке их эффекта на продукцию Т при внутрибрюшинном и пероральном способах введения самцам крыс.

Синтез N-(3-(5-амино-6-(трет-бутилкарбамоил)-2-(метилсульфанил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил)фенил)-2-метилоксазол-4-карбоксамид (ТП33), 5-амино-N-(трет-бутил)-4-(3-(2-(2,4-диоксо-1,2,3,4- тетрагидропиримидин-5-ил)ацетамидо)фенил)-2-(метилсульфанил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбо-ксамид (ТП34) и 5-амино-N-(трет-бутил)-2-(метилсульфанил)-4-(3-(2-этоксиникотинамидо)фенил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид (ТП35) проводили с помощью реакции ацилирования 5-амино-4-(3-аминофенил)-N-(трет-бутил)-2-(метилсульфанил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамида. Целевые продукты характеризовали с помощью масс-спектрометрического анализа, для чего использовали масс-спектрометр Bruker micrOTOF (ESI): TP33 – HRMS m/z [M+H]⁺ вычислено для ${{{\text{C}}}_{{{\text{23}}}}}{{{\text{H}}}_{{{\text{25}}}}}{{{\text{N}}}_{{\text{6}}}}{{{\text{O}}}_{{\text{3}}}}{\text{S}}_{2}^{ + }$ 497.1424, найдено 497.1433; TP34 – HRMS m/z [M + H]⁺ вычислено для ${{{\text{C}}}_{{{\text{24}}}}}{{{\text{H}}}_{{{\text{25}}}}}{{{\text{N}}}_{{\text{7}}}}{\text{Na}}{{{\text{O}}}_{{\text{4}}}}{\text{S}}_{2}^{ + }$ 562.1302, найдено 562.1278; TP35 – HRMS m/z [M+H]⁺ вычислено для ${{{\text{C}}}_{{{\text{26}}}}}{{{\text{H}}}_{{{\text{29}}}}}{{{\text{N}}}_{{\text{6}}}}{{{\text{O}}}_{{\text{3}}}}{\text{S}}_{2}^{ + }$ 537.1737, найдено 537.1710.

В экспериментах использовали трехмесячных самцов крыс Wistar, все процедуры выполняли в соответствии с требованиями Этического комитета ИЭФБ РАН, European Communities Council Directive 1986 (86/609/EEC) и “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”. При изучении активности ТП в условиях in vitro осуществляли выделение тестикулярных мембран из семенников крыс и оценивали в них активность АЦ, как описано ранее [5]. Для этого крыс декапитировали под наркозом, забирали у них ткани семенников, измельчали их и гомогенизировали при +4°C в 40 мМ Tris-HCl-буфере (pH 7.5), содержащем 5 мМ MgCl₂, 10% сахарозу и ингибиторы протеаз. Гомогенат центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин, супернатант центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин, осадок ресуспендировали в буфере без сахарозы и повторно центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин. Полученные мембраны ресуспендировали в том же буфере и использовали для определения АЦ.

Ферментативную реакцию проводили в смеси, которая содержала 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 5 мМ MgCl₂, 0.1 мМ цАМФ, 1 мМ АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2 мг/мл креатинфосфокиназы (Sigma, США), 37 кБк [α-³²P]АТФ и 50–100 мкг мембранного белка. Инкубацию проводили в течение 12 мин при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0.5 M HCl. Образовавшийся в ходе реакции [³²P]цАМФ отделяли от меченого субстрата, используя адсорбционную хроматографию на нейтральной окиси алюминия. Радиоактивность измеряли на счетчике LKB 1209/1215 RackBeta (LKB, Швеция). Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка. ТП растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и преинкубировали с тестикулярными мембранами (4°С, 5 мин), после чего добавляли инкубационную смесь. Контрольные пробы преинкубировали с раствором ДМСО без ТП. В экспериментах использовали креатинфосфат, креатинфосфокиназу из мышц кролика, АТФ, цАМФ и другие реактивы фирмы “Sigma” (США), а также [α-³²P]-АТФ (“ОАО Всерегиональное объединение Изотоп”, Россия).

В экспериментах in vivo ТП вводили однократно в ДМСО, в/б или перорально, в дозах 25 и 50 мг/кг соответственно, ХГЧ – однократно, п/к, в дозе 50 МЕ/крысу. Контрольным крысам вместо препаратов вводили раствор ДМСО. Для оценки базального уровня Т кровь забирали в течение 6 ч (в 10.00, 12.00, 14.00 и 16.00). Для оценки уровня Т, стимулированного ТП и(или) ХГЧ (“Московский эндокринологический завод”, Россия), уровень Т измеряли до введения препаратов (10.00) и через 1, 3 и 5 ч после их введения (препараты вводили в 11.00). Для оценки влияния ТП на стероидогенный эффект ХГЧ низкомолекулярный агонист вводили в/б в дозе 25 мг/кг в 10.40, и спустя 20 мин (11.00) п/к вводили ХГЧ в дозе 50 МЕ/крысу. Уровень Т в крови крыс, взятой из хвостовой вены, определяли с помощью набора “Тестостерон-ИФА” (Алкор-Био, Россия).

Статистический анализ данных проводили с помощью программы “Microsoft Office Excel 2007” (надстройки “AtteStat 12.5” и “Daniel’s XL Toolbox 6.52”). Данные представляли как среднее значение ± SD. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения двух выборок с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента, для сравнения трех и более групп – дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони. Данные, не удовлетворяющие критериям нормального распределения, обрабатывали с применением U-критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали отличия при уровне значимости p < 0.05.

Соединения ТП34 и ТП35 в диапазоне концентраций 10^–6–10^–3 M повышали базальную активность АЦ в тестикулярных мембранах крыс, причем в концентрации 10^–4 М их стимулирующий эффект составил 164 и 122% соответственно (табл. 1). Рассчитанные на основе кривых “доза-эффект” значения EC₅₀ для стимулирующих АЦ эффектов соединений ТП34 и ТП35 составили 1.61 и 2.87 мкМ. Соединение ТП33 не влияло на базальную активность АЦ. После преинкубации мембран с 10^–5 М ТП34 и ТП35 стимулирующий эффект 10^‒10 М ХГЧ усиливался, что указывает на частичную аддитивность эффектов ХГЧ и ТП, в то время как при обработке мембран ХГЧ в более высокой концентрации 10^–8 М стимулирующий эффект гонадотропина сохранялся, но его усиления отмечено не было (табл. 1). Усиление эффекта ХГЧ в присутствии ТП34 и ТП35 было обусловлено различиями локализации в рецепторе ЛГ ортостерического сайта, с которым связывается значительная по размеру молекула ХГЧ, и аллостерического сайта, с которым связываются низкомолекулярные лиганды.

Изучение влияния ТП33 на стимулирующий АЦ эффект ХГЧ показало, что в мембранах, преинкубированных с 10^–5 М ТП33, стимуляция АЦ 10^–10 и 10^–8 М ХГЧ снижалась на 76 и 87% в сравнении с таковой в контрольных мембранах. Эти данные свидетельствуют о присущей ТП33 активности инверсионного агониста, который, связываясь с аллостерическим сайтом рецептора ЛГ, препятствует стабилизации его активированного состояния, вызываемого связыванием гонадотропина с эктодоменом рецептора.

При внутрибрюшинном введении самцам крыс ТП34 и ТП35 уровень Т повышался с одинаковой эффективностью, на что указывают значения AUC_{10.00–16.00}, представляющие собой интегрированную площадь под кривой зависимости “концентрация Т (нМ)–время(ч)”, которые составили 178 ± 35 и 164 ± 46 усл. ед. соответственно против 86 ± 29 усл. ед. в контроле (p < 0.05) (табл. 2). При пероральном введении стероидогенный эффект ТП34 был выше, чем у ТП35, что иллюстрируют более высокие значения AUC_{10.00–16.00} у крыс, обработанных ТП34 (157 ± 21 и 124 ± 19 усл. ед., p < < 0.05), (табл. 2). Стероидогенный эффект ХГЧ при его введении крысам, которым предварительно внутрибрюшинно вводили ТП34 и ТП35, сохранялся (данные не представлены). При изучении соединения ТП33 было показано, что при обоих способах введения самцам крыс оно не влияло на уровень Т. В то же время, предварительная обработка крыс с помощью ТП33 приводила к значительному снижению стимулирующего эффекта ХГЧ на продукцию Т, о чем свидетельствует достоверное снижение значений AUC_{10.00–16.00} (416 ± 75 и 267 ± 37 усл. ед., p < 0.05) (табл. 2). Отмечено не только ослабление стероидогенного эффекта ХГЧ, но и изменение формы кривой. Так, через 5 ч ингибирующий эффект TP33 на ХГЧ-индуцированную продукцию Т ослаблялся, что, как мы полагаем, обусловлено диссоциацией TP33 из комплекса с рецептором и выведением этого ТП из организма. В этой связи необходимо отметить, что время полувыведения ТП, как правило, существенно меньше, чем таковое для ХГЧ и других гонадотропинов [7].

Таким образом, нами разработаны новые низкомолекулярные агонисты рецептора ЛГ, производные тиенопиримидинов, которые активны как in vitro, так и in vivo, усиливая стероидогенез в клетках Лейдига и в значительной степени повышая уровень Т в крови самцов крыс. Разработан инверсионный агонист рецептора ЛГ, ингибирующий стимулирующий эффект ХГЧ на аденилатциклазную систему в тестикулярных мембранах и подавляющий стероидогенный эффект ХГЧ при их совместном введении крысам. Разработанные соединения могут стать прототипами лекарственных препаратов, предназначенных для регуляции зависимых от ЛГ репродуктивных функций. Поскольку рецепторы ЛГ и их аллостерические сайты высоко консервативны в эволюции позвоночных животных, то разработанные низкомолекулярные лиганды рецептора ЛГ могут оказывать стимулирующее влияние на стероидогенез, сперматогенез и фолликулогенез у крупного рогатого скота, лошадей, свиней и птиц, что открывает широкие перспективы для их применения в животноводстве и в селекции домашних животных.