Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 1, стр. 3-12

ВВЕДЕНИЕ

Каротиноиды – пигменты автотрофного, в основном, растительного происхождения, которые в тканях консументов (последующих звеньях пищевой цепи) подвергаются накоплению и метаболической трансформации в соответствии с видовой спецификой трофического звена. В растительной клетке каротиноиды играют важную роль в процессе фотосинтеза, фотозащиты, выполняют антиоксидантную и другие функции. У животных функции этих соединений являются предметом интенсивного изучения, в настоящее время известны антиоксидантная, гепатопротекторная, мембранно-стабилизирующая и другие свойства каротиноидов [1, 2]. На сегодняшний день установлено строение более 750 природных соединений каротиноидного ряда, однако их метаболическая трансформация, происходящая в каждом трофическом звене, остается все еще малоизученной [2]. При этом открываются широкие возможности как в поиске и обнаружении новых соединений, так и выяснения функциональной значимости этих БАВ у изучаемых видов.

Массовый черноморский вид Cardium (=Ceras-toderma) lamarki Cerastoderma glaucum (Poiret, 1789) (в ранних работах Cardium edule Linnaeus, 1758, Cerastoderma lamarcki Reeve, 1843) широко распространен в акватории Черного моря, его обитание на илистом грунте побережья Севастополя были отмечены еще С.А. Зерновым в 1910 г. [3, 4]. Моллюск средиземноморского происхождения считается коренным представителем черноморской малакофауны [5]. Он относится к эвригалинному виду, однако избегает солености ниже 8‰, часто встречается в местах с кратковременным сероводородным заражением, при этом отсутствует в местах с пониженным содержанием кислорода и постоянным сероводородным заражением [4]. По типу питания этот моллюск относится к типичному облигатному сестенофагу, однако при увеличении пищевой конкуренции он может питаться из водной толщи [6]. Исследования последнего столетия показали, что под действием абиотических и биотических факторов моллюски рода Cerastoderma имеют значительную межвидовую изменчивость, которая позволяет им адаптироваться к обновляющимся экологическим условиям существования [7]. Исследования каротиноидного состава Cerastoderma glaucum очень скудны: в 70–80-х годах прошлого столетия эта информация ограничивалась исследованиями этого вида, обитающего на Британских островах [8, 9]. Были высказаны предположения о наличии в составе этого вида сложноэфирных фракций каротиноидов, β-каротина, лютеина и комплекса ксантофиллов неустановленного строения [8, 9]. Среди последних в гепатопанкреасе моллюска предположительно был идентифицирован гетероксантин [9]. Факторы, влияющие на метаболизм каротиноидов, например, места обитания и сезонность [10], не исследованы. В 2017 г. нами был впервые изучен состав каротиноидов моллюска C. glaucum, обитающего на Севастопольском побережье [11]. В этой работе были обнаружены отличия в составе каротиноидов этого моллюска от описанного ранее в [8–10].

Одним из наиболее успешных среди двустворчатых моллюсков-фильтраторов по адаптации к изменяющимся внешним условиям обитания является вселенец в Черное море Anadara kagoshimensis (Tokunaga, 1906). У этого моллюска выражена устойчивость к гипоксии, разного рода биотическим и абиотическим загрязнениям, пищевой депривации, что связано с эффективной работой антиоксидантной системы и гемоглобина [12–14]. По типу и способу питания он близок к C. glaucum, так как тоже обитает в разрыхленном грунте и фильтрует образующуюся взвесь, для передвижения также использует свою ногу, которая у этого моллюска не только обеспечивает ему активный образ жизни, но и имеет ряд физиологических и метаболических особенностей [13]. Исследования состава каротиноидов A. kagoshimensis, обитающего в Черном море, происходили на протяжении ряда лет [16, 17]. Были обнаружены некоторые отличия как в качественном составе каротиноидов, так и в их соотношении, по сравнению с видовым аналогом из Тихоокеанского региона, это же было отмечено и для каротиноидного состава черноморской мидии Mytilus galloprovincialis [16]. В связи с этим для углубления понимания функциональной роли каротиноидов в физиологических процессах моллюсков важно отметить необходимость изучения как каротиноидного состава массовых видов моллюсков, так и изучения факторов, влияющих на этот метаболизм.

Целью данной работы явилось изучение влияния сезонности на накопление и метаболизм каротиноидов в тканях моллюска-фильтратора C. glaucum, обитающего в Черном море, и сопоставление этих данных с данными для сходного по типу питания и условиям обитания вида A. kagoshimensis, исследованного нами ранее.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования являлись двустворчатые моллюски-фильтраторы Cerastoderma glaucum (Bruguière, 1789), обитающие в Казачьей бухте г. Севастополя. Пробы отбирали ежемесячно на протяжении 2018 г. [18], кроме августа месяца. Причинами этого были высокая температура и влажность воздуха, приведшая к деструкции пигментов [18]. Количество экземпляров, отобранных в течение месяца (одна точка отбора), составило от 5 до 15.

Лабораторная обработка тканей моллюсков для определения суммарного содержания каротиноидов (ССК) и дальнейшего проведения тонкослойной хроматографии (ТСХ), подготовка и хранение проб проводились с соблюдением мер предосторожности, рекомендуемых при работе с пигментами [18].

Спектрофотометрические методы. Мягкие ткани гомогенизировали, содержание суммарных каротиноидов измеряли, как описано в [19]. ССК определяли спектрофотометрическим методом. Спектры общего экстракта каротиноидов и индивидуальных фракций записывали на спектрофотометре СФ-2000.

Суммарный экстракт каротиноидов для дальнейшего разделения и идентификации методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии (МС) запаивали в ампулы в атмосфере азота и транспортировали в Институт химии ДВО РАН при низкой температуре.

Хроматографические методы и масс-спектрометрия. Разделение пигментов проводили методами ТСХ и ВЭЖХ. При проведении ТСХ использовали пластины фирмы “Sorbfil” (Россия, Краснодар). Ацетоновые экстракты мягких тканей моллюска упаривали в вакууме, растворяли в хлороформе и разделяли на пластинках с силикагелем в системе: ацетон:гексан (2:8). Разделение пигментов проводилось при температуре воздуха 18–20°С.

ВЭЖХ проводили на хроматографе Shimadzu LC-20 с детектором со встроенной фотодиодной матрицей SPD-M20A, на колонке ZorbaxSil 250*4.6 мм, скорость потока элюента 1 мл/мин, в градиенте гексан-ацетон (0–20 мин гексан:ацетон 8:2, с 20 по 25 мин градиент до 80% ацетона в системе, 25–35 мин – гексан:ацетон 2:8). Фракции основных каротиноидов собирали (примерно 10–15 разделений), объединяли, упаривали досуха на роторном испарителе при 40°C, перерастворяли в метаноле и записывали масс-спектр с помощью масс-спектрометрического детектора низкого разрешения Shimadzu LCMS-2010EV, источник APCI, режим регистрации положительных ионов. Концентрации индивидуальных каротиноидов определяли с помощью ВЭЖХ, результаты концентрации 0.3% и ниже отмечены как “следы”. Оценка количественного содержания каротиноидов была основана на результатах ВЭЖХ с учетом коэффициента ${\text{A}}_{{{\text{1cm}}}}^{{1\% }}$ 2500 при 450 нм. Соотношение максимумов III/II, % в спектрах поглощения рассчитывали, как описано в [20].

Омыление каротиноидов проводили, перерастворяя их в 5%-ном растворе KOH в метаноле.

Статистический анализ. Статистическая обработка и графическое оформление полученной информации проводились при помощи пакета “Grapher-7”. Результаты расчета суммарных каротиноидов представлены как среднее арифметическое ($\bar {x}$) и стандартная ошибка средней ($S\bar {x}$).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Каротиноиды C. glaucum. Внешний вид моллюска свидетельствует о хорошо развитой ноге, окрашенной в яркий (как правило) оранжевый цвет (рис. 1), вероятней всего, связанный с повышенным содержанием каротиноидов. С учетом массово-размерных характеристик внутренних органов, уровень ССК в ноге уступает лишь гепатопанкреасу, что характерно для большинства двустворчатых моллюсков (рис. 2). Отметим, что в жабрах содержится только относительно небольшая доля ССК. На рис. 3 показана годовая динамика суммарных каротиноидов C. glaucum. Максимальное накопление каротиноидов происходит весной и небольшое колебание в сторону увеличения отмечено в августе–сентябре. Изменение содержания ССК в тканях зависит от общего ССК в организме в целом и также подвержено сезонным и другим колебаниям. Увеличение ССК в мягких тканях моллюска совпадало с периодом созревания гонад и нерестом. Гонады окрашены в ярко желтый-оранжевый цвет и их хорошо видно на рис. 1.

Рис. 1.

Фото моллюска C. glaucum. Сентябрь 2018.

Рис. 2.

Весовые характеристики C. glaucum-1; Распределение суммарного содержания каротиноидов по тканям C. glaucum-2.

Рис. 3.

Годовая динамика суммарного содержания каротиноидов C. glaucum.

Идентификация каротиноидов была проведена с помощью спектров поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях, хроматографических и масс-спектрометрических данных:

β-каротин – время удерживания (Rt) 2.72 мин, максимумы поглощения в элюенте (λ_max) 425, 449, 479, отношение %III/II 41, масса иона [M + H] + 537;

Эфир гетероксантина – Rt 2.88 мин (30.5 мин после омыления), λ_max 426, 447, 477, %III/II 42;

Эфир мактраксантина – Rt 2.95 мин (33.0 мин после омыления), λ_max 418, 441, 470, %III/II 88, [M + H] + 637 (после омыления);

Эфир фукоксантина – Rt 3.73 мин, λ_max 448, (468), %III/II 0;

Эфир мактраксантина – Rt 3.89 мин (32.8 мин после омыления), λ_max 417, 441, 470, %III/II 90, [M + H] + 637 (после омыления);

Лютеин – Rt 12.98 мин, λ_max 424, 446, 475, %III/II 66, [M + H] + 569;

Зеаксантин – Rt 13.82 мин, λ_max 451, 478, %III/II 16, [M + H] + 569;

Диатоксантин – Rt 14.70 мин, λ_max 449, 476, %III/II 62;

Аллоксантин – Rt 15.60 мин, λ_max 424 448, 477, %III/II 68;

Диадиноксантин – Rt 18.34 мин, λ_max 424, 446, 475, %III/II 66, [M + H] + 583;

Фукоксантин – Rt 25.00 мин, λ_max 449, (469), %III/II 0, %III/II 66, [M + H] + 659, [M+Na]+ 681, выделенная фракция неразделима со стандартом, выделенным из Laminaria sp.;

Виолаксантин – Rt 26.31 мин, λ_max 418, 441, 471, %III/II 92, [M + H] + 601;

Неоксантин – Rt 29.10 мин, λ_max 415, 438, 461, %III/II 80, [M + H] + 601;

Гетероксантин – Rt 30.45 мин, λ_max 425, 449, 478, %III/II 58, [M + H] + 601;

Мактраксантин – Rt 32.88 мин, λ_max 418, 442, 471, %III/II 91, [M + H] + 637;

Всего обнаружено и идентифицировано 11 свободных и 4 фракции этерифицированных каротиноидов. Ежемесячная динамика содержания индивидуальных каротиноидов представлена в табл. 1.

В течение годового цикла в тканях моллюска постоянно присутствовали β-каротин, мактраксантин, гетероксантин и эфиры двух последних каротиноидов, они составляли около 50–60% от суммы всех пигментов. Ряд каротиноидов у C. glaucum присутствовал не постоянно, а только в отдельные месяцы – это зеаксантин, лютеин, диадиноксантин, диатоксантин, аллоксантин и фукоксантин, включая его эфир, которые составляют в сумме около 10–20%. С учетом неидентифицированных каротиноидов (6–22%) реальная суммарная доля минорных фракций существенно выше. В течение года можно выделить период увеличения их суммарного количества (с марта по июль), затем небольшое снижение и изменение в качественном составе (июль–сентябрь), после чего в октябре–ноябре снова рост их количества (табл. 1).

Каротиноиды A. kagoshimensis. На основании проведенных ранее исследований по изучению влияния фактора сезонности на изменение состава каротиноидов в индивидуальных тканях моллюска-фильтратора A. kagoshimensis, обитающего на Севастопольском побережье Черного моря [17], мы представляем динамику каротиноидов для организма моллюска в целом (табл. 2). Дополнением к этой таблице могут быть данные по гонадам, полученные в 2015 г. в период нереста моллюска (июль–август) [21]. В этот период отсутствовал пектенол А, на фоне увеличения содержания пектенолона, а уровень суммарных каротиноидов снижался до 3.9 ± 0.5 мг ⋅ 100^–1 [21].

ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика суммарных каротиноидов. Исследования ССК у C. glaucum показало увеличение этого показателя в весенний и осенний периоды (рис. 3), что скорее всего вызвано сменой состава фитопланктона и бентосных водорослей [22]. После зимы, с появлением все более теплых и солнечных дней, происходит максимальное развитие как микроводорослей, так и зоопланктона, что обеспечивает разнообразную кормовую базу для бентосных моллюсков-фильтраторов [22]. У C. glaucum с апреля–мая начинают созревать гонады [23], что также влияет на увеличение ССК, вплоть до нереста. В нерестовый период происходит активное участие каротиноидов в различных процессах: от репродуктивных до защитных, восстановительных клеточных механизмов, поэтому летом, в разгар нереста, мы наблюдаем некоторое снижение уровня ССК в организме моллюска. В сентябре наступает смена температурных режимов, происходящие апвелинги приводят к обогащению вод питательными веществами и, как следствие, наступают смена состава фитопланктона и его бурное развитие [22]. По всей вероятности, с этим связан второй максимум в годовой динамике суммарных каротиноидов C. glaucum. Его невысокие показатели скорее всего вызваны нивелирующим влиянием нереста этих моллюсков в данный период.

Несколько иначе выглядит зависимость содержания ССК у анадары от зимнего, весеннего и летнего сезона [16]. Как было отмечено ранее, для этого вида характерно увеличение содержания каротиноидов в феврале и в мае–июне, что по времени совпадает с развитием диатомовых микроводорослей, их двустадийной сукцессией, о чем сообщалось ранее [16]. В период нереста также для этого вида моллюсков было отмечено некоторое снижение общего уровня ССК.

Динамика качественного состава каротиноидов. Состав каротиноидов моллюска C. glaucum представлен 11-ю соединениями и 4-мя их эфирами. Структурные формулы приведены на рис. 4. Большинство каротиноидов C. glaucum относятся к растительным пигментам, которые может получить моллюск с пищей, профильтровывая фитопланктон. Так, например, β-каротин характерен для многих видов микроводорослей, относящихся к отделам и классам Cyanophyta, Prochlorophyta, Chlorophyceae, Prasinophyceae, Euglenophyta, Eustigmatophyta, Raphidophyceae, что делает его доступным в спектре питания круглый год, а колебания в концентрации могут быть вызваны вариантами численности видов микроводорослей, синтезирующих этот каротиноид и употребляемых моллюском. Диатоксантин, диадиноксантин, фукоксантин, являются характерными пигментами для диатомовых и многих динофитовых видов микроводорослей, встречаются также у представителей Prymnesiophyceae, Chysophyceae и Raphidophyceae [24]. Лютеин и зеаксантин являются характерными для зеленых микроводорослей, однако источником зеаксантина может быть также и зоопланктон. Известно, что гетероксантин был открыт в 70-х годах прошлого столетия у желто-зеленых жгутиковых микроводорослей [25], которые синтезируют также диадиноксантин и диатоксантин. Однако высокая концентрация гетероксантина в течение всего года, несмотря на смену состава фитопланктона во время сезонных сукцессий, наводит на мысль о существовании дополнительного механизма метаболических преобразований в тканях C. glaucum. Ранее такой механизм преобразований был предложен для мидии M. edulis норвежскими учеными, которые считали, что предшественником может выступать диадиноксантин, у которого 5,6-эпокси-группа превращается в дополнительные две гидрокси-группы и образуется гетероксантин [26] (рис. 4). Исходя из структурного состава кароти-ноидов, неоксантин мог бы выступать предшественником образования диадиноксантина, в случае отсутствия или нехватки его в пищевом спектре моллюска.

Рис. 4.

Структурные формулы каротиноидов C. glaucum.

В составе фитопланктона можно встретить микроводоросли, синтезирующие и аллоксантин (Cryptophyta) [24, 27]. Их численность невелика, и это может быть причиной непостоянной концентрации этого ксантофилла в тканях моллюска. Сравнение годовой динамики каротиноидов у C. glaucum (табл. 1) и известных сезонных изменений фитопланктона и бентосных микроводорослей для Севастопольского побережья [22] позволяет предположить прямое влияние сезонных сукцессий на динамику большинства каротиноидов моллюска C. glaucum.

Мактраксантин – единственный каротиноид, не синтезируемый микроводорослями, его впервые обнаружили в составе моллюсков Mactra chi-nensis в 1983 году [28]. Вероятным предшественником мактраксантина может быть широко распространенный у фотосинтезирующих организмов виолоксантин. Однако наличие такой трансформации у моллюсков пока не подтверждено.

Отличия в составе каротиноидов C. glaucum из черноморского региона и других ареалов обитания этого вида [8, 9] могут быть объяснены многими причинами. Климатические отличия регионов, гидрохимические отличия среды обитания влияют не только на пищевые цепи питания моллюсков. Под действием ряда внешних факторов моллюски могут приобретать изменения в наборе ферментов, что может привести к различной способности к усвоению тех или иных каротиноидов. Данная область является практически неисследованной. Существенной причиной отличия в литературных данных по составу каротиноидов для одного и того же вида моллюска мог стать прогресс в методах разделения и идентификации каротиноидов в 80–90-х годах прошлого столетия [19]. Совершенствование хроматографических и масс-спектрометрических методов послужило причиной для многих повторных исследований в области биохимии каротиноидов, что позволило открыть не только новые виды этих соединений, но и уточнить многие до конца неизученные механизмы их трансформации [1, 15].

Другой вид сестенофага – моллюск-вселенец в Черное море, A. kagoshimensis, несмотря на схожий образ жизни и спектр питания, накапливал всего 6 свободных (без учета изомеризации пектенолона) и 4 этерифицированных каротиноидов [20] (табл. 2). На протяжении трех сезонов наблюдалось лишь небольшое колебание фракций β-каротина и пектенола А. Изменение содержания последнего в летние месяцы может быть вызвано общей нагрузкой на организм в период нереста [20]. Представленные результаты показывают динамику фракций каротиноидов в организме анадары в целом, чего не было показано в предыдущих опубликованных работах [15, 16, 20]. Это дает возможность для объективного сравнения состава каротиноидов A. kagoshimensis как с видовыми аналогами из других регионов Мирового океана, так и с другими видами. В отличие от C. glaucum, для A. kagoshimensis характерны более устойчивый качественный состав каротиноидов и менее выраженные сезонные изменения количества каротиноидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Динамика суммарных каротиноидов в течение года у Cerastoderma glaucum связана, в первую очередь, с сезонными изменениями в спектре питания и репродуктивным циклом моллюска.

Качественный состав каротиноидов C. glaucum представлен 11-ю каротиноидами и 4-мя эфирами, большая их часть имеет растительное происхождение и накапливается без дальнейшего метаболического преобразования. Трансформация происходит с образованием мактраксантина и его эфиров, а также эфиров фукоксантина и гетероксантина. Самую высокую концентрацию в тканях моллюска имеет гетероксантин, причем на протяжении всего годового цикла, поэтому возможно наличие дополнительного преобразования для получения этого каротиноида: неоксантин → диадиноксантин → гетероксантин. Среди постоянных каротиноидов, присутствующих независимо от годового цикла: β-каротин, гетероксантин и мактраксантин, а также эфиры последних двух каротиноидов, эта группа пигментов в течение года составляла 50–65% от суммы всех каротиноидов. Накопление всех остальных каротиноидов сильно зависит от спектра питания, который в свою очередь подвержен сезонным изменениям. Так, отмечено, что в более холодные периоды года в тканях C. glaucum накапливаются фукоксантин и его эфиры, характерные для диатомовых и ряда динофитовых видов микроводорослей, а в более теплые месяцы происходит снижение их концентрации (вплоть до исчезновения) и появление диадиноксантина, лютеина и зеаксантина, характерных более для теплолюбивых зеленых и желто-зеленых жгутиковых микроводорослей.

Несмотря на схожесть в образе жизни и спектре питания, другой моллюск-фильтратор, A. kagoshimensis не обладал столь очевидной и сильной зависимостью от сезонных изменений. В его тканях существуют следующие процессы трансформации растительных каротиноидов: диатоксантин → пектенол А → пектенолон (цис-; транс-), а сезонным колебаниям подвержены только содержания β-каротина и пектенола А.

Из сравнения результатов исследований обоих видов моллюсков можно отметить, что сезонным колебаниям каротиноидов в большей степени подвергаются моллюски с наиболее широким спектром накопления различных растительных каротиноидов.