Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 1, стр. 24-31

ВВЕДЕНИЕ

Сахарный диабет 2-го типа (СД2) и тесно ассоциированный с ним метаболический синдром (МС) в настоящее время являются наиболее часто встречающимися эндокринопатиями, распространение которых в мире приобретает характер пандемии. В условиях СД2 и МС развиваются заболевания сердечно-сосудистой, выделительной и нервной систем. В последние годы значительное внимание уделяется ассоциированным с этими метаболическими расстройствами дисфункциям репродуктивной системы. У пациентов-мужчин, страдающих СД2 и МС, развиваются признаки вторичного гипогонадизма, снижается уровень тестостерона (Т), нарушается сперматогенез, что, в конечном итоге, приводит к бесплодию [1–4]. Эти репродуктивные дисфункции связывают как с системными метаболическими нарушениями, типичными для СД2 и МС, так и с негативным влиянием гипергликемии, гиперинсулинемии и дислипидемии на различные звенья гипоталамо-гипофизарно-гонадной (ГГГ) оси, а также на процессы дифференцировки и созревания сперматозоидов [5–7]. Несмотря на прогресс, достигнутый в изучении дисфункций репродуктивной системы у мужчин с СД2 и МС, молекулярные механизмы и факторы, ответственные за их возникновение и развитие, изучены недостаточно. При этом как клинические, так и экспериментальные данные о степени, выраженности и механизмах нарушений стероидогенеза и сперматогенеза при СД2 и МС противоречивы, что во многом обусловлено различиями в этиопатогенезе, продолжительности и степени тяжести этих метаболических расстройств, наличием сопутствующих им заболеваний [1, 2, 8].

Важную роль в контроле стероидогенеза и сперматогенеза играют лептин и его сигнальная система, причем свои регуляторные эффекты лептин осуществляет на всех уровнях функционирования ГГГ оси [9–12]. Достаточно подробно изучено влияние лептина на гипоталамические нейроны, экспрессирующие лептиновые рецепторы, через которые лептин стимулирует синтез и секрецию гонадолиберина, рилизинг-фактора лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов [13, 14]. Сравнительно недавно было показано, что лептин может непосредственно влиять на стероидогенные клетки Лейдига и сперматогенные клетки, в которых локализованы основные компоненты лептиновой сигнальной системы. В семенниках лептин стимулирует синтез Т и способствует созреванию сперматозоидов, повышая мужскую фертильность [9–12]. Часть лептина синтезируется в семенниках de novo, в то время как другая поступает из кровотока [9, 15, 16]. Предполагают, что лептиновый сигналинг в семенниках может нарушаться как в условиях дефицита лептина при голодании, так и при гиперлептинемии, характерной для ожирения, МС и СД2, когда из-за избытка поступления лептина в семенники чувствительность к нему тестикулярных клеток может снижаться [10, 11]. Однако функциональная активность лептиновой системы в семенниках при различных по тяжести формах СД2 остается не исследованной.

В связи с вышесказанным, целью исследования было изучить уровни лептина и функциональное состояние лептиновой системы в семенниках самцов крыс с различным по степени тяжести СД2, вызванным высокожировой диетой и обработкой низкими дозами стрептозотоцина (СТЗ), и оценить, как активность этой системы соотносится с уровнем Т в крови и показателями спермограммы у контрольных и диабетических крыс.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Для экспериментов использовали самцов крыс линии Wistar, которые в начале эксперимента имели возраст 2.5 мес и массу тела 180–200 г. Животных содержали в стандартных условиях (соотношение день/ночь составило 12 ч/12 ч, температура 24 ± 4°C), со свободным доступом к стандартному корму и воде. Эксперименты выполняли в строгом соответствии с требованиями Комитета по биоэтике ИЭФБ РАН, European Communities Council Directive 1986 (86/609/EEC) и “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”.

Для моделирования среднетяжелой формы СД2 самцы крыс Wistar (n = 32) сначала в течение двух месяцев получали диету с высоким содержанием насыщенных жиров. Один килограмм высокожировой смеси содержал 524 г свиного сала, 417 г творога, 50 г свиной печени, 5.3 г метионина, 1.85 г пекарских дрожжей, 1.85 г поваренной соли [17]. Затем крыс обрабатывали СТЗ (“Sigma”, США) в дозе 30 мг/кг, после чего продолжали содержать на высокожировой диете еще в течение месяца. Контрольная группа (К, n = 12) в те же сроки получала стандартный корм и вместо СТЗ была обработана его растворителем, 0.1 М цитратным буфером (pH 4.5). На протяжении всего эксперимента у крыс контролировали массу тела и уровень постпрандиальной глюкозы, который определяли с помощью тест-полосок “One Touch Ultra” (США) и глюкометра “Life Scan Johnson & Johnson” (Дания) через 2 ч после еды в образцах крови, полученной из хвостовой вены. В крови с помощью набора “Multi Test HbA1c System” (“Polymer Technology Systems, Inc.”, США) также измеряли уровень гликированного гемоглобина.

За неделю до окончания эксперимента у крыс с повышенной массой тела и уровнями постпрандиальной глюкозы (>7 мМ) и гликированного гемоглобина (HbA1c > 5.5%) (n = 17) с помощью глюкозотолерантного теста (ГТТ) оценивали чувствительность к глюкозе и инсулину. Для этого крысам после 12-ти часового голодания в/б вводили глюкозу (2 г/кг), после чего в течение 120 мин измеряли концентрацию глюкозы в крови. Перед введением глюкозы и через 120 мин после глюкозной нагрузки измеряли уровни инсулина и лептина в крови, которые оценивали с помощью наборов “Rat Insulin ELISA kit” (“Mercodia AB”, Швеция) и “ELISA kit for Leptin” (“Cloud-Clone Corp.”, США). На основании показателей ГТТ и индекса инсулиновой резистентности (ИР), рассчитанного как произведение концентраций глюкозы и инсулина, формировали две группы крыс – с сильно выраженным (группа Д-СВ, n = 6) и умеренно выраженным (Д-УВ, n = 6) СД2, которые существенно различались по уровням гипергликемии, гиперинсулинемии и гиперлептинемии, а также по значениям площади под кривыми “концентрация глюкозы(мМ)–время(мин)” (AUC_0–120) в ГТТ. По окончании эксперимента самцов крыс декапитировали под наркозом, оценивали массу жира и семенников, забирали образцы крови и ткани семенников для дальнейших исследований. Концентрацию Т в крови определяли, используя набор “Тестостерон-ИФА” (“Алкор-Био”, Россия), концентрацию свободных жирных кислот с помощью набора “NEFA FS” (“DiaSys”, Германия).

Содержание лептина и лептиновых рецепторов в семенниках оценивали с помощью наборов “ELISA kit for Leptin, Rat” и “ELISA kit for Leptin Receptor, Rat” (“Cloud-Clone Corp.”, США). Для этого образцы тканей семенников гомогенизировали в соотношении 1:10 в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА, 0.25 M сахарозы, 0.5% Triton X‑100, 0.5% дезоксихолата натрия, 15 мМ NaF, 10 мМ глицерофосфата натрия, 10 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ Na₃VO₄, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 0.02% азида натрия и ингибиторы протеаз (“Sigma-Aldrich”, США), как описано ранее [18]. Полученный гомогенат центрифугировали (10 000 g, 5 мин), и в супернатанте измеряли содержание лептина и его рецептора в соответствии с инструкциями фирмы “Cloud-Clone Corp.” (США), которое выражали в пг/мг сырой ткани.

Идентификацию фосфорилированных форм Akt-киназы и STAT3-белка проводили с помощью вестерн-блоттинга, как описано ранее для гипоталамуса [18]. Ткани семенников гомогенизировали (1:20) в 20 мМ Tris-HCl-буфере (pH 6.8), который содержал 25 мМ ЭДТА, 0.1% Triton X-100, коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз. Полученный гомогенат центрифугировали (100 g, 10 мин), к супернатанту в соотношении 3:1 добавляли 200 мМ Tris-HCl-буфер (pH 6.8), содержащий 400 мМ β-меркаптоэтанола, 4% додецилсульфат натрия, 40% глицерин и 0.01% бромфеноловый синий. Пробы нагревали до 95°С (3 мин), разделяли в 10% поли-акриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0.45 мкм, “Bio-Rad”, США). Мембраны в течение 1 ч обрабатывали 5%-ным раствором сухого обезжиренного молока в TBS–Tween-20-буфере (pH 7.6) и в течение ночи (+4°С) инкубировали с первичными антителами Anti-Akt, Anti-Phospho(Ser⁴⁷³)-Akt, Anti-STAT3, Anti-Phospho-STAT3 (Tyr⁷⁰⁵) (разведение 1:1000), Anti-GAPDH (1:2000) (“Cell Signaling Technology”, США). В качестве вторичных антител использовали goat anti-rabbit IgG HRP (1:5000) (“Cell Signaling Technology”, США). В качестве стандарта использовали иммуноокрашивание глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). Визуализацию осуществляли с помощью набора для иммунохемилюминесценции “Novex ECL Reagents” (“Invitrogen”, США).

Показатели спермограммы оценивали при выводе самцов крыс из эксперимента. Для этого из каудальной части эпидидимиса извлекали 5 мг эпидидимальных сперматозоидов, помещали их в 195 мкл среды фертилизации “Quinn’s AdvantageTM Medium With HEPES” (“In Vitro Fertilization Inc., Cooper Surgical Company”, США) и инкубировали в ней в течение 30 мин при 37°С. Для оценки морфологии сперматозоидов исследовали мазок на предметном стекле с последующей окраской азуром и эозином с использованием набора реагентов “Спермо-Дифф-200” (ООО “Фирма Синтакон”, Россия). Осуществляли подсчет морфологически дефектных форм, включающих сперматозоиды с извитым хвостом или дефектами головки, в расчете на 100 сперматозоидов в каждом препарате. Фотографии препаратов получали с использованием микроскопа “Axio Lab.A1 MAT” (“Carl Zeiss”, Германия) со встроенной телевизионной камерой и программы Axio-Vision 4.8 при увеличении ×1000.

Статистический анализ данных проводили с помощью программы “Microsoft Office Excel 2007”. Данные представлены, как M ± SD, для данных по вестер-блоттингу, как M ± SEM. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения выборок с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента. Достоверными считали отличия при уровне значимости p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У крыс как с сильно выраженным, так и с умеренно выраженным СД2 отмечали повышение массы тела, жировой ткани и ее доли в общей массе тела, повышение в крови уровней гликированного гемоглобина, постпрандиальной глюкозы и свободных жирных кислот, причем различия с контролем были в большей степени выражены у животных группы Д-СВ (табл. 1). Масса яичек в группах Д-СВ и Д-УВ не отличалось от таковой в контроле. Уровень глюкозы натощак был статистически значимо повышен только у крыс группы Д-СВ, в то время как уровни инсулина натощак в обеих группах не отличались от их значений в контроле. В ГТТ было показано, что у крыс группы Д-СВ была нарушена толерантность к глюкозе, о чем свидетельствовало повышение (на 89%) значения AUC_0–120 для кривых зависимости концентрации глюкозы (мМ) от времени (мин) в сравнении с контролем (1995 ± 204 против 1057 ± 88 отн. ед., p < 0.05). У крыс группы Д-УВ значение AUC_0–120 (1487 ± 139, p < 0.05 с контролем) превышало этот показатель в контроле на 41% и было ниже такового в группе Д-СВ на 25%, что свидетельствует о менее выраженном нарушении толерантности к глюкозе в группе Д-УВ в сравнении с группой Д-СВ (рис. 1). Через 120 мин после нагрузки уровень инсулина в группе Д-СВ повышался на 61% (p < 0.05 с контролем), что в сочетании с повышенным уровнем глюкозы в той же временной точке указывает на развитие ИР. В группе Д-УВ через 120 мин после глюкозной нагрузки также отмечали достоверно повышенный уровень глюкозы и тенденцию к повышению уровня инсулина. При этом индекс ИР, рассчитанный как произведение концентраций глюкозы и инсулина, в обеих группах статистически значимо превышал таковой в группе К – в группе Д-СВ он был выше в среднем в три раза, в группе Д-УВ – в два раза. Крысы группы Д-СВ характеризовались отчетливо выраженной гиперлептинемией, причем уровень лептина превосходил таковой как в контроле, так и в группе Д-УВ. Через 120 мин после нагрузки уровень лептина в крови повышался во всех группах, но в группах Д‑СВ и Д-УВ концентрация этого адипокина была на 101 и 42% выше, чем в контроле.

Рис. 1.

Изменение концентрации глюкозы в крови самцов крыс с различным по степени тяжести СД2 при проведении глюкозотолерантного теста.

Принятые на рисунках 1, 2 и 3 сокращения: К – контрольная группа; Д-УВ – крысы с умеренно выраженным сахарным диабетом 2-го типа; Д-СВ – крысы с сильно выраженным сахарным диабетом 2-го типа.

Значения представлены как M ± SD, n = 6.

Изучение андрогенного статуса показало, что у самцов крыс группы Д-СВ уровень Т был снижен в сравнении с контролем на 40%, в то время как в группе Д-УВ это снижение составило 22% и различия с группой К не были статистически значимыми (табл. 1). Исследование спермограмм обнаружило значительное снижение числа сперматозоидов в обеих диабетических группах (табл. 2). В то же время доля морфологически дефектных форм сперматозоидов была достоверно выше в группе Д-СВ, но в группе Д-УВ статистически значимо не отличалась от контроля. Доля сперматозоидов с поступательным прямолинейным движением во всех группах была сопоставимой (табл. 2). Однако с учетом снижения общего числа сперматозоидов число морфологически нормальных форм сперматозоидов и их форм с поступательным прямолинейным движением у крыс группы Д-СВ была существенно ниже, чем в контроле. Таким образом, у крыс со среднетяжелой формой СД2 на фоне метаболических и гормональных нарушений имелись андрогенный дефицит и нарушения сперматогенеза, которые были ассоциированы с отчетливо выраженной гиперлептинемией. У крыс группы Д-УВ, которые имели повышенные уровни лептина только в условиях нагрузки глюкозой, отмечали тенденцию к нарушению стероидогенеза и сперматогенеза.

Основываясь на данных о возможной роли лептиновой сигнальной системы в семенниках в регуляции стероидогенеза и сперматогенеза, были изучены уровни лептина, лептинового рецептора и активность (по степени фосфорилирования) основных эффекторных звеньев лептиновой системы – транскрипционного фактора STAT3-белка и серин/треониновой Akt-киназы в семенниках контрольных и диабетических крыс. С помощью метода ИФА было показано, что интратестикулярный уровень лептина у крыс группы Д-СВ был выше, чем в контроле, в то время как содержание лептиновых рецепторов, напротив, снижалось (рис. 2). В группе Д-УВ отмечали тенденцию к повышению уровня лептина и снижению уровня его рецепторов, но различия с группой К не были статистически значимыми. В группе Д-СВ снижалось соотношение фосфорилированных форм STAT3 по остатку Tyr⁷⁰⁵ и Akt-киназы по остатку Ser⁴⁷³ к нефосфорилированным формам этих белков, в то время как в группе Д-УВ различий с контролем выявлено не было, хотя и отмечалась тенденция к снижению соотношения фосфо(Ser⁴⁷³)Akt/общая Akt (рис. 3). Таким образом, в семенниках крыс с сильно выраженным СД2, но не с умеренно выраженным СД2, отмечали снижение содержания лептинового рецептора и функциональной активности нижележащих звеньев лептинового сигналинга, STAT3 и Akt-киназы, что было ассоциировано с системной и внутритестикулярной гиперлептинемией и указывало на снижение чувствительности репродуктивных тканей к лептину.

Рис. 2.

Содержание лептина и лептиновых рецепторов в семенниках самцов крыс с СД2, вызванным высокожировой диетой и низкой дозой стрептозотоцина.

* – различия между группой К и группами Д-УВ и Д‑СВ статистически значимы при p < 0.05. Значения представлены как M ± SD, n = 6.

Рис. 3.

Фосфорилирование STAT3 и Akt-киназы в семенниках крыс с различным по тяжести СД2 в сравнении с контрольными животными.

а – вестерн-блоттинг с антителами к STAT3 (tSTAT3) и его Tyr⁷⁰⁵-фосфорилированной форме (pTyr⁷⁰⁵-STAT3); б – вестерн-блоттинг с антителами к Akt-киназе (tAkt) и ее Ser⁴⁷³-фосфорилированной форме (pSer⁴⁷³-Akt); в – гистограмма иммуноблотов, полученная с помощью денситометрии.

* – различия между группой К и группами Д-УВ и Д-СВ статистически значимы при p < 0.05. Значения представлены, как M ± SEM, n = 6.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Общепринято, что СД2 и МС характеризуются нарушенной толерантностью к глюкозе, ИР и дислипидемией, которые являются основными патогенетическими факторами, ведущими к развитию осложнений этих заболеваний, в том числе со стороны репродуктивной системы. В то же время в последние годы большое внимание стали уделять функциональным нарушениям, возникающим в условиях СД2 и МС в сигнальных системах, регулируемых адипокинами, в первую очередь лептином [11]. Поскольку у пациентов с СД2 и МС повышается масса абдоминального жира, вырабатывающего лептин, это приводит к развитию у них системной гиперлептинемии, что приводит к снижению чувствительности тканей к лептину.

Ранее нами на моделях СД2 и МС у грызунов было показано, что транспорт лептина в мозг, осуществляемый через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) рецептор-опосредуемым способом, в значительной степени снижается, что приводит к дефициту лептина в различных структурах мозга, в том числе в гипоталамусе, его основной мишени в ЦНС [18, 19]. Так, соотношение уровней интрагипоталамческого и циркулирующего в крови лептина у крыс и мышей с СД2, вызванным высокожировой диетой, снижалось в сравнении с контролем в 6 и 3 раза соответственно, что свидетельствует об ингибировании транспорта лептина через ГЭБ [19]. В отличие от ГЭБ, гематотестикулярный барьер является легко проницаемым для лептина, причем сам лептин влияет на целостность и функциональную активность этого барьера [20]. Таким образом, можно ожидать положительную корреляцию между уровнями лептина в кровотоке и семенниках, что и доказывают полученные нами данные, согласно которым соотношение уровней интратестикулярного и циркулирующего в крови лептина в группах К, Д-СВ и Д-УВ были сопоставимыми и составили 5.70 ± 0.38, 4.57 ± 0.32 и 5.50 ± 0.44 усл. ед.. Определенный вклад в суммарный пул интратестикулярного лептина может вносить его синтез в семенниках de novo, но доля лептина, синтезируемого в семенниках, не очень велика [9, 15, 16].

Значительное повышение уровня лептина в семенниках в условиях системной гиперлептинемии приводит к развитию лептиновой резистентности тестикулярных клеток. В пользу этого свидетельствует снижение числа лептиновых рецепторов в семенниках крыс со среднетяжелым СД2 и ослабление активности транскрипционного фактора STAT3 и Akt-киназы. Необходимо отметить, что STAT3 и Akt-киназа являются ключевыми эффекторными звеньями лептинового сигнального пути в различных типах тканей и клеток, включая клетки Лейдига и Сертоли в семенниках [15, 21, 22]. Ослабление регуляторного влияния лептина на тестикулярные клетки и, как следствие, снижение активности STAT3-зависимого пути и 3-фосфо-инозитидного  пути, включающего в качестве эффекторного компонента Akt-киназу, приводят к снижению экспрессии Akt- и STAT3-зависимых генов, в том числе ответственных за стероидогенез и созревание сперматозоидов [9, 11, 12]. Этим, по крайней мере, частично, может быть обусловлено снижение уровня Т в крови крыс группы Д-СВ, а также выявленные нами нарушения сперматогенеза, что иллюстрируется уменьшением на 34% общего числа сперматозоидов и повышением доли их морфологически дефектных форм.

Развитие лептиновой резистентности в семенниках вследствие длительного повышения уровня лептина в крови и вызываемое этим ослабление стероидогенеза, как можно полагать, не зависят от этиологии гиперлептинемии. Другими авторами показано, что хроническая гиперлептинемия у самцов крыс, обработанных в неонатальном периоде глутаматом, приводит к гипогонадизму и андрогенному дефициту. Интересно отметить, что в клетках Лейдига, изолированных из семенников крыс с глутамат-индуцированной гиперлептинемией, подавлялась как базальная, так и стимулированная гонадотропинами продукция Т и его предшественников [23]. В пользу важности лептина для нормального протекания стероидогенеза и сперматогенеза свидетельствует то, что у ob/ob(–/–)-мышей, нокаутных по гену лептина, подавлена продукция Т и отсутствуют морфологически нормальные сперматозоиды в семявыносящих канальцах [24].

Изучение умеренно выраженной формы СД2, которая характеризовалась менее выраженными метаболическими и гормональными нарушениями, в том числе отсутствием “базальной” гиперлептинемии, показало, что в этом случае нарушения стероидогенеза и сперматогенеза выражены в небольшой степени. Эти данные не только указывают на то, что снижение фертильности находится в прямой зависимости от тяжести СД2, но и свидетельствуют о возможных взаимосвязях между выраженностью гиперлептинемии и изменениями функциональной активности семенников. Нами показано, что отсутствие «базальной» и снижение стимулированной глюкозной нагрузкой системной гиперлептинемии в группе Д-УВ способствовали сохранению вблизи контрольного уровня числа лептиновых рецепторов и активности фактора STAT3 и Akt-киназы, что предотвращало ослабление лептинового сигналинга в семенниках в условиях СД2.

Таким образом, патологические изменения сперматогенеза и стероидогенеза, а следовательно, и фертильность самцов крыс в значительной степени зависят от выраженности метаболических и гормональных нарушений при СД2, а также от функционального состояния лептиновых сигнальных путей в семенниках, степень нарушений в которых положительно коррелирует с системной гиперлептинемией.