Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 2, стр. 166-168

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ Na/K-АТФазы В МИОКАРДЕ КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ ПРЕДДИАБЕТА И САХАРНОГО ДИАБЕТА

О. В. Чистякова 1*, И. Б. Сухов 1, М. Г. Добрецов 1, И. В. Кубасов 1

1 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН
Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: chiosana@yandex.ru

Поступила в редакцию 27.06.2019
После доработки 21.10.2019
Принята к публикации 30.10.2019

Полный текст (PDF)

Ключевые слова: сахарный диабет 1-го типа, левый желудочек, Na/K-АТФаза, крыса

Диабетическая кардиомиопатия (ДКМ) и связанная с ней сердечная недостаточность определены как систолическая и диастолическая дисфункции левого желудочка сердца, возникающие при сахарном диабете (СД) и развивающиеся независимо от коронарной болезни сердца и артериальной гипертонии. Исследования последних лет главным образом посвящены изучению молекулярных основ ДКМ при СД 2-го типа [1]. Данные, касающиеся ДКМ при СД 1-го типа (СД1), ограничены, а сам факт существования данного осложнения СД1 до недавнего времени оставался под вопросом [2]. Грызуны достаточно резистентны к развитию коронарной болезни сердца (если не применятся технологии генной инженерии), что делает их идеальной моделью для изучения ДКМ при различных типах СД [2]. В качестве универсального раннего механизма сердечной недостаточности различной этиологии рассматривают структурно-функциональные перестройки в Т-системе кардиомиоцитов – системе инвагинаций плазматической мембраны t-трубочек внутрь клетки. В t-канальцах с большей плотностью, чем в поверхностной сарколемме, представлена α2 изоформа Na/K-ATФазы (КФ 3.6.3.9), которая регулирует градиент Na+ на мембране t-трубочек и опосредованно важна для контроля Na+/Ca2+-обменником концентрации цитоплазматического Са2+ и сократимости кардиомиоцитов [3]. Большой диагностический интерес представляет исследование функционального состояния Т-системы на ранних сроках СД1. В этот период в качестве основных патогенных факторов прогрессии осложнений СД1 рассматривают снижение продукции инсулина, окислительный стресс, при этом еще нет острой гипергликемии и не нарушен жировой обмен [4]. Na/K-АТФаза – один из древнейших мембранных белков, участвующий в возбудимости тканей животных. Эффективность работы фермента находится в прямой зависимости от контроля тканевых функций инсулиновой системой [5] – филогенетически поздней регуляции на уровне организма, результатом становления которой в эволюции стало формирование инсулинозависимого пула клеток, к которым, наряду с адипоцитами и скелетными миоцитами, относятся кардиомиоциты. Все вышесказанное определяет интерес к функционированию Na/K-АТФазы в условиях инсулиновой недостаточности. Целью настоящей работы являлось изучение активности Na/К-АТФазы в кардиомиоцитах крыс с разной степенью диабетических нарушений, вносящих вклад в развитие ДКМ.

Исследования проводили на самцах крыс линии Вистар в возрасте 5.5–6 мес. СД1 вызывали однократной внутрибрюшинной инъекцией стрептозотоцина (СТЗ, Sigma, США) в дозе 30 (СД30-группа, n = 6) или 45 мг/кг (СД45-группа, n = 5). Контрольным животным (К-группа, n = 5) вводили буфер. Массу тела измеряли до индукции СД1 и далее каждую неделю на протяжении месяца. Уровень глюкозы измеряли натощак с помощью тест-полосок One Touch Ultra (США) и глюкометра фирмы Life Scan Johnson & Johnson (Дания). Уровень гликированного гемоглобина (HbA1C) определяли в конце эксперимента с помощью набора A1CNow+ Professional (Polymer Technology Systems, USA). Уровень инсулина измеряли методом твердофазного ИФА с помощью набора Rat Insulin ELISA (“Mercodia AB”, Швеция). Крыс выводили из эксперимента введением хлоралгидрата (400 мг/кг). АТФазную активность определяли в микросомальной фракции мембран миокарда, выделенной из левого желудочка методом дифференциального центрифугирования. При определении общей АТФазной активности пробы, содержащие 40–45 мкг белка, инкубировали в среде: 20 мМ Трис-HCl (рН 7.4), 150 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ Na2АТФ [6]. Na/K-АТФазную активность оценивали по содержанию неорганического фосфата по методу Фиске–Суббароу. Na/K-АТФазную активность рассчитывали, вычитая из общей АТФазной активности Mg2+-зависимую, определяемую в присутствии 1 мМ уабаина (специфический ингибитор α-изоформ Na/K-ATФазы). Статистическую обработку данных проводили в программе “Microsoft Office Excel 2007” (надстройка “AtteStat 12.5”) и “GraphPad Prism 7 software” (GraphPad Software, LaJolla, США). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M ± SEM). Различия считали статистически значимыми при уровне p < 0.05 по методу ANOVA с post hoc тестом Тьюки.

Как следует из таблицы, у крыс в СД30-группе на 4-й день после введения СТЗ развивалась умеренная гипергликемия. Через месяц развития диабета уровень инсулина в СД30-группе снижался в ~4 раза (p < 0.0001), а уровень HbA1C превышал показатели в К-группе в 1.5 раза (p = 0.040). У крыс в СД45-группе на 4-й день после введения СТЗ наблюдали выраженную гипергликемию (таблица 1). Через месяц развития диабета вес крыс в СД45-группе по сравнению с К-группой был ниже на 20% (p = 0.017), а уровень инсулина значительно снижался. К концу эксперимента у крыс СД45-группы уровень глюкозы был значительно ниже контрольных показателей (p < 0.0001). В конце эксперимента уровень HbA1C в СД45-группе превышал таковой в К-группе в 2.6 раза (p < 0.0001). Таким образом, через месяц после введения СТЗ состояние крыс СД30-группы можно определить как начальную стадию диабета – преддиабет, для которой характерна инсулиновая недостаточность при умеренном повышении HbA1C и минимальных изменениях показателей метаболизма глюкозы. Состояние животных СД45-группы можно охарактеризовать как острый СД1, что следует из выраженной инсулиновой недостаточности, гипергликемии и повышения уровня HbA1C.

Таблица 1.

Морфометрические и метаболические показатели контрольных и диабетических крыс (M ± SEM)

Группа Вес, г Инсулин, нг/мл,
на 30-й день после индукции
Глюкоза, ммоль/л HbA1C, %,
на 30-й день после индукции
Активность Na/К-АТФазы, Pi ммоль/г в час, на 30-й день после индукции
до индук-ции на 30-й день после индукции на 4-й день после индукции на 30-й день после индукции
К, n = 5 397 ± 15 418 ± 17 1.7 ± 0.2 5.2 ± 0.3 5.3 ± 0.3 4.5 ± 0.2 8.0 ± 0.8
СД30, n = 6 405 ± 12 401 ± 13 0.4 ± 0.1* 9.1 ± 2.3 5.6 ± 0.2 6.8 ± 0.7* 9.9 ± 1.0
СД45, n = 5 392 ± 14 337 ± 17*# 0.3 ± 0.1* 22.3 ± 1.6*# 27.1 ± 1.8*# 11.6 ± 0.4*# 3.6 ± 1.4*#

Статистически значимые отличия от К-группы (*) и от СД30-группы (#), по методу ANOVA с post hoc тестом Тьюки при р < 0.05

Подавление активности Na/K-АТФазы в миокарде крыс выявлено при остром диабете, но не на стадии преддиабета. Так, активность Na/К-АТФазы у крыс СД45-группы снижалась более чем на 50% относительно К-группы (p = 0.040) и была ниже порядка 80% относительно активности в СД30-группе (p = 0.005) (табл. 1). Наши данные по исследованию острого СД1 (СД45-группа) согласуются с предыдущими работами, где снижение активности Na/K-АТФазы в миокарде крыс более чем на 20% показано уже на первых неделях после введения СТЗ [7]. Результаты других работ позволяют предполагать, что падение активности Na/K-АТФазы при остром СД1 связано со снижением чувствительности фермента к активации внутриклеточным натрием. Найдено также, что при СД1 количество белка α1-субъединицы Na/K-АТФазы не меняется, в то время как количество α2 снижается на ~50% [8]. Поскольку α2 составляет менее 25% от общего числа α-субъединиц Na/K-АТФазы в миоцитах крысы, сокращение ее экспрессии не оказывает значительный эффект на функцию Na/K-АТФазы. Однако поскольку α2 имеет предпочтительную локализацию в t-трубочках [9], снижение ее количества (экспрессии) может существенно влиять на обмен ионов Ca2+ и таким образом регулировать сокращение кардиомиоцитов через локальные субклеточные механизмы. Исследование эффекта инсулина на субклеточную локализацию изоформ Nа/K-ATФазы в сердечной мышце здоровых и СТЗ-индуцированных диабетических крыс показало, что инсулин опосредует транслокацию α1- и α2-субъединиц фермента на плазматическую мембрану кардиомиоцитов через ФИ-3-киназный путь, причем при СД1, при снижении инсулинового сигнала, транслокация α2 оказывается более уязвимой [5]. Можно предполагать, что факторами выявленного нами снижения активности Na/K-АТФазы при недостатке инсулина и ослаблении инсулиновой сигнальной системы является нарушение транслокации представленных в кардиомиоцитах крыс α1- и α2-субъединиц фермента, а также снижение экспрессии α2-субъединицы. Вероятно, что на стадии преддиабета (СД30-группа), при выраженной инсулиновой недостаточности, но отсутствии длительной гипергликемии не дефицит инсулина, а какие-либо иные факторы, ассоциированные с СД1 (нарушения сопряжения ионной проводимости мембран), вносят вклад в регуляцию активности Na/K-АТФазы в миокарде.

Таким образом, в работе выявлено подавление активности Na/K-АТФазы в миокарде левого желудочка крыс при остром СД1, но не на стадии преддиабета, что указывает на зависимость степени повреждения транспортных процессов в мембране кардиомиоцитов от тяжести диабета. Патофизиологические основы развития ДКМ требуют дальнейшего изучения.

Список литературы

  1. Bugger H., Abel E.D. Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy. Diabetologia. 57(4): 660–671. 2014.

  2. Hölscher M.E., Bode C., Bugger H. Diabetic cardiomyopathy: does the type of diabetes matter? Int. J. Mol. Sci. 17(12): E2136. 2016.

  3. Louch W.E., Sejersted O.M., Swift F. There goes the neighborhood: Pathological alterations in T-tubule morphology and consequences for cardiomyocyte Ca2+ handling.J. Biomed. Biotechnol. 2010:503906. 2010.

  4. Dobretsov M., Romanovsky D., Stimers J.R. Early diabetic neuropathy: Triggers and mechanisms.World J. Gastroenterol. 13: 175–191. 2007.

  5. Rosta K., Tulassay E., Enzsoly A., Ronai K., Szantho A., Pandics T., Fekete A., Mandl P., Ver A. Insulin induced translocation of Na+/K+-ATPase is decreased in the heart of streptozotocin diabetic rats.Acta Pharmacol Sin. 30: 1616–1624. 2009.

  6. Bublitz M. (ed.). P-type ATPases: methods and protocols, methods in molecular biology. New York. Springer Science+Business Media. 1377. 2016.

  7. Ефимов Д.А. Механизм развития диабетической кардиомиопатии в условиях эксперимента. Международный эндокринологический журнал. 2(42): 67–69. 2012. [Yefimov D.A. Mechanism of Experimental Diabetic Cardiomyopathy Development.International Journal of Endocrinology (Mìžnarodnij endokrinologìčnij žurnal) 2(42): 67–69. 2012 (in Russ)].

  8. Lambert R., Srodulski S., Peng X., Margulies, K. B., Despa, F., Despa S. Intracellular Na+ concentration ([Na+]i) is elevated in diabetic hearts due to enhanced Na+-glucose cotransport. J. Am. Heart Assoc. 4:e002183. 2015.

  9. Despa S., Lingrel J.B., Bers D.M. Na/K-ATPase α2-subunit preferentially affects sarcoplasmic reticulum Ca release in mouse cardiacmyocytes.Cardiovasc. Res. 95: 480–486. 2012.

Дополнительные материалы отсутствуют.