Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 2, стр. 153-157

Холинергическая система является одной из основных систем, обеспечивающих нормальное развитие организма. Известно, что в ходе раннего онтогенеза происходит ее морфологическое и функциональное становление [1]. Стадия закладки внутрисердечных ганглиев вегетативной нервной системы у зародышей крысы происходит до 14-го дня эмбриогенеза, а образование простых контактов преганглионарных волокон с нейробластами в ганглиях сердца происходит у крысы уже на 14–16-й день эмбриогенеза [2]. Установлено, что гуморальные влияния на функциональные показатели сердца крыс отмечаются уже в середине эмбрионального развития [3]. Однако, несмотря на обширные морфологические исследования развития холинергической системы, ее функциональное созревание и развитие холинергических влияний на сердечную деятельность, а также последствия нарушения нормального функционирования холинергической системы в пренатальный период остаются до сих пор недостаточно изученными. Большинство имеющихся экспериментальных работ посвящено изучению отдаленных последствий применения различных холинергических средств у беременных. В представленной работе мы рассматриваем изменение вагосимпатического баланса, но, учитывая, что парасимпатическая и симпатическая нервные системы в исследуемые сроки пренатального онтогенеза морфологически еще не полностью сформированы, под этим термином мы понимаем баланс между холинергическими и адренергическими влияниями.

Целью данной работы стало исследование параметров сердечного ритма у плодов крыс на 18–20-й день гестации (Е18–Е20) в условиях изменения уровня активности холинергических структур, вызванного увеличением количества ацетилхолина (АХ) вследствие ингибирования ацетилхолинэстеразы (АХЭ) эзерином.

Исследования проводили в острых опытах на крысах линии Вистар в соответствии с положениями Российского национального комитета по биологической этике РАН. Результаты получены на 20 плодах от 8 самок; 11 плодов на Е18 и 9 на Е20. У самки, находящейся под слабым уретановым наркозом (ICN Biomedicals, Inc.) (1 г/кг) в сочетании с эпидуральной анестезией лидокаином (ОАО “Борисовский завод медицинских препаратов”) (10 мг/кг), через разрез в брюшной стенке извлекали матку и помещали ее в кювету с термостатированным (37 ± 0.2°С) физиологическим раствором. У двух плодов, извлеченных из матки с сохранением плацентарного кровообращения, одновременно регистрировали электрокардиограмму (ЭКГ). Параллельно регистрировали ЭКГ и внешнее дыхание у самки для контроля функционального состояния и его возможного влияния на активность плода. Активацию холинореактивных структур вызывали введением плодам ингибитора АХЭ эзерина (05211751 MP Biomedicals, США) в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно. Выбранная доза эзерина является летальной для 100% новорожденных крысят (по данным, полученным в нашей лаборатории В.А. Си-зоновым и Л.Е. Дмитриевой [4]) и среднесмертельной – для взрослой крысы. При выборе дозы исходили из соображения о необходимости наличия выраженной реакции сердечно-сосудистой системы плода на действие эзерина при минимальных изменениях состояния самки. Общее время наблюдения составляло 70–80 мин (30 мин – фоновая запись и 40–50 мин – после введения препарата, регистрацию физиологических показателей начинали сразу после инъекции). Ввод сигналов в компьютер осуществляли посредством АЦП E14-440 (фирма L-card, Россия) программа “Power Graph” (ООО “ДИСофт”, Россия). Период дискретизации АЦП составлял 0.5 мс, в дальнейшем прореживалось до 1 мс, эпоха анализа 10 мин. Общее время исследования для каждого плода составляло от 40 до 120 мин. Преобразование ЭКГ в периодограмму и другую цифровую обработку регистрируемых сигналов проводили в программах “PowerGraph 3.3.8” и “Origin 7.5” (OriginLab Corporation, США) с помощью разработанных в нашей лаборатории оригинальных алгоритмов с использованием пакета анализа данных этих программ. Для анализа фона выбирали 10-ти минутные фрагменты, наиболее близкие к моменту введения эзерина и не содержащие экстрасистол, а также значительных колебаний ЧСС, связанных с изменениями в сердечной или дыхательной деятельности самки. После введения эзерина анализу подвергались 10-ти минутные фрагменты, выбранные из участка записи с 6‑й по 20-ю минуту (период максимального эффекта эзерина). Спектральный анализ периодограмм ритма сердца (32  768 точек) осуществляли по алгоритму быстрого преобразования Фурье (БПФ) с использованием окна Уолша (Welch), с последующей нормализацией и усреднением спектров. Сердечную деятельность оценивали по частоте сердечных сокращений (ЧСС) и по показателям вариабельности сердечного ритма (ВСР). Анализ показателей ВСР применяется для выявления и оценки периодических составляющих колебаний сердечного ритма. Анализ выполняли по трем частотным диапазонам, выбранным на основании литературных и собственных экспериментальных данных [5]: HF 0.8–2.5 Гц, LF 0.3–0.8 Гц, VLF 0.03–0.3 Гц. Колебания HF принято считать высокочастотной составляющей, физиологически связанной с парасимпатическим влиянием на сердце. LF – низкочастотные колебания, преимущественно связанные с симпатическим фактором. Колебания VLF позволяют судить о присутствии гуморально-метаболического влияния на сердечно-сосудистую систему. Статистическая обработка данных осуществлялась стандартными методами в  программе “Origin7.5”. Использовали парный тест Стьюдента с поправками Холма. Статистически обработанные данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. Все изменения рассматривали по отношению к фоновым показателям тех же плодов до введения препарата. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

В сердечной деятельности интактных плодов крыс между 18 и 20 днями гестации происходят изменения, отражающие процесс развития сердечной системы и установления ее связей с другими функциональными системами [6]. В этот период на 34% увеличивается ЧСС, у плодов на Е20 происходит снижение выраженности медленноволновых колебаний сердечного ритма, характерных для плодов на Е18. Децелерации, являющиеся характерной реакцией сердца на движение у плодов на Е18, сменяются акселерациями на Е20. Различия в сердечной деятельности плодов на Е18 и Е20 выявил и анализ ВСР. В фоне на Е18 в спектре преобладает VLF диапазон. На Е20 отмечен рост всех показателей ВСР (табл. 1). Общая мощность спектра (To) увеличивается на 83%, мощность LF увеличивается в 2 раза, HF в 5 раз. Меньше всего меняется мощность VLF, она возрастает всего на 5.3%. Плоды на Е20 были разделены на 2 подгруппы, так как между ними наблюдались достоверные различия (рис. 1 (а, 3, 4)). Распределение животных осуществляли, опираясь на анализ ВСР. У первой группы (22% плодов) спектр смещен в сторону HF диапазона и To в несколько раз превышает этот же показатель второй группы (78% плодов), в которой преобладает диапазон VLF. Таким образом, у плодов исследованных возрастов доминирующими являются гуморально-метаболические влияния. По мере увеличения гестационного срока влияние холинергической системы увеличивается.

Рис. 1.

Усредненные спектры периодограмм сердечного ритма в фоне (а) и после введения эзерина (б) у плодов разного срока гестации: 1 – на Е18, 2 – на Е20, 3 – у 1-й подгруппы плодов на Е20, 4 – у 2-й подгруппы плодов на Е20.

По оси абсцисс – частота колебаний (Гц), под шкалой показано деление спектра на частотные диапазоны для анализа ВСР. По оси ординат – мощность спектра, нормализованная до 1 (у.е.). Ось абсцисс представлена логарифмической шкалой от 0.03 до 2.5.

Введение эзерина вызывает уменьшение ЧСС на Е18 – на 30%, а на Е20 – на 24%. Визуальный анализ периодограмм свидетельствует о появлении периодических децелераций у 18-ти и 20-ти суточных плодов в течение всего времени наблюдения, максимальная амплитуда отмечена в первые несколько минут после инъекции. Существенные изменения наблюдали в спектре ВСР. У плодов на Е18 происходит рост как To, так и всех ее составляющих. Доля HF после введения эзерина увеличивается на 60%, VLF – на 20%. Самое значительное увеличение претерпевает LF – на 175%, что приводит к увеличению почти в 2 раза коэффициента LF/HF. Несмотря на перераспределение регуляторных влияний, преобладающим все равно остается гуморально-метаболическое (рис. 1а, 1б). На Е20 реакция плодов на введение эзерина полностью меняется. Общая мощность спектра уменьшается более чем в 5 раз у плодов первой подгруппы и в полтора – у второй. Больше всего снижается вклад холинергических и симпатических воздействий. Мощность HF уменьшается на 97% у первой подгруппы и на 90% у второй, LF – на 88 и 62% соответственно. Сильно сокращается их доля в общем спектре, особенно HF – в среднем в 7 раз, что приводит к росту коэффициента LF/HF. Снижение HF также приводит к значительному уменьшению коэффициента HF/To. Мощность VLF уменьшаются на 27% у животных первой подгруппы и на 10% – у второй. Вместе с тем следует учитывать, что доля VLF-диапазона в общей мощности спектра возрастает после инъекции эзерина на 290 и 25% соответственно. Таким образом, введение эзерина плодам на 18–20-й плодный день вызывает разнонаправленные изменения в работе холинореактивных структур. У плодов на Е18 происходит рост общей мощности спектра и всех его составляющих, а на Е20, наоборот, снижение всех показателей. При этом у плодов обеих возрастных групп преобладающим остается гуморально-метаболическое влияние. Ранее было показано, что у однодневных новорожденных крысят реакция сердечно-сосудистой системы на введение эзерина сходна с наблюдаемой нами на Е20 [7].

Функциональное созревание периферического нервного аппарата миокарда заканчивается в эмбриональном периоде до возникновения центральных симпатических и парасимпатических влияний. Парасимпатическая иннервация в сердце крыс выявляется еще в эмбриональный период и полностью формируется ко второму месяцу постнатального онтогенеза, тогда как признаки функциональной зрелости симпатической иннервации выявляются к 3–4-й неделе после рождения [1, 2, 8, 9]. Из анализа полученных нами данных видно, что уже на Е18 активация холинергической системы вызывает отрицательный хронотропный эффект, что может свидетельствовать о достаточном созревании холинорецепторов и их включении в регуляцию ритма сердца плодов крыс. Увеличение мощности высокочастотных (HF) колебаний, а также их доли в общем спектре на 20-й день гестации могут быть первыми признаками начала работы парасимпатической системы. Вместе с тем значительную роль в регуляции сердечного ритма продолжают играть гуморально-метаболические факторы. В пользу этого свидетельствует усиление мощности VLF-диапазона после инъекции животным эзерина, связанное с избытком АХ, который может оказывать несинаптическое действие на холинореактивные структуры сердца [10].

Таким образом, установлено, что в последние дни пренатального развития у плодов крыс наблюдаются первые признаки созревания парасимпатической регуляции сердечного ритма, сосуществующей на Е20 с доминирующими более ранними гуморальными влияниями.