Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 2, стр. 119-126

ВВЕДЕНИЕ

Экосистемы многих внутренних рек Китая загрязнены в результате быстрой индустриализации и урбанизации [1, 2]. Например, только в Харбинском регионе приблизительно 450 миллионов тонн сточных вод ежегодно сбрасываются в реку Сунгари, что создает опасность ее водным экосистемам [3]. Присутствие тяжелых металлов (ТМ) в сточных водах промышленных предприятий г. Харбина представляет особую опасность для биоты [4]. ТМ накапливаются в воде, в донных отложениях, а также в различных тканях животных. Актуальность изучения содержания ТМ в донных отложениях и в тканях пресноводных двустворчатых моллюсков заключается в их особой токсичности и способности накапливаться.

В экотоксикологическом отношении элементы Hg, Cd, Cu и Zn являются самыми опасными для живых организмов [5, 6]. Даже сравнительно небольшие концентрации этих металлов могут повлиять на физиолого-биохимические показатели, например, на гидролиз углеводных компонентов, ферментные показатели состояния оксидативного стресса и т.д. [7, 8]. Под влиянием ТМ ослабляется иммунитет, снижаются интенсивность дыхания, активность пищеварительных ферментов и эффективность ассимиляции пищи, замедляется рост тела, увеличивается смертность, уменьшается плодовитость [7–11]. Следует заметить, что эти металлы представляет потенциальную опасность также и для здоровья человека как конечного звена трофической цепи.

Исследуемый в работе участок реки Сунгари расположен в провинции Хэйлунцзян на территории cеверо-восточной части Китая. Сунгари протекает с юга-запада на северо-восток вблизи центра города Харбин и имеет протяженность в границах города около 50 км. Сунгари – равнинная река с песчаным дном и извилистым руслом. Ширина фарватера от 400 до 800 м, глубина от 2 до 12 м. В донных отложениях реки Сунгари вблизи г. Харбин, по сравнению с другими реками и озерами Северного Китая, в особенно высоких концентрациях содержатся Pb, Zn и Ni, отмечены также высокие значения для Cd и As [6, 12].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оценка степени антропогенного загрязнения водной экосистемы реки Сунгари определялась в данной работе по концентрации типичных для этого региона тяжелых металлов в воде и донных отложениях, а также в мягких тканях местных видов пресноводных двустворчатых моллюсков из семейства Unionidae отряда Unionida (Unio douglasiae, Anodonta woodiana и Cristaria plicata). Преимущественное значение отдавали сравнительному изучению накопления ТМ в тканях моллюсков. После измерения возраста и размеров отобранные группы моллюсков подвергались вскрытию для проведения анализа содержания ТМ в их тканях.

Место отбора воды, донных отложений и двустворчатых моллюсков. Образцы воды отбирали с помощью пластиковой емкости на глубине 10–20 см ниже поверхности воды. Двустворчатых моллюсков отбирали в реке Сунгари с помощью рыболовных драг, с поверхности их раковин получали образцы донных отложений. Отбор всех образцов производили в конце сентября и начале октября 2016 г. дважды (рис. 1). Количество донных отложений и проб воды было одинаковым. Все образцы были перенесены в лабораторию в полиэтиленовых пакетах, а затем хранились замороженными при  –20°C до проведения анализа.

Пробоподготовку воды проводили следующим способом: к 10 мл образца добавляли 2 мл азотной кислоты (ЧДА, Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Technologies Co., Ltd., Китай). Пробу нагревали до 100°C и оставляли на выпаривание еще на 10 мин. Далее повышали температуру до 120°С и выпаривали до объема 10 мл.

Для анализа донных отложений образцы просушивали в духовом шкафу при температуре 60°С в течение 6 ч, затем просеивали через пластиковое сито диаметром 0.75 мм. Навеску (около 0.5 г) оставляли на ночь с добавлением 10 мл азотной кислоты. Далее раствор нагревали до 70°С в течение 8 ч, остужали, добавляли 4 мл пероксида водорода (30%) и отправляли на анализ.

Концентрации таких тяжелых металлов как Mn, Zn, Pb, Cu, Cr, и Cd в образцах воды и в донных отложениях определяли с помощью масс-спектрометра с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS, США). Результаты представлены в мг/кг.

Отбор двустворчатых моллюсков. Моллюсков собирали драгированием в среднем течении реки Сунгари вблизи г. Харбина (координаты места сбора – 45.77 Н, 126.59 E). Длина раковины моллюсков была измерена с помощью электронного цифрового штангенциркуля. Возраст был определен визуально по кольцам зимней остановки роста раковины для каждого моллюска индивидуально. Размерно-возрастные характеристики двустворчатых моллюсков из р. Сунгари, представлены в табл. 1.

Подготовка образцов тканей для анализа концентрации тяжелых металлов в мягких тканях моллюсков. Вскрытие и препарирование тканей моллюсков (гепатопанкреас и жабры) проводили сразу после доставки в лабораторию. Образцы хранились в холодильнике при –20°C. Мягкие ткани моллюсков исследовали методом “мокрого” озоления [13].

Содержание некоторых ТМ, таких как Cu, Cd, Pb и Zn, в мягких тканях моллюсков измеряли с помощью оптического эмиссионного спектрометра с индуктивно-связанной плазмой Optima 8300 (ICP-OES PerkinElmer, Optima 8300, США). Результаты представлены в мг/кг сырого веса. Фактор биоаккумуляции (BCF) для каждого из металлов был рассчитан для каждого из изучаемых видов моллюсков по формуле [14]:

где С_биота – концентрация металла в мягких тканях двустворчатого моллюска (мг/кг, при “мокром” озолении) и С_вода – концентрация металлов в воде (мкг/л). Согласно работе Варола и Санбула (2018) [14] [6], металл считается не биоаккумулятивным, если его коэффициент BCF меньше 1000. Если коэффициент принимает значения от 1000 до 5000, то металл считается биоаккумулятивным, а в случае превышения 5000 – очень биоаккумулятивным.

Статистический анализ. Все данные по химическому анализу тканей были представлены как среднее значение и стандартная ошибка (M ± SE). Проверки нормальности распределения данных проводили с помощью критерия Шапиро–Уилка (нулевая гипотеза отвергалась при p < 0.05). Для сравнения данных по тяжелым металлам в мягких тканях двустворчатых моллюсков был применен U‑критерий Манна–Уитни, различия считались статистически значимыми при р < 0.05 (использовалось программное обеспечение Statistica for Windows). Межгрупповые различия содержания тяжелых металлов у моллюсков были оценены с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием программного обеспечения OriginPro 9.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 2 представлены средние концентрации ТМ в пробах донных отложений для исследуемого участка реки Сунгари вблизи Харбина, которые имеют следующую последовательность: Zn > Pb > > Cr > Mn > Cu > Cd. Для всех измеряемых металлов концентрации в донных отложениях были выше, чем в воде.

Сходные результаты приведены в работе других авторов [15], которые указывали, что накопление ТМ в донных отложениях может оказывать неблагоприятное воздействие на состояние бентосных животных. Известно, что водные животные могут накапливать тяжелые металлы в своих мягких тканях в концентрациях, которые могут в десятки и тысячи превышать их содержание в среде обитания [7].

Биоаккумуляция ТМ в тканях двустворчатых моллюсков. Содержание ТМ в мягких тканях двустворчатых моллюсков представлено в виде гистограмм (рис. 2а, 2б).

Обобщенные данные по содержанию ТМ в двух разных тканях (жабры и гепатопанкреас) представлены в табл. 3.

В жабрах изученных видов моллюсков были выявлены следующие показатели ТМ. Наименьшая концентрация Cd в жабрах наблюдалась у U. douglasiae (см. табл. 3), в то время как для A. woodiana этот показатель был ниже. Существенные различия от U. douglasiae по содержанию Cd в жабрах были обнаружены у C. рlicata (p < 0.05). Концентрация Cu в жабрах U. douglasiae была выше, чем у других двух видов – A. woodiana и C. рlicata. По содержанию Pb в жабрах между U. douglasiae и C. рlicata не было обнаружено статистически значимых различий. Но в жабрах A. woodiana концентрация Pb была статистически значимо ниже, чем в жабрах U. douglasiae (p ≤ 0.05). Наиболее высокая концентрация, по сравнению с другими определяемыми металлами, была обнаружена в жабрах для такого металла, как Zn. Так, у A. woodiana отмечали наибольшую концентрацию (480.92 мг/кг). Наименьшее содержание Zn в жабрах было обнаружено у C. рlicata, что статистически значимо отличалось от такового у U. douglasiae (см. табл. 3). Градация по содержанию ТМ у исследуемых моллюсков была представлена в следующем виде: Zn > Cu > Cd > Pb (A. woodiana), Zn > Cd > Cu > Pb (C. plicata), Zn > Cu > > Cd > Pb (U. douglasiae).

В гепатопанкреасе изученных видов моллюсков были выявлены следующие показатели ТМ.

По Cd наименьшее значение было получено для U. douglasiae (табл. 3). У A. woodiana и C. рlicata эти показатели были статистически значимо выше, чем у U. douglasiae (U-критерий Манна–Уитни, p < < 0.05). По содержанию Cu в гепатопанкреасе A. woodiana и C. рlicata между собой не отличались, но статистически значимо отличались от U. douglasiae. Наименьшая концентрация Pb была выявлена у C. рlicata (0.86 мг/кг), что статистически значимо отличалось от таковой в гепатопанкреасе U. douglasiae и A. woodiana (p < 0.05). Из всех металлов преимущественное накопление в гепатопанкреасе, как и в жабрах, было выявлено для Zn. Наименьшие концентрации некоторых ТМ были обнаружены у U. douglasiae, поэтому этот вид был принят в качестве референтного. По накоплению Zn моллюски A. woodiana достоверно отличались от референтного вида (p < 0.05). Градация по содержанию всех изученных ТМ в гепатопанкреасе оказалась одинаковой для всех трех исследованных видов и может быть представлена в следующем виде: Zn > > Cu > Cd > Pb.

Накопление тяжелых металлов в различных органах двустворчатых моллюсков зависит от многих факторов: тип питания, сезон, размеры и возраст животного и т.д. При этом отмечают, что моллюски могут регулировать содержание в организме таких металлов, как Cu и Zn (биогенные элементы), но не Cd [7, 16].

Все средние значения концентрации металлов, за исключением Zn в гепатопанкреасе, показали статистически значимые различия между моллюсками (ANOVA, p < 0.05) (табл. 4). Наибольшие различия между видами были отмечены для Cu и Zn в жабрах, а также для Cd и Pb – в гепатопанкреасе.

В целом отмечалось, что Cu и Cd накапливались больше в гепатопанкреасе, чем в жабрах. Ранее преимущественное накопление Cu и Cd в гепатопанкреасе также отмечалось для морского двустворчатого моллюска Laternula elliptica [17]. Механизмы выведения тяжелых металлов из организма имеют различный характер у близкородственных видов. Так, например, известно, что цитоплазматические белки имеют свойство связывать избытки металлов в организме у мидий Грея Crenomytilus grayanus, а у принадлежащего этому же семейству модиолуса Modiolus kurilensis это связывание происходит на уровне мембранных структур [18].

Известно [3], что в разных органах одного и того же вида моллюсков накопление ТМ может достоверно различаться. Среди исследованных металлов более низкое значение накопления было обнаружено для Pb, а самое высокое – для Zn. Содержание Zn в гепатопанкреасе A. woodiana превышало референтные показатели на 45.8%, а в жабрах – на 52.6%. Было показано, что в жабрах происходит большее накопление Zn, чем в гепатопанкреасе. Как и в работе [17], самые высокие значения биоаккумуляции ТМ у пресноводных моллюсков были отмечены в жабрах, а самые низкие значения – в ноге. Некоторые ТМ, в частности, Zn, Pb и Cd, накапливаются в жабрах моллюсков в большей степени, чем в висцеральных органах [18, 19], из чего делался вывод о том, что содержание этих металлов в жабрах моллюсков может являться надежным биомаркером загрязнения природных поверхностных вод [19].

Существует мнение, что содержание ТМ в гепатопанкреасе характеризует хроническое загрязнение воды и донных отложений, в то время как содержание ТМ в жабрах в большей степени связано с текущим ухудшением качества природных вод [20].

Полученные данные по BCF представлены в табл. 5. Для всех определенных в данной работе тяжелых металлов (кроме Zn), оказалось, что значения BCF варьируют от не биоаккумулятивного до очень аккумулятивного. В качестве очень биоаккумулятивного металла выделяется Cd в гепатопанкреасе для моллюсков A. woodiana и C. plicata, у последнего эти значения были самыми высокими среди изученных трех видов. По результатам нашего исследования к не биоаккумулятивному металлу можно было отнести Pb. Его минимальные значения были в жабрах U. douglasiae, у A. woodiana этот показатель был значительно выше. BCF для Cu в жабрах и A. woodiana, и C. plicata был невысоким, т.е. подобно Pb, Cu выявился как не биоаккумулятивный металл. У U. douglasiae в гепатопанкреасе биоаккумулятивными оказались все три металла – Cd, Cu, Pb; у A. woodiana – Cu и Pb; у C. plicata – Cu. В жабрах U. douglasiae биоаккумулятивными металлами оказались Cd и Cu, у A. woodiana – Cd.

Таким образом, значения BCF для биоаккумулятивных металлов варьировали в широких пределах от 1112.14 до 4237.00. Результаты показали, что вид U. douglasiae обладает потенциалом для биоаккумуляции таких металлов, как Cd и Cu (как в гепатопанкреасе, так и в жабрах). Вид A. woodiana также обладает потенциалом для биоаккумуляции, однако только в гепатопанкреасе, для Cd, Cu и Pb. В жабрах этого вида было зафиксировано активное накопление Cd, и при этом низкий коэффициент наблюдали для Cu и Pb. Вид C. plicata по BCF в жабрах оказался очень схож с A. woodiana, а именно: оба вида моллюсков содержали мало Cu и Pb. В то же время в гепатопанкреасе у C. plicata содержание Cd и Cu было очень высоким, т.е. был отмечен потенциал для их накопления именно в этом органе. Таким образом, накопление характеризовалось тканевой специфичностью.

Однако для Zn наблюдался противоположный феномен, и BCF этого металла в жабрах был существенно выше, чем в гепатопанкреасе моллюсков. Это было справедливо для всех исследуемых моллюсков. Действительно, Zn является металлом, необходимым для жизнедеятельности моллюсков, и существует мнение, что моллюски способны контролировать его поступление в организм из окружающей среды [7].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Химический анализ воды показал, что концентрации ТМ в воде реки Сунгари вблизи Харбина были в пределах Стандартов качества поверхностных природных вод Китая [21], в отличие от донных отложений, содержание ТМ в которых значительно превышало указанные стандарты.

Способность моллюсков накапливать ТМ и другие загрязнители в мягких тканях и раковинах делает возможным оценивать биологические эффекты загрязнения среды их обитания на основе соответствующих показателей. Таким образом, токсикологический риск для экосистемы может быть оценен при использовании моллюсков как живых “мониторов” загрязнения окружающей водной среды.

Результаты данного исследования показывают, что изучение особенностей накопления ТМ различными тканями разных видов двустворчатых моллюсков может быть полезным в изучении сравнительной физиологии моллюсков и их адаптации к условиям загрязнения окружающей среды ТМ. Такого рода работы могут способствовать выбору оптимального объекта – биоиндикаторного вида для оценки экологического состояния различных водных объектов Китая и Дальнего Востока России, загрязненных тяжелыми металлами.