Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 3, стр. 197-206

ВВЕДЕНИЕ

В процессе эволюции пептидов инсулинового суперсемейства у высших позвоночных сформировались два основных их представителя – инсулин и инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1), которые имеют сходные рецепторы и внутриклеточные сигнальные каскады, хотя и различаются по своим физиологическим функциям и регуляторным свойствам в организме [1, 2]. Основным отличием инсулина от ИФР-1 является то, что в ходе посттрансляционного процессинга молекулы проинсулина происходит ее сайт-специфичный гидролиз, что приводит к образованию молекулы инсулина, состоящего из соединенных посредством дисульфидных связей А- и В-цепей, и молекулы С‑пептида, в то время как в случае про-ИФР-1 С‑цепь сохраняется в составе зрелой молекулы ИФР-1, соединяя в ней A- и B-цепи. Сразу после открытия С-пептида проинсулина начались исследования по изучению его возможной роли в регуляции физиологических и биохимических процессов в организме человека и других позвоночных животных. В результате было показано, что С-пептид наделен сигнальными функциями и осуществляет свои регуляторные эффекты через специфичные к нему рецепторы [3, 4], одним из которых является сопряженный с гетеротримерными G-белками рецептор GPR146 [5, 6]. Показано также, что С-пептид способен усиливать регуляторные эффекты инсулина, способствуя дезагрегации его олигомерных комплексов и тем самым повышая доступность инсулина для функционального взаимодействия с инсулиновыми рецепторами [7–9].

Поскольку в ходе посттрансляционного процессинга молекулы проинсулина в β-клетках поджелудочной железы С-пептид синтезируется в соотношении 1:1 к инсулину, то в условиях сахарного диабета 1-го типа (СД1), наряду с дефицитом инсулина, возникает и острый недостаток С-пептида, причем как на периферии, так и в ЦНС. Одним из осложнений СД1 является диабетическая энцефалопатия, которая характеризуется нейродегенеративными изменениями в различных структурах мозга, снижением когнитивного дефицита и нарушением центральной регуляции физиологических функций [10]. Основными триггерами нейродегенеративных процессов являются гипергликемия и дефицит инсулина, в том числе снижение его уровня в мозге, что вызывает повышение экспрессии и активности провоспалительных и проапоптотических факторов, нарушает митохондриальную динамику, индуцирует стресс эндоплазматического ретикулума в нейронах и глиальных клетках [11–13]. Поскольку при СД1 уровень С-пептида в мозге также снижается, то это может в еще большей степени усугубить ослабление инсулиновых сигнальных путей в ЦНС, а также снизить активность зависимых от С-пептида сигнальных каскадов в нейронах, глии и клетках эндотелия сосудов головного мозга. В соответствии с вышесказанным, одним из перспективных путей предотвращения диабетической энцефалопатии при СД1 является одновременное повышение внутримозгового уровня не только инсулина, но и С-пептида. Для этого в наибольшей степени подходит интраназальный способ их введения, который для С-пептида был апробирован нами ранее на различных моделях СД у крыс [14, 15], а для инсулина широко применяется для коррекции диабетической энцефалопатии и других нейродегенеративных заболеваний [16–18].

Мишенями инсулина в ЦНС являются АМФ-активируемая протеинкиназа (AMPK), важнейший энергетический сенсор клетки [19, 20], а также белки, вовлеченные в митохондриальную динамику и апоптотические процессы, в том числе динамин-подобный белок-1 (dynamin-related protein 1, Drp-1), контролирующий процесс деления митохондрий, и митофузины (Mfn), ответственные за процесс их слияния [21]. Имеются данные о том, что в условиях СД1 экспрессия и активность AMPK и митохондриальных белков в различных структурах мозга меняются [21–23], причем в случае AMPK эти изменения существенно отличаются от выявляемых на периферии [23–25]. Показано также, что в условиях СД1 в структурах мозга усиливается экспрессия проапоптотического белка Bax и снижается экспрессия антиапоптотического белка Bcl-2, что приводит к снижению выживаемости нейронов мозга [26]. Наряду с Mfn и белком Bcl-2 важную роль в повышении выживаемости нейронов играет белок Beclin-1, который регулирует в них процессы аутофагии [27, 28]. Следует, однако, отметить, что в гипоталамусе грызунов с СД1 экспрессия и функциональное состояние белков, контролирующих энергетический баланс гипоталамических нейронов, их митохондриальную динамику и апоптоз, практически не изучены. Не исследовано воздействие на них интраназально вводимого инсулина и С-пептида, а также их влияние на сигнальные каскады, отвечающие за регуляцию энергетического гомеостаза, в том числе меланокортиновых сигнальных путей.

Цель работы состояла в изучении влияния интраназально вводимых инсулина и С-пептида, в том числе при их совместном введении, на активность AMPK и экспрессию белков Drp-1, Mfn-1 и Mfn-2, ответственных за митохондриальную динамику, биохимических маркеров апоптоза и аутофагии – проапоптотического белка Bax, антиапоптотического белка Bcl-2 и индуктора аутофагии белка Beclin-1, а также на экспрессию меланокортиновых рецепторов (МКР) в гипоталамусе крыс с тяжелой формой стрептозотоцинового СД1.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Исследование проводили на трехмесячных самцах крыс линии Wistar, которым для индукции СД1 однократно внутрибрюшинно, в дозе 50 мг/кг, вводили стрептозотоцин (Sigma, США), растворенный в 0.1 М натрий-цитратном буфере (pH 4.5). Через 5 нед отбирали диабетических крыс с уровнем постпрандиальной глюкозы выше 15 ммоль/л. Для исследования формировали шесть групп животных (во всех n = 6): (1) контроль (К), (2) диабет (Д), (3) диабет с обработкой интраназально вводимым инсулином (ИИ) в дозе 20 мкг/крысу/день (ДИ), (4) С-пептидом в дозе 36 мкг/крысу/день (ДС36), (5) совместно инсулином и С-пептидом в дозах 20  и 36 мкг/крысу/день (ДИС36), (6) совместно инсулином и С-пептидом в дозах 20 и 12  мкг/крысу/день (ДИС12). Продолжительность введения препаратов составила 7 дней, контрольные крысы в те же сроки интраназально получали физиологический раствор. Для оценки гликемического статуса до начала и после окончания воздействия проводили измерение уровней постпрандиальной глюкозы и гликированного гемоглобина (HbA1c), используя тест-полоски One Touch Ultra (США) и набор Multi Test HbA1c System (Polymer Technology Systems, США). Уровень инсулина в крови оценивали с помощью набора Rat Insulin ELISA (Mercodia, Швеция). В конце эксперимента животных декапитировали под наркозом и забирали у них образцы гипоталамуса для изучения активности AMPK (по степени фосфорилирования) и экспрессии целевых генов и белков. На протяжении всего эксперимента у крыс оценивали массу тела и объем потребляемой пищи (в ккал/крыса/день).

Для оценки экспрессии митохондриальных и апоптотических белков (Drp-1, Mfn-1, Mfn-2, Bax, Bcl-2), а также фосфорилирования α-субъединиц AMPK по Thr172 и Ser485/491 использовали вестерн-блоттинг, для чего образцы тканей гипоталамуса гомогенизировали (1:20) в 20 мМ Tris-HCl-буфере (pH 6.8), содержащем 25 мМ ЭДТА, 0.1% Triton X-100, ингибиторы протеаз и фосфатаз, как описано ранее [29]. Гомогенат центрифугировали (100 g, 10 мин), к супернатанту добавляли 200 мМ Tris-HCl-буфер (pH 6.8), содержащий 400 мМ β-меркаптоэтанол, 4% SDS, 40% глицерин и 0.01% бромфеноловый синий (в соотношении 1:3). После нагревания (95° С, 3 мин) пробы разделяли в 8.5 – 14%-ном полиакриламидном геле в зависимости от анализируемого белка и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0.45 мкм, Bio-Rad, США). Далее мембраны в течение 1 ч обрабатывали 5%-ным раствором сухого обезжиренного молока в TBS–Tween-20-буфере (pH 7.6), после чего их в течение ночи при 4 °С инкубировали с первичными антителами Anti-AMPK-α2 (1:2000) (Novus Biologicals, USA), Anti-phospho-AMPK-α1/2(Thr172) (1:1000), Anti-phospho-AMPK-α1(Ser485)/α2(Ser491) (1:1000), Anti-Mfn-2 (1:1000), Anti-Drp-1 (1:1000), Anti-GAPDH (1:2000) (Cell Signaling Technology, США), Anti-Mfn-1 (1 мкг/мл) (Abcam, США). В качестве вторичных антител использовали Goat anti-rabbit IgG HRP (1:5000) (Cell Signaling Technology, США). Для выявления меченных антителами белков применяли набор для иммунохемилюминесценции “Novex ECL Reagents” (Invitrogen, США).

Экспрессию генов оценивали с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией, как описано ранее [29], для чего из гипоталамуса выделяли тотальную РНК с помощью TRIzol Reagent (США). Кодирующую ДНК получали с помощью набора “MMLV RT Kit” (Евроген, Россия). Амплификацию проводили в смеси, содержащей 10 нг обратно транскрибированного продукта, по 0.4 мкМ прямого и обратного праймеров, используя среду qPCRmix-HS SYBR+LowROX (Евроген, Россия). Сигнал детектировали, используя амплификатор 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Экспрессию генов, кодирующих Drp-1, Mfn-1, Mfn-2, Bax, Bcl-2, Beclin-1, МКР 3-го и 4-го типов, определяли с помощью следующих праймеров: Drp-1 – GCTCAGTGCTGGAAAGCCTA (For) и ACTCCATTTTCTTCTCCTGTTGT (Rev); Mfn-1 – CTGGTGGAGATACAGGGCTAC (For) и ACAGCATTGCGTTGATGACA (Rev); Mfn-2 – ATGTCAAAGGGTACCTGTCCA (For) и CAATCCCAGATGGCAGAACTT (Rev); Bax – TAGCAAACTGGTGCTCAAGG (For) и TCTTGGATCCAGACAAGCAG (Rev); Bcl-2 – TAGCAAACTGGTGCTCAAGG (For) и TCTTGGATCCAGACAAGCAG (Rev); Beclin-1 – TTCAAGAT-CCTGGACCGAGTGAC (For) и AGACACCATCC-TGGCGAGTTTC (Rev); Mc3r – CAGCACATGGATAATATCTTCGACTCT (For) и GGCAATGGCCAGGAGGTT (Rev); Mc4r – TGGGTGTCATAAGCCTGTTGG (For) и GCGTCCGTGTCCGTACTG (Rev). В качестве референсного использовали ген 18S rRNA – GGACACGGACAGGATTGACA (For) и ACCCACGGAATCGAGAAAGA (Rev). Полученные данные рассчитывали с помощью метода delta-delta Ct [30].

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы “Microsoft Office Excel 2007”. Данные представляли как M ± SEM. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения двух выборок с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента, для сравнения трех и более групп – дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми считали отличия при уровне значимости p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У диабетических крыс содержание постпрандиальной глюкозы и гликированного гемоглобина (HbA1c) было достоверно выше, чем в контроле, в то время как интраназальное введение им инсулина отдельно и в сочетании с С-пептидом улучшало эти показатели, причем содержание HbA1c в крови крыс группы ДИС36 было достоверно снижено в сравнении с группой Д (табл. 1). При этом все варианты обработки диабетических животных существенно не влияли на массу тела, сниженную в условиях СД1, и на острый дефицит инсулина (табл. 1).

При изучении экспрессии мРНК митохондриальных белков и их количества было показано, что в гипоталамусе диабетических крыс без лечения экспрессия белка Drp-1, ответственного за деление митохондрий, повышается, в то время как экспрессия Mfn, ответственных за их слияние, напротив, снижается, причем различия между группами К и Д в случае экспрессии гена Drp-1 и количества белка Mfn-2 были статистически значимыми (табл. 2). В гипоталамусе крыс группы Д достоверно повышались как количество проапоптотического белка Bax, так и уровень экспрессии мРНК для гена Bax, результатом чего было повышение соотношения Bax/Bcl-2. Наряду с этим снижалась экспрессия мРНК для гена, кодирующего индуцирующий аутофагию белок Beclin-1 (табл. 2). Все эти данные свидетельствуют об активации апоптоза и нарушении митохондриальной динамики в гипоталамических нейронах в условиях тяжелой формы СД1. Интраназальное введение инсулина восстанавливало экспрессию генов Drp-1 и Mfn-2, повышало экспрессию гена антиапоптотического белка Bcl-2, тем самым нормализуя соотношение Bax/Bcl-2 (табл. 2). Еще более выраженный эффект оказывало введение совместно инсулина и С-пептида, которые были взяты в молярном соотношении 1:3. В  группе ДИС36 нормализовалось соотношение про- и антиапоптотических белков Bax и Bcl-2, частично восстанавливалась экспрессия мРНК для гена Beclin-1. Количество белка Drp-1 в группе ДИС36 снижалось до контрольного уровня, а экспрессия гена Drp-1 становилась ниже ее значений в контроле. В группе ДИС12, где соотношение инсулина и С-пептида было эквимолярным, и в группе ДС36, которой вводили один С-пептид, также отмечали восстановление соотношения Bax/Bcl-2, экспрессии белка Drp-1 и кодирующего его гена, а также экспрессии генов Mfn-2 и Beclin-1, но эти эффекты были выражены слабее, чем в группе ДИС36 (табл. 2).

Одной из ключевых причин снижения выживаемости гипоталамических нейронов и нарушений в них митохондриальной динамики является изменение активности AMPK, основного энергетического сенсора клеток. Нами показано, что в условиях СД1 активность AMPK в гипоталамусе повышается, на что указывает достоверное повышение “стимулирующего” фосфорилирования α-субъединиц фермента по остатку Thr¹⁷². При этом, однако, повышается и “модулирующее” активность AMPK фосфорилирование ее α1/α2-субъединиц по остатку Ser^485/491, что можно рассматривать как компенсаторный механизм, направленный на ослабление гиперактивации фермента (рис. 1). При обработке диабетических крыс инсулином отмечали тенденцию к снижению Thr¹⁷²-фосфорилирования при сохранении Ser^485/491-фосфорилирования AMPK, что может в конечном итоге приводить к некоторому снижению гиперактивации фермента. Во всех группах, которым вводили С‑пептид, отмечали статистически значимое снижение Thr¹⁷²-фосфорилирования, а в группах ДИС36 и ДИС12 также сопряженное с этим снижение Ser^485/491-фосфорилирования (рис. 1). В группе ДИС36 активность AMPK снижалась даже ниже контрольных значений (рис. 1).

Рис. 1.

Степень фосфорилирования α1/α2-субъединиц AMPK по остаткам Thr¹⁷² и Ser^485/491 в гипоталамусе крыс с СД1 и влияние на них обработки инсулином и С-пептидом.

а – иммуноблоттинг с использованием антител против Thr¹⁷²-фосфорилированных α-субъединиц AMPK и их нефосфорилированных форм; б – иммуноблоттинг с использованием антител против Ser^485/491-фосфорилированных α1/α2-субъединиц AMPK и их нефосфорилированных форм; в – гистограммы для соотношений фосфорилированных и нефосфорилированных форм AMPK. Уровни экспрессии α-субъединиц AMPK нормированы по сигналу для глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH). * – различия с контрольной группой статистически значимы при p < 0.05; # – различия с группой Д статистически значимы при p < 0.05. Значения представлены как M ± SEM, n = 6.

Принятые на рисунках 1а и 1б сокращения: 1 – контрольная группа (К); 2 – диабетическая група (Д); 3 – диабетическая группа с лечением интраназально вводимым инсулином в дозе 20 мкг/крысу/день (ДИ); 4 – с лечением интраназально вводимым С-пептидом в дозе 36 мкг/крысу/день(ДС36); 5 – с совместным лечением инсулином и С-пептидом в дозе 36 мкг/крысу/день (ДИС36); 6 – с совместным лечением инсулином и С-пептидом в дозе 12мкг/крысу/день (ДИС12).

Fig. 1. The degree of phosphorylation of AMPK α1/α2 subunits at Thr¹⁷² and Ser^485/491 in the hypothalamus of rats with T1DM as affected by intranasal administration of insulin and C-peptide.

a – immunoblotting with antibodies to Thr¹⁷²-phosphorylated AMPK α-subunits and their unphosphorylated forms; b – immunoblotting with antibodies to Ser^485/491-phosphorylated AMPK α1/α2 subunits and their unphosphorylated forms; в – histograms of the ratio of phosphorylated to unphosphorylated AMPK forms (ordinate axes). Expression levels of AMPK α-subunits are normalized to the GAPDH signal. * – differences vs. control group are statistically significant at p < 0.05; # – differences vs. group D are statistically significant at p < 0.05. Data presented as M ± SEM, n = 6. Abbreviations in Fig. 1a and 1b: 1 – control group (C), 2 – diabetic group (D), 3 – diabetic group treated with intranasal insulin at a dose of 20 µg/rat/day (DI), 4 – diabetic group treated with intranasal C-peptide at a dose of 36 µg/rat/day (DC36), 5 – diabetic group treated with a combination of intranasal insulin and C-peptide at a dose of 36 µg/rat/day (DIC36), 6 – diabetic group treated with a combination of intranasal insulin and C-peptide at a dose of 12 µg/rat/day (DIC12).

В условиях СД1 отмечается гиперфагия, что выражается в усилении потребления пищи, как показано нами в группе Д (табл. 1). Механизмами этого могут быть выявленная нами гиперактивация AMPK, вызывающая дисбаланс энергетических процессов в гипоталамических нейронах, и нарушение в них сигнальных каскадов, ответственных за пищевое поведение. Нами показано, что в гипоталамусе диабетических крыс на 54% снижается экспрессия гена Mc4r, кодирующего МКР 4-го типа, который опосредует анорексигенные эффекты меланокортиновых пептидов. У диабетических крыс, обработанных инсулином и С-пептидом, отмечали значительное повышение экспрессии гена Mc4r, причем во всех группах, получавших инсулин, она была в среднем в два раза выше, чем в группе К (рис. 2). Показана отрицательная корреляция между восстановлением экспрессии МКР 4‑го типа и потреблением пищи диабетическими крысами (табл. 1, рис. 2). При этом экспрессия гена Mc3r, кодирующего МКР 3-го типа, наделенного функциями ауторецептора, негативно регулирующего сигнальные пути, реализуемые через МКР 4‑го типа, при СД1 и всех изученных вариантах обработки животных существенно не менялась (рис. 2).

Рис. 2.

Экспрессия генов, кодирующих меланокортиновые рецепторы 3-го и 4-го типов, в гипоталамусе крыс с СД1 и влияние на них обработки инсулином и С-пептидом.

1 – группа К, 2 – Д, 3 – ДИ, 4 – ДС36, 5 – ДИС36, 6 – ДИС12. * – различия с контрольной группой статистически значимы при p < 0.05; # – различия с группой Д статистически значимы при p < 0.05. Значения представлены как M ± SEM, n = 6.

Fig. 2. Expression of genes encoding type 3 and 4 melanocortin receptors in the hypothalamus of rats with T1DM as affected by intranasal administration of insulin and C-peptide.

1 – group C, 2 – D, 3 – DI, 4 – DC36, 5 – DIC36, 6 – DIC12. * – differences vs. control group are statistically significant at p < 0.05; # – differences vs. group D are statistically significant at p < 0.05. Data presented as M ± SEM, n = 6.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее нами было показано, что интраназальное введение крысам инсулина как отдельно, так и в смеси с С-пептидом влияет на метаболические показатели, хотя и в небольшой степени, ослабляет гипергликемию [14, 15, 31]. В настоящем исследовании нами показано, что среди изученных подходов лечения тяжелой формы СД1 значимое ослабление гипергликемии, оцениваемое по снижению уровня гликированного гемоглобина, достигалось только при совместном введении инсулина и С-пептида в соотношении 1:3. В этой связи необходимо отметить, что в условиях метаболических расстройств интраназальное введение инсулина в большей степени влияет на функции нервной и нейроэндокринной систем, чем на периферический глюкозный гомеостаз, и это является преимуществом применения интраназально вводимого инсулина, поскольку оно не приводит к развитию характерных для инъекционного инсулина гипогликемических эпизодов, представляющих опасность для жизни пациентов и способных усугубить дисфункции ЦНС при СД1 [11, 32]. Установлено, что интраназально вводимый инсулин распределяется в ЦНС и практически не поступает в периферический кровоток [17, 18], а выявленное нами в группе ДИС36 улучшение гликемического статуса обусловлено центральными механизмами его действия, в том числе, как можно полагать, активация инсулиновых путей в ЦНС опосредует ингибирование продукции глюкозы гепатоцитами [18].

Определенный вклад в ослабление гипергликемии может вносить ослабление гиперфагии у диабетических животных, как это показано в группах ДИС36 и ДИС12 (табл. 1). Одними из причин этого являются изменения в гипоталамических сигнальных путях, ответственных за регуляцию пищевого поведения. Нами впервые установлено, что у диабетических крыс при их обработке одним С-пептидом восстанавливалась сниженная при СД1 экспрессия гена, кодирующего МКР 4-го типа, через который реализуются анорексигенные влияния α-меланоцитстимулирующего гормона и других пептидов меланокортинового семейства. Более того, обработка крыс интраназально вводимым инсулином, как отдельно, так и совместно с С-пептидом повышала экспрессию гена Mc4r выше ее уровня в контроле, что было ассоциировано со снижением потребления пищи. В то же время масса тела у обработанных таким образом животных не только не снижалась, но и имела тенденцию к повышению, что может быть следствием улучшения энергетического обмена.

Общепринято, что активность гипоталамических систем, контролирующих пищевое поведение и метаболические процессы на периферии, зависит от функционального состояния митохондрий, энергетического статуса, активности апоптотических процессов и стресса эндоплазматического ретикулума в гипоталамических нейронах [25]. Полученные нами данные демонстрируют, что эти показатели в значительной степени меняются в гипоталамусе крыс с СД1 и в различной степени восстанавливаются при интраназальном введении инсулина и С-пептида.

Исключительно важную роль играет выявленная нами нормализация повышенной в условиях СД1 активности AMPK в гипоталамических нейронах диабетических крыс при их обработке С‑пептидом и его комбинацией с инсулином. В отличие от периферии, где в условиях СД1 активность AMPK снижается, в ЦНС, включая гипоталамус, наблюдается обратная картина. Гиперактивация AMPK обусловлена снижением уровня АТФ и усилением активности провоспалительных и гипоксических факторов в тканях мозга при СД1 и других метаболических расстройствах, результатом чего являются нарушения функций гипоталамических нейронов [23]. Показано, что повышение активности AMPK является одним из факторов, индуцирующих гиперфагию у крыс со стрептозотоциновым СД1 [24]. Следует, однако, учитывать, что наряду с повышением “стимулирующего” Thr¹⁷²-фосфорилирования α-субъединиц AMPK усиливается и их “модулирующее” Ser^485/491-фосфорилирование, что может в определенной степени ослаблять гиперактивацию AMPK. Так, в группах ДИС36 и ДИС12 Thr¹⁷²-фосфорилирование снижается, по сравнению с группой Д, на 56 и 40%, а Ser^485/491-фосфорилирование – на 61 и 46% соответственно (рис. 1).

Нами показано, что в гипоталамусе диабетических крыс повышается экспрессия белка Drp-1, который активирует процессы деления и фрагментации митохондрий, снижается экспрессия митофузинов, ответственных за слияние митохондрий и их укрупнение, повышается соотношение проаптототического белка Bax к антиапоптотическому белку Bcl-2, что указывает на усиление в гипоталамических нейронах апоптотических процессов, а также снижается экспрессия мРНК для белка Beclin-1, являющегося индуктором аутофагии. Эти данные свидетельствуют о запуске целого ряда механизмов, снижающих выживаемость гипоталамических нейронов при СД1, что хорошо согласуется с результатами, полученными другими авторами [21, 22, 26, 33]. Так, имеются данные о значительном повышении экспрессии белка Drp-1 в ЦНС в условиях нейродегенеративных заболеваний, в том числе ассоциированных с СД1, причем повышение уровня Drp-1 тесно связано с активацией в нейронах апоптотических и воспалительных процессов [21]. Значительное повышение экспрессии мРНК для гена Drp1 и количества белка Drp-1 обнаружено во фронтальной коре и гиппокампе мышей с тяжелой формой СД1 [22]. В условиях диабетической энцефалопатии, ишемии/реперфузии головного мозга и других нейродегенеративных заболеваний снижается экспрессия Mfn-1 и Mfn-2 – белков с ГТФазной активностью, которые ответственны за слияние внешних мембран митохондрий и обеспечивают их интегративные взаимодействия и обмен генетическим материалом [21, 22, 33]. Снижение экспрессии и функциональной активности митофузинов в гипоталамических нейронах влечет за собой усиление в них стресса эндоплазматического ретикулума и апоптоза и, как следствие, нарушение гипоталамической регуляции энергетического обмена [22, 34–36]. В структурах мозга при СД1 усиливается экспрессия проапоптотического белка Bax и одновременно с этим снижается экспрессия антиапоптотического белка Bcl-2, что приводит к повышению соотношения Bax/Bcl-2, запуску апоптотических каскадов и снижению выживаемости нейронов [26]. В различных структурах мозга в условиях стрептозотоцинового СД1 и других заболеваний, сопровождающихся активацией нейродегенеративных процессов, подавляется экспрессия белка Beclin-1, являющегося одним из индукторов аутофагии – одного из молекулярных механизмов, защищающих нейроны от апоптоза [27, 37].

Фармакологическое восстановление в ЦНС экспрессии и функциональной активности белков, вовлеченных в митохондриальную динамику и контроль выживаемости, в том числе при системном применении инсулина, может в значительной степени предотвратить развитие диабетической энцефалопатии. Так, нормализация экспрессии Bax и Bcl-2 в мозге животных с СД1 и нейродегенеративными заболеваниями с помощью инъекционного инсулина и фармакологических препаратов с нейропротекторной активностью подавляло апоптоз нейронов и глиальных клеток и предотвращало диабетическую энцефалопатию и развитие когнитивного дефицита [35, 38–40]. Обработка крыс с СД1 инъекционным инсулином или коэнзимом Q10 за 24 и 72 ч перед ишемией/реперфузией восстанавливала интрацеребральный уровень Mfn-2, сниженный у диабетических крыс без такой обработки [33]. Все вышесказанное свидетельствует о том, что инсулиновый дефицит в ЦНС является одним из факторов, хотя и не единственным, провоцирующим развитие нейродегенеративных процессов в мозге при СД1. Для его компенсации может быть использован интраназально вводимый инсулин, в том числе в смеси с С-пептидом, действие которого на экспрессию митохондриальных и апоптотических белков в гипоталамусе, как при диабетической энцефалопатии, так и при других нейродегенеративных расстройствах, остается не изученным. Имеется только одно исследование, авторы которого при четырехнедельном интраназальном введении инсулина старым мышам с когнитивным дефицитом выявили нормализацию у них экспрессии Bcl-2 в гиппокампе, что было ассоциировано с восстановлением когнитивных функций [41].

Нами показано, что лечение крыс с тяжелым СД1 интраназально вводимым инсулином, а также смесью инсулина и С-пептида в соотношении 1:3 восстанавливало соотношение Bax/Bcl-2, экспрессию гена Beclin-1 и экспрессию митохондриальных белков – Drp-1 и Mfn-2 (табл. 2). Важно отметить, что смесь инсулина и С-пептида, взятых в эквимолярном соотношении, была менее эффективной, хотя и улучшала показатели экспрессии белков, вовлеченных в митохондриальный биогенез, регуляцию апоптоза и аутофагии. Как можно полагать, это обусловлено влиянием соотношения между инсулином и С-пептидом на стабильность гомоолигомерных комплексов инсулина, в которых инсулин менее доступен для функционального взаимодействия с инсулиновым рецептором. Так, показано, что в присутствии С-пептида гомоолигомерные комплексы инсулина подвергаются структурным изменениям и(или) диссоциации, генерируя тем самым гетероолигомерные комплексы инсулина и С-пептида или мономерные формы инсулина, которые более эффективно взаимодействуют с инсулиновыми рецепторами [7–9]. Эффективность определенных соотношений инсулина и С-пептида зависит от степени их недостаточности в ЦНС при СД и других метаболических расстройствах. Тот факт, что лечение одним С-пептидом приводило к нормализации активности AMPK, восстанавливало экспрессию Drp-1 и соотношение Bax/Bcl-2, свидетельствует о том, что С-пептид, образуя комплексы с “остаточным” эндогенным инсулином, может усиливать его сигнальные пути в гипоталамусе и(или) способен самостоятельно активировать нейропротекторные каскады в гипоталамических нейронах.

Усиление регуляторных эффектов инсулина при образовании его комплекса с С-пептидом может быть обусловлено взаимодополняемостью этих молекул, обусловленной эволюцией пептидов инсулинового суперсемейства. В случае ИФР-1 эта взаимодополняемость приводит к тому, что последовательность, соответствующая C-пептиду, сохраняется в молекуле ИФР-1 и функционально важна для его специфической активности [2]. Важно отметить, что аффинность ИФР-1 к рецептору ИФР-1 выше, чем аффинность инсулина к рецептору инсулина, что, возможно, объясняется совмещением в молекуле ИФР-1 структуры инсулина и  С-пептида. Присутствие последовательности С‑пептида в молекуле ИФР-1, как можно полагать, обусловливает отсутствие потенцирующего влияния С-пептида проинсулина на ИФР-1-зависимый сигналинг, в то время как активность инсулиновых сигнальных путей в его присутствии усиливается [42].

Таким образом, обработка диабетических крыс интраназально вводимым инсулином и С-пептидом приводит к нормализации в гипоталамусе животных повышенной в условиях СД1 активности AMPK, нормализации соотношения между экспрессией про- и антиапоптотических белков Bax и Bcl-2, восстановлению экспрессии белков Drp-1 и Mfn-2, ответственных за митохондриальную динамику, и белка Beclin-1, индуктора аутофагии, причем наиболее эффективным было совместное введение инсулина и С-пептида в молярном соотношении 1:3. В группах крыс, обработанных инсулином и С-пептидом, ослаблялась гиперфагия, что было ассоциировано с повышением экспрессии гипоталамических МКР 4-го типа, ответственных за трансдукцию анорексигенных сигналов, генерируемых меланокортиновыми пептидами. Полученные нами данные не только предоставляют дополнительные доказательства в пользу наличия у интраназально вводимых инсулина и С-пептида выраженного нейропротекторного эффекта при СД1, но и свидетельствуют о том, что выявленное ранее их положительное влияние на метаболические показатели и функции эндокринной и нервной системы в условиях СД1, а также показанная в настоящем исследовании нормализация пищевого поведения могут быть обусловлены их способностью восстанавливать энергетику, митохондриальную динамику и выживаемость гипоталамических нейронов.