Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2021, T. 57, № 5, стр. 392-401

ВВЕДЕНИЕ

Как известно, гипоксия является одним из главных факторов эволюционной адаптации, которая приводит к появлению большого разнообразия адаптивных стратегий [1]. Исследование физиологических, а в последние десятилетия и молекулярно-генетических основ адаптаций к гипоксии у разных видов, остается одним из актуальных вопросов современной биологии [2–6]. Эти адаптации направлены на увеличение подачи кислорода к тканям и/или снижение потребности в кислороде на клеточном уровне [5, 7]. Адаптивные реакции малой лесной мыши (Apodemus uralensis Pall.) к условиям гор относятся к первому типу. Увеличение пропускной способности кислорода в крови у вида обеспечивается изменениями в эритропоэтической активности костного мозга и соответствующим поступлением в периферическую кровь большого числа молодых эритроцитов – ретикулоцитов – и качественными особенностями этих клеток: более высокое содержание гемоглобина при меньших размерах [8]. В результате высокой кислородной емкости крови увеличивается нагрузка на сердце, что выражается в относительно больших размерах сердца [8].

Горные условия характеризуются комбинированным воздействием гипоксии и холода, что создает серьезные физиологические проблемы для млекопитающих, поскольку реакция метаболизма на эти два фактора противоположна [5, 9]. Эти стрессовые факторы накладываются на сезонную цикличность сдвигов условий существования (как климатических, так и кормовых). При значительном объеме исследований по различным аспектам адаптации к гипоксии нет четкого понимания того, каким образом в разные сезоны года обеспечивается поддержание кислородного запроса организма в экстремальных условиях гор.

Цель работы состояла в исследовании особенностей обеспечения кислородного запроса организма широко распространенного вида – Apodemus uralensis, в разные сезоны года в горах Центрального Кавказа.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования, согласно типизации А.К. Темботова [10], проводись в условиях среднегорий субальпийского пояса эльбрусского варианта Центрального Кавказа. Эльбрусский вариант относится к континентальному подтипу восточно-северокавказского (полупустынного) типа поясности. Здесь Главный и Боковой хребты состоят из больших вершин, в силу чего влажные средиземно-черноморские ветры задерживаются, их влияние здесь отсутствует. Климат континентальный, за счет свободного проникновения сухих воздушных потоков с Прикаспийской низменности в горы. Отлов животных проводили в сосновом лесу с примесью березы на территории Национального парка “Приэльбрусье”, окр. пос. Эльбрус, высота местности – 1800 м над ур. м., GPS координаты – 43°15' с.ш., 42°38' в.д.

Объект исследования (Apodemus uralensis Pall.) – доминирующий вид в сообществе мелких млекопитающих субальпийского пояса эльбрусского варианта. Ареал вида на Кавказе в высотном направлении простирается до 3000 м над ур. м. [11]. Молекулярно-генетическими исследованиями на Центральном Кавказе, в пределах КБР, установлено обитание генетически однородных животных, которые идентифицируются как Apodemus uralensis [12].

В работе использовано 170 особей малой лесной мыши с охватом всех сезонов года: зима (январь) – 11 самцов, 10 самок; весна (апрель) – 22 самца, 12 самок; лето (июль) – 32 самца, 33 самки; осень (октябрь) – 20 самцов, 30 самок. Животных отлавливали стандартным методом ловушко-линий [13]. Изучались взрослые особи, возраст которых определяли на основании комплекса признаков стертости зубов, массы тела, состояния генеративных органов. Работа выполнена с соблюдением этических стандартов, утвержденных правовыми актами РФ, международных принципов Базельской декларации о гуманном отношении к животным и правил проведения работ с использованием экспериментальных животных.

Костный мозг получали из бедренной кости. Препараты костного мозга готовили на предметных стеклах и окрашивали комбинированным методом (по Май-Грюнвальд и Романовскому-Гимза, MiniMed, Россия). Морфологический анализ клеток костного мозга (соотношение клеток лейкоцитарного и эритробластного ряда, эритробластограмма) проводился с помощью микроскопа Axio Imager, (Carl Zeiss, Германия), окуляр – 10, объектив – 100 с масляной иммерсией. Ретикулоциты крови (RET) и их парциальный состав исследовали на микропрепаратах, окрашенных 1% раствором красителя бриллиант-крезилблау. Расчет проводили на 10 тыс. эритроцитов. По степени зрелости различали 5 групп ретикулоцитов (0, I, II, III, IV). Концентрацию гемоглобина (HGB, г/л) определяли унифицированным гемоглобинцианидным методом на гемоглобинометре фотометрическом МиниГЕМ-540 (Техномедика, Россия), гематокритное число – соотношение плазмы и форменных элементов (HCT, об.%) – микрометодом на гематокритной центрифуге CM-70 (ELMI, Латвия), подсчет количества эритроцитов (RBC, млн в 1 мкл) проводился в камере Горяева. Диаметр эритроцитов (микрометры) измерялся прямым микрометрическим методом с помощью винтового окуляр-микрометра МАВ 1-16х на сухих окрашенных препаратах крови. Измеряли диаметр 100 различных эритроцитов, результаты распределяли по группам (по величине диаметра эритроцитов). Рассчитывали среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH) в пикограммах (пг), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (MCHC) в г/л, средний объем эритроцита (MCV) в кубических микрометрах (мкм³) [14, 15].

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ “Statistica-10 for Windows”. Влияние факторов проанализировано двухфакторным дисперсионным анализом (Factorial ANOVA). При оценке различий (половых, сезонных) использовали Tukey-тест. Кластерный анализ проводили на основе матрицы дистанций Махаланобиса методом Варда (Ward’s method, 1 – Pearson –r). Для всех статистических тестов принят 5% уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что система крови малой лесной мыши в условиях среднегорья Центрального Кавказа претерпевает значительные сезонные изменения (F = 3.6, p = 0.000), не зависит от пола животных (F = 0.6, p = 0.867) и совместного действия рассматриваемых факторов (F = 1.3, p = 0.104).

Согласно результатам дискриминантного анализа 82% животных соответствуют классификационной матрице, однородность зимней, весенней и осенней выборок составляет 80–88%, летней – 77%.

Система крови A. uralensis в зимний период (январь). Активная часть паренхимы костного мозга у всех изученных особей в зимний период была густо заполнена кроветворными клетками. Эритроидные клетки на препаратах равномерно располагались между другими кроветворными элементами лейкоцитарного ряда и эритроцитами. На каждое поле зрения их приходилось от 15 до 35. Среди этих клеток эритроидного ряда в стадии митоза были 1–3. Жировые клетки встречались в небольшом количестве и не в каждом поле зрения. В парциальном соотношении клеточных групп костного мозга эритроидные клетки составили 21.65% у самцов и 21.45% у самок, оставшиеся около 80% приходятся на лейкоцитарный ряд (табл. 1). В эритрограмме выявлен сдвиг в левую сторону за счет молодых клеток (эритробластов и базофильных нормобластов).

В периферической крови содержание молодых эритроцитов (ретикулоцитов) высокое и составляет 35.47‰ у самцов и 35.67‰ у самок. В парциальном их составе преимущественное содержание ретикулоцитов третьей стадии (около 20‰ у животных обоих полов). Число эритроцитов в 1 мкл крови также высоко, причем как у самок, так и у самцов малой лесной мыши (около 11 млн), при этом они небольших размеров (5.15 и 5.16 мкм соответственно). Концентрация гемоглобина в крови в среднем высокая, у особей обоих полов (табл. 2). По системе крови в зимний период по полу различия не отмечены.

Морфологический анализ эритроцитов на препаратах крови показал, что они нормохромные, и процесс их поступления не нарушен, о чем свидетельствует наличие 3–9 полихроматофильных эритроцитов в каждом поле зрения (рис. 1).

Рис. 1.

Микрофотография препарата крови A. ura-lensis: нормохромные (1) и полихроматофильные эритроциты (2).

В эритроцитах обнаружены включения телец Хауэлла-Жолли (у 60% изученных животных). Все это свидетельствует о высокой активности эритропоэза в зимний период.

Система крови A. uralensis в весенний период (апрель). В весенний период эритроидные элементы на препаратах костного мозга встречались в каждом поле зрения в количестве до 30. В стадии митоза клетки красного ряда (2–3) отмечались не во всех полях зрения. Жировых клеток больше, чем зимой. Полученные результаты свидетельствуют о некотором снижении активности эритропоэза в весенний период, в сравнении с зимним (табл. 1). В парциальной эритрограмме (рис. 2) более низкое содержание эритробластов, статистически значимое в случае сравнения самок (p = 0.000).

Рис. 2.

Сезонная динамика содержания эритроидных клеток в костном мозге у малой лесной мыши (A. uralensis) в условиях среднегорий Центрального Кавказа.

1 – эритробласты, 2 – базофильные, 3 – полихроматофильные, 4 – оксифильные нормобласты.

Средние значения содержания этих клеток весной составляют для самцов 2.59 ± 0.2% и 2.64 ± 0.50% для самок. Также ниже относительное количество оксифильных нормобластов – 47.93 ± 1.39% и 47.61 ± ± 3.25% (p = 0.000 и p = 0.009) соответственно.

Несмотря на это, содержание ретикулоцитов в периферической крови остается на уровне зимних значений, что свидетельствует об активном поступлении красных кровяных телец и в весенний период. Снижение показателей (рис. 3) отмечено лишь для третьей стадии (у самцов – 11.18 ± 0.8‰, у самок – 8.29 ± 0.4‰). Половые различия выражены в парциальном составе ретикулоцитов: у самок меньше зрелых клеток (III (p = 0.008) и IV (p = = 0.029) стадий) и больше молодых (II стадии (p = = 0.050), что связано с ускоренным выходом ретикулоцитов в периферическую кровь и способствует повышению дыхательной функции крови.

Рис. 3.

Сезонная динамика содержания ретикулоцитов в периферической крови Apodemus uralensis Pall.) в условиях Центрального Кавказа (пос. Эльбрус, 1800 м над ур. м.)

1 – I стадия, II – стадия, III – стадия, IV – стадия, 5 – общее количество ретикулоцитов.

В периферической крови содержание эритроцитов весной снижается, по отношению к зиме. Размеры этих клеток весной увеличиваются (диаметр – у обоих полов, объем – MCV – достоверно у самцов). Содержание гемоглобина в 1 мкл крови и его средняя концентрация в эритроците остаются на уровне зимних показателей (табл. 2). Насыщенность эритроцитов гемоглобином (MCH) повышается у самцов, у самок остается на уровне зимних значений. Морфологический анализ препаратов крови показал, что поступающие клетки (эритроциты) из костного мозга в весенний период нормохромные. Полихроматофильные эритроциты, которые встречались в каждом поле зрения, свидетельствуют о нормальном процессе обновления эритроцитов. В эритроцитах, как и зимой, обнаружены тельца Хауэлла-Жолли, у 71.6% особей. Половые различия по параметрам периферической крови в данном сезоне выражены по среднему содержанию гемоглобина в эритроцитах (p = 0.001).

Система крови A. uralensis в летний период (июль). Эритроидные клетки на препаратах костного мозга летом встречались в количестве до 45 в каждом поле зрения. Отмечены 1–3 клетки в стадии митоза не во всех полях зрения. Летом активизируется эритропоэз костного мозга: значительно повышается общее количество эритроидных клеток у обоих полов. Их количество составило 22.59% у самцов и 23.47% – у самок. В эритрограмме меняется соотношение эритроидных клеток. Повышается количество эритробластов (3.21 ± 0.2% у самцов и 2.86 ± 0.2% у самок), значительно снижается (рис. 2) количество базофильных нормобластов (6.57 ± 0.5 и 5.09 ± 0.4% соответственно). Численные данные по полихроматофильным и оксифильным нормобластам – близки с весенними показателями. Летом в периферической крови по результатам дисперсионного анализа наблюдается снижение поступления ретикулоцитов, по сравнению с весной (рис. 3), за счет более зрелых клеток (в основном III стадии). При этом возрастает (рис. 3) доля молодых стадий (отмечены клетки первой стадии и несколько увеличивается количество второй). Число эритроцитов в периферической крови летом проявляет тенденцию к снижению. У самцов A. uralensis среднее содержание гемоглобина в эритроците сохраняется на уровне весенних значений, а у самок наблюдается его рост (до уровня самцов). Содержание гемоглобина в крови, гематокритный показатель остаются близкими с весенними данными (табл. 2). У самцов близки также летние и весенние показатели по средней концентрации гемоглобина и среднему объему эритроцитов. Морфологический анализ эритроцитов на препаратах крови показал, что они нормохромные, как и в предыдущие сезоны, процесс поступления молодых эритроцитов (полихроматофильных) увеличен. В эритроцитах 83.3% изученных животных обнаружены тельца Хауэлла-Жолли. Половые различия по изученным параметрам системы крови в данном сезоне выражены (по полихроматофильным нормобластам, ретикулоцитам III стадии).

Рис. 4.

Кластерный анализ по системе крови (20 параметров костного мозга, периферической крови) малой лесной мыши (Apodemus uralensis Pall.) в условиях Центрального Кавказа (пос. Эльбрус, 1800 м над ур. м.).

Система крови A. uralensis в осенний период (октябрь). Кроветворные клетки костного мозга осенью на препаратах размещались равномерно. Эритроидные клетки встречались в каждом поле зрения в количестве до 40, отмечены клетки в стадии митоза (1–2 не в каждом поле зрения). Дисперсионный анализ показал, что осенью количество клеток эритроидного ряда в костном мозге малой лесной мыши значительно снижается (у самцов и самок p = 0.01), по сравнению с летним периодом. При этом в парциальной эритрограмме у особей обоих полов повышается содержание эритробластов (у самцов – 4.07 ± 0.3%, у самок – 4.61% ± ± 0.2%) и базофильных нормобластов (11.10 ± 0.5 и 12.13 ± 0.7% соответственно). Доля более зрелых клеток – полихроматофильных (достоверно у самок) снижается. Процесс поступления молодых эритроцитов (ретикулоцитов) в кровь осенью у Apodemus uralensis более интенсивен по сравнению с летним периодом, однако различия у самок не достигают уровня достоверных различий (у самцов p = 0.01, у самок p = 0.264). Изменения наблюдаются в парциальном составе ретикулоцитов: увеличивается число клеток третьей стадии (у самцов 11.18 ± 0.8, p = 0.03, у самок 8.29 ± 0.4, p = 0.01).

Данные, полученные по ретикулоцитам, вполне согласуются с увеличением содержания эритроцитов в периферической крови. Осенью изменяются не только количественные, но и качественные характеристики этих клеток: они меньшего диаметра и объема и менее насыщены гемоглобином, по сравнению с летними (табл. 2). Морфологический анализ эритроцитов на препаратах крови показал, что они нормохромные и процесс поступления молодых эритроцитов (полихроматофильных) не нарушен. Тельца Хауэлла-Жолли в эритроцитах встречаются, но меньше, чем летом – 60%.

В крови осенью содержание гемоглобина, гематокритный показатель близки к летним значениям.

Как видно из рис. 4, кластерный анализ по расстоянию Махаланобиса (Ward’s method, 1 Pearson r) на основе показателей эритропоэза, ретикулоцитов периферической крови показал разделение выборок на 3 кластера. Выборки весны и осени наиболее сходны и образуют один кластер, который обладает большим сходством с зимними выборками, чем с летними.

Летние выборки отличаются от выборок других сезонов и образуют отдельный кластер. По изученным параметрам системы крови выявлена параллельная изменчивость самцов и самок малой лесной мыши.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ сезонной изменчивости эритропоэза свидетельствует о том, что у A. uralensis в среднегорьях эльбрусского варианта Центрального Кавказа кроветворная функция костного мозга сохраняется на высоком уровне в течение всего годового цикла, и подвержена сезонной изменчивости. Наиболее активное обновление крови наблюдается в зимний и летний периоды, и менее активное – в весенний и осенний. Процесс поступления молодых эритроцитов (ретикулоцитов) из костного мозга в периферическую кровь наиболее интенсивен зимой, сохраняется на высоком уровне в весенний период, а минимален – летом. Концентрация гемоглобина в крови A. uralensis в среднегорьях Центрального Кавказа стабильно поддерживается на высоком уровне в течение всего годового цикла. По всей вероятности, обитание в условиях хронической гипоксии обусловливает необходимость высокого оснащения организма A. uralensis кислородом независимо от сезона года. В способах поддержания необходимой кислородной емкости крови в разные сезоны года имеются существенные различия, что подтверждается результатами кластерного анализа.

Так, в летний период в периферическую кровь, при активном эритропоэзе, из костного мозга поступает относительно небольшое количество молодых эритроцитов (ретикулоцитов). Есть мнение [16], что ретикулоцит, который не прошел барьер, образованный стенкой сосудистого эндотелия, созревает в паренхиме, утрачивает способность диапедеза, остается блокированным и фагоцитируется макрофагами. Эти эритроциты входят в состав неэффективного эритропоэза.

Эритроциты A. uralensis в среднегорьях Центрального Кавказа в летний период имеют качественные особенности: они более крупные по своим размерам (диаметр, объем), с большим содержанием гемоглобина. При этом их количество летом падает до минимальных значений в годовом цикле. Высокая эритропоэтическая активность костного мозга при одновременном разжижении крови может способствовать увеличению кислородной емкости крови, при расчете на единицу массы тела [17].

Лесные мыши характеризуются относительным несовершенством физической терморегуляции и энергетические затраты их организма весьма значительны [18]. В зимний сезон, с низкими температурами внешней среды, который предполагает более высокий уровень метаболизма для поддержания постоянной температуры тела, эритропоэтическая активность костного мозга A. uralensis также высока, но с выходом большого количества ретикулоцитов (молодых эритроцитов) в периферическую кровь. Число эритроцитов в крови достигает максимальных значений в годовом цикле, причем размеры (диаметр и объем) этих клеток – минимальны. Все это обусловлено увеличением общей поглотительной поверхности для кислорода, а соответственно, более эффективным обеспечением организма кислородом. Известно [19], что меньшие по размеру эритроциты имеют более эффективный обмен кислорода. Увеличение доли “мелких” эритроцитов в период значительного снижения температуры среды [20, 21] объяснимо и с физико-химических позиций: чем более мелкодисперсная среда, тем больше площадь соприкосновения двух фаз, выше скорость диффузии. Большое число мелких эритроцитов в крови зимой обнаружено у ряда грызунов [11, 22–24]. Существует мнение, что уменьшение размеров эритроцитов зимой может быть генетически детерминированным [25]. Так, у высокогорных Phyllotis xanthopygus rupestris, выдерживающих сезонный перепад температур по меньшей мере 20°C, потомство рожденное и выросшее в условиях постоянной температуры, сохраняет сезонную изменчивость размеров эритроцитов [25]. Все выше сказанное позволяет предположить, что изменение размеров эритроцитов в первую очередь обусловлено изменением температуры среды.

В весенний период кроветворная функция костного мозга Apodemus uralensis снижается. Однако содержание ретикулоцитов, причем и более молодых стадий, в крови высокое, при довольно значительном снижении количества эритроцитов в периферической крови. Можно полагать, что это обусловлено увеличением эритродиереза, т.е. наблюдается усиленный распад красных клеток крови. В этот период года, по нашему мнению, и происходит замещение “мелких” зимних эритроцитов на крупные клетки.

В осенний сезон изученные показатели периферической крови, за исключением диаметра эритроцитов, ближе в основном к зимним значениям, при более низкой кроветворной активности костного мозга и соответствующих более низких показателях содержания ретикулоцитов в крови.

В эритроцитах малой лесной мыши (у более 70% особей летом, около 60% в другие сезоны) в условиях гор Центрального Кавказа отмечены тельца Хауэлла-Жолли, которые являются мелкими остатками ядерного материала. У желтогорлой мыши в Словакии [26] этих включений в эритроцитах зимой меньше, чем в другие сезоны. Присутствие их, возможно, объясняется повышенной скоростью продуцирования эритроцитов в момент регенеративного ответа [16, 17].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ комплекса гематологических показателей широко распространенного вида – A. uralensis в условиях среднегорий Центрального Кавказа позволил выявить сезонную динамику как в кроветворении, так и в показателях периферической крови.

Эритропоэтическая функция костного мозга вида в течение всего года поддерживается на высоком уровне, с выделением двух пиков: зимнего и летнего. При этом сезонные тренды поступления молодых эритроцитов (ретикулоцитов) отличны (максимальное – зимой, минимальное – летом). Динамика поступивших в кровь эритроцитов и содержания в них гемоглобина сходны: высокие показатели в холодный зимний сезон и низкие – в теплый летний. Изменчивость размеров эритроцитов – диаметра и объема – в противоположном направлении: максимальные значения – в весенне-летний период, минимальные – осенне-зимний. Наиболее изменчивыми в системе красной крови в сезонном аспекте являются эти показатели. В течение года стабильны – показатели содержания гемоглобина в крови и его концентрация в эритроцитах, гематокритный показатель. Относительно постоянные значения гематокритного числа A. uralensis обусловлены разнонаправленной сезонной динамикой размера и количества эритроцитов. Так, количество эритроцитов увеличивается в зимний период (что дает рост гематокритного числа), но одновременно средний диаметр эритроцита уменьшается. Соответственно, гематокритное число сохраняет относительно стабильные значения. Постоянство гематокрита позволяет избегать увеличения вязкости крови [27] при увеличении транспорта кислорода, что особенно важно в условиях действия хронической гипоксии.

Полученные нами данные свидетельствуют о высокой кислородной емкости крови A. uralensis в условиях гор Центрального Кавказа (1800 м над ур. м.) в течение всего годового цикла. При этом обеспечение высокого кислородного запроса вида в горах в разные сезоны года осуществляется разными способами. В осенне-зимний период – увеличением общей поглотительной поверхности для кислорода, обусловленное увеличением количества эритроцитов и уменьшением их размеров. В весенне-летний – поступлением в кровоток эритроцитов с качественно иными свойствами: более “крупных” с повышенным содержанием связывающего кислород гемоглобина (при относительно небольшом их количестве). Обнаруженные качественные изменения эритроцитов обусловливаются сезонными перестройками в эритропоэзе костного мозга.

У самцов и самок A. uralensis сезонная изменчивость по большинству изученных показателей синхронна. Половые различия по показателям системы красной крови у вида в условиях среднегорий Центрального Кавказа выражены слабо, вероятной причиной чего могут являться суровые климатические условия [28]. В отдельных случаях на сезонные изменения климатических факторов самцы реагируют быстрее самок, что согласуется с эволюционной теорией пола [29]. Так, объем эритроцитов и насыщение их гемоглобином достигают максимальных значений у самок летом, тогда как у самцов уже весной. В целом половые различия по показателям системы крови более выражены в весенне-летний период. Вероятнее всего это связано с процессами размножения и соответствующими изменениями гормонального фона.

Выявленная сезонная изменчивость в показателях костномозгового кроветворения и периферической крови малой лесной мыши обеспечивает поддержание, как оптимальной кислородной емкости крови, так и гомеостаза всего организма в горах Центрального Кавказа.