Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2021, T. 57, № 6, стр. 484-493

ВЛИЯНИЕ Na+ НА НАГРУЖЕННЫЕ КАЛЬЦИЕМ МИТОХОНДРИИ СЕРДЦА КРЫСЫ И МИОКАРД ЛЯГУШКИ

С. М. Коротков 1*, К. В. Соболь 1, И. В. Шемарова 1, В. П. Нестеров 1

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук
Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: korotkov@SK1645.spb.edu

Поступила в редакцию 28.06.2021
После доработки 29.07.2021
Принята к публикации 06.08.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведено сравнительное исследование влияния кальциевой нагрузки на митохондрии сердца крысы (МСК(K+)), у которых часть ионов K+ в их матриксе была заменена на ионы Na+ (МСК(Na+)). Нагрузка МСК(K+) кальцием снижала их дыхание, разобщенное 2,4-динитрофенолом, и уменьшала потенциал внутренней мембраны (∆Ψмито). При этом набухание этих митохондрий увеличивалось в средах с 25 мМ K-ацетатом или 125 мМ NH4NO3. Эти эффекты кальциевой нагрузки были еще больше в аналогичных опытах с МСК(Na+). Ингибиторы митохондриальной кальций-зависимой поры (МКЗП), АДФ и циклоспорин А, полностью устраняли вышеуказанные эффекты Ca2+ в опытах с МСК(K+), и лишь частично в опытах с МСК(Na+). При увеличении внеклеточной концентрации Na+ наблюдался положительный инотропный эффект, однако пре-инкубация в бескальциевом растворе приводила к отрицательному инотропному эффекту. Таким образом, частичная замена K+ на Na+ в матриксе сделала митохондрии сердца крысы более чувствительными к Ca2+ и увеличивала в их внутренней мембране вероятность открытия МКЗП. Вместе с увеличением цитоплазматического [Na+]i это может увеличивать кальциевую перегрузку кардиомиоцитов, делая более вероятным их повреждение при ишемии/реперфузии.

Ключевые слова: миокард, Na+, Са2+, инотропное действие, митохондриальный потенциал, митохондриальная кальций-зависимая пора

Концентрация Na+ в цитоплазме кардиомиоцитов, как известно, увеличивается в результате ишемии сердечной мышцы, но при этом накопления в этих клетках Ca2+ не наблюдается [1, 2]. Последующая реперфузия миокарда способствует кальциевой и натриевой перегрузке кардиомиоцитов и митохондрий [24]. Повреждение мембран клеток и митохондрий является другим отрицательным последствием ишемии/реперфузии, наряду с уменьшением цитоплазматической концентрации АТФ в кардиомиоцитах [46]. Ишемия сердечной мышцы крысы приводит к снижению давления в левом желудочке, а также в результате этого снижается скорость дыхания митохондрий в состоянии 3, изолированных из этой ткани [1]. В результате ишемии/реперфузии происходит активное поступление в матрикс ионов Na+ посредством Na+/Ca2+ и Na+/H+ митохондриальных обменников [1, 3, 7, 8].

В результате ишемии/реперфузии цитоплазматическая концентрация ионов Na+ в кардиомиоцитах, как было показано, достигает 25–35 мМ [8]. По этой причине ранее мы исследовали [9] митохондрии сердца крысы (МСК), матрикс которых был нагружен ионами Na+ в среде, содержащей 100 мМ NaCl. В матриксе таких митохондрий концентрация Na+ увеличивалась от 23 до 44 мМ [9]. В сравнении с контрольными органеллами без натриевой нагрузки (МСК(K+)) у митохондрий с повышенной концентрацией Na+ в их матриксе (МСК(Na+)) возрастали пассивная калиевая и протонная проницаемость их внутренней мембраны (ВММ) и энергозависимое поступление K+ в матрикс. При этом снижались скорости дыхания митохондрий, находящихся в состоянии 3 и 3РДНФ (разобщенные ДНФ).

Показано, что окислительный стресс и кальциевая перегрузка митохондрий делали более вероятным открытие митохондриальной кальций-зависимой поры (МКЗП) в их внутренней мембране (ВММ) что является причиной возникновения повреждений сердечной мышцы из-за ишемии/реперфузии [1013]. В данном случае наблюдается нарушение структуры наиболее важного и сложного I митохондриального комплекса дыхательной цепи [14].

Концентрация внутриклеточного натрия ([Na+]i) играет важную роль в контроле внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]i), поскольку [Na+]i является основным регулятором Na+/Ca2+ обменника [15, 16]. Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума и Na+/Ca2+ обменник – два основных из четырех регулирующих механизмов снижения [Ca2+]i в цитоплазме [16]. Na+/Ca2+ обменник – это сарколеммальный белок, который двунаправленно обменивает три иона Na+ на один ион Ca2+. Направление обмена зависит от вне- и внутриклеточных концентраций Na+ и Ca2+, а также от величины мембранного потенциала. При величине мембранного потенциала, равной величине потенциала покоя Na+/Ca2+ обменник служит преимущественно для удаления Ca2+ из клетки, однако, при деполяризации через Na+/Ca2+ обменник осуществляется приток Ca2+ клетку. Увеличение концентрации [Na+]i приводит к снижению скорости вытеснения Ca2+ через Na+/Ca2+ обменник и оказывает положительный инотропный эффект [17, 18]. Однако такое увеличение [Ca2+]i посредством увеличения концентрации [Na+]i может приводить к нарушению ритма сердца и особенно опасно для сердца в условиях ишемии/реперфузии [1719]. В данной работе мы стимулировали рост [Na+]i методом увеличения внеклеточной концентрации натрия в растворе Рингера и изучали эффекты повышенной концентрации Na+ на спонтанное сокращение препаратов предсердий лягушки. Вместе с тем можно полагать, что сопоставление данных, полученных в опытах с использованием представителей этих двух видов животных, вполне оправдано исходя из полученных ранее данных о единой структурной организации митохондрий в сократительных тканях всех типов многоклеточных животных и также в исследованных хондриомах сердца крысы и сердца лягушки Rana ridibunda.

Цель данной работы – исследовать эффекты натриевой перегрузки кардиомиоцитов на динамику мышечных сокращений и оценить влияние нагрузки митохондрий сердца крысы ионами Na+ и Ca2+ на потенциал внутренней мембраны, дыхание митохондрий в состояниях 4 и 3РДНФ, на набухание этих органелл, а также на индукцию в их внутренней мембране кальций-зависимоой поры (МКЗП).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. В работе использовали самцов породы Вистар весом 200–250 г. Животные содержали при 20–23°C с 12-часовым циклом свет/темнота со свободным доступом к питьевой воде и к стандартной диете для крыс. В работе также использовали самцов лягушек Rana ridibunda весом 140–160 г. Животные содержались при 8–10°C с 12-часовым циклом свет/темнота в ванне с небольшим количеством воды.

Выделение митохондрий. Митохондрии сердца крысы (МСК(K+)) выделяли согласно методике, разработанной нами ранее [20]. Концентрация (мМ) ионов K+ и Na+ в матриксе этих митохондрий была соответственно 128 ± 11 и 23 ± 2 [9]. Нагрузку матрикса МСК ионами натрия проводили в растворе, содержащем 5 мМ Трис-HCl (pH 8.60) и 110 мМ NaCl, согласно детально описанной нами ранее процедуре [9]. Концентрация (мМ) ионов K+ и Na+ в матриксе нагруженных Na+ митохондрий сердца крысы (МСК(Na+)) оказалась соответственно равна 101 ± 4 и 44 ± 2 [9]. Концентрацию белка в митохондриальных препаратах оценивали методом Бредфорда. Она оказалась около 25–30 мг/мл.

Измерение скоростей поглощения кислорода в препаратах изолированных из сердца крысы митохондрий. Данные скорости (натомов O/мин мг белка) тестировали при 26°С в ячейке объемом 1.5 мл на полярографе LP-7 (ЧССР) методом полярографии с применением закрытого платинового электрода Кларка. Оценивали дыхание энергизованных смесью глутамата и малата митохондрий, находящихся в состояниях 40 и 3РДНФ (разобщенном 2,4-динитрофенолом) [21]. Митохондрии (1 мг белка в 1 мл) инъецировали в среду, содержащую (мМ): 20 MOPS (pH 7.3), 125 KСl, 10 глутамат, 3 KH2PO4, 2 малат и 0.05 EGTA. Остальные добавки указаны в подписи к рис. 1.

Рис. 1.

Влияние Ca2+ на скорость поглощения кислорода энергизованными глутаматом и малатом митохондриями сердца крысы. Митохондрии (1 мг/мл) были внесены в среду, содержащую 125 мМ KCl, 20 мМ трис-MOPS (pH 7.3), 3 мМ трис-PO4, 10 мМ глутамат и 2 мМ малат. Числами над кривыми показаны скорости поглощения кислорода (натом O/мин на 1 мг белка). Вертикальными стрелками показаны добавки митохондрий: а – (RHM(K+), b – RHM(Na+). Наклонными стрелками обозначено внесение в среду 150 мкМ Ca2+ (Ca2+), 1 мкМ CsA (CsA), 4 мкг/мл олигомицина (OM) и 30 мкМ 2,4-динитрофенола (DNP). Цифрами справа от кривых показано: 1 – без добавок, 2 – Ca2+, 3 – ОМ + Ca2+ + CsA.

Оценка набухания митохондрий спектрофотометрическим методом. Увеличение объема митохондриального матрикса (набухание митохондрий) исследовали с использованием спектрофотометра СФ-46 (ЛОМО, РФ) при температуре 20°С по снижению оптической плотности митохондриальной суспензии из-за уменьшения светорассеяния при длине волны 540 нм. Органеллы (1 мг белка в 1 мл) вносили в среду, содержащую (мМ): 5 Трис-HCl (pH 7.3) и 125 NH4NO3 или 100 сахарозы, 25 K-ацетата и 10 трис-HCl (pH 7.3). Во всех средах присутствовал олигомицин (4 мкг/мл). Остальные добавки указаны в подписях к рис. 2 и 3.

Рис. 2.

Влияние Ca2+ на набухание (ΔD540) митохондрий сердца крысы в среде с NH4NO3. Митохондрии (1 мг/мл) добавляли в среду, содержащую 125 мМ NH4NO3, 5 мМ трис-HCl и 1 мкг/мл олигомицина, а также (где указано) 100 мкМ Ca2+ (Ca2+), 2 мкМ CsA (CsA), 500 мкМ ADP (ADP). Цифрами справа от кривых показана добавка до митохондрий: 1 – без добавок, 2 – Ca2+, 3 – Ca2+ + CsA + ADP. Стрелками показаны добавки митохондрий: а - (RHM(K+), b – RHM(Na+), а также 10 мМ глутамат с 2 мМ малатом (G + M).

Рис. 3.

Влияние Ca2+ на набухание (ΔD540) митохондрий сердца крысы в среде с K-ацетатом и сахарозой. Митохондрии (1 мг/мл) добавляли в среду, содержащую 25 мМ K-ацетат, 100 мМ сахарозу, 10 мМ трис-ацетат и 1 мкг/мл олигомицина. Добавки и обозначения как на рис. 2.

Оценка потенциала внутренней мембраны митохондрий. Трансмембранный потенциал (∆Ψмито) тестировали при 20°С стандартным методом [20] с использованием спектрофлуориметра Shimadzu RF-1501 (Shimadzu, Япония). Измеряли изменение интенсивности флуоресценции сафранина О. Длина волны возбуждающего света была 485 нм, а длина эмиссионной волны равнялась 590 нм. Митохондрии (0.5 мг белка в 1 мл) вносили в среду, содержащую (мМ): 10 трис-HCl (pH 7.3), 125 KCl, 50 сахарозы, 3 MgCl2 и 3 трис-PO4, а также 3 мкМ сафранин и 1 мкг/мл олигомицина. Другие добавки приведены в подписях к рис. 4.

Рис. 4.

Влияние Ca2+ на изменение потенциала (ΔΨмито) внутренней мембраны энергизованных глутаматом и малатом митохондрий сердца крысы. Митохондрии (0.5 мг/мл) вносили в среду, содержащую 125 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ трис-PO4, 3 мкМ сафранин О и 1 мкг/мл олигомицина, а также (где указано) 1 мкМ CsA (CsA) и 500 мкМ ADP (ADP). Стрелками показаны добавки митохондрий: а – (RHM(K+), b – RHM(Na+), а также 10 мМ глутамат с 2 мМ малатом (G + M), 60 мкМ Ca2+ (Ca2+) и 1 мкМ FCCP (FCCP). Цифрами справа от кривых показаны опыты: 1 – без добавок, 2 – Ca2+, 3 – Ca2+ + CsA + ADP.

Регистрация и анализ параметров сокращения. Для изучения инотропного эффекта натрия использовали спонтанно-сокращающиеся препараты предсердий лягушки Rana ridibunda. Подробное описание методики было представлено ранее [22]. Препараты помещали вертикально в ячейку из оргстекла и с помощью стальных крючков растягивали до оптимальной длины для получения максимальных спонтанных сокращений. Все эксперименты проводили в изометрическом режиме и при температуре 8°C. С одной стороны препарат крепили к неподвижному платиновому крючку, с другой стороны к тензометрическому датчику для измерения силы сокращений. Сигнал с тензодатчика подавался на компьютер, где обрабатывался с помощью программы WinPulse. Силу сокращения выражали в Ньютонах (Н). В экспериментах использовали раствор Рингера, содержащий (мМ): 2.5 KCl, 110 NaCl, 2.5 CaCl2, 1 MgCl2, 0.5 NaHCO3, 0.75 NaH2PO4 и 5 глюкозы (pH 7.4). Повышенную концентрацию натрия получали добавлением соответствующего количества NaCl в раствор Рингера.

Схема экспериментов была следующей: предсердия инкубировались в растворе с повышенной концентрацией Na+ (140 мМ), затем из раствора убирали Са2+, а затем снова добавляли. Время инкубации в каждом из растворов составляло 3–4 мин.

Применяли стандартные способы статистической обработки результатов с использованием критерия Стьюдента в статистической программе Microsoft Origin 6.0. Различия считали достоверными при р < 0.05. На всех рисунках представлены стандартные результаты из трех независимых экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние кальция на митохондрии сердца крысы, нагруженные Na+. Мы обнаружили ранее, что перегрузка МСК(K+) ионами Ca2+ индуцировала открытие поры во ВММ митохондрий сердца крысы, что проявлялось в снижении их дыхания в состоянии 3РДНФ (рис. 1a, кривые 1 и 2) [23]. После внесения Ca2+ в среду наблюдалось уменьшение дыхания энергизованных глутаматом и малатом МСК(Na+), находящихся в состоянии 3РДНФ (рис. 1b, кривые 1 и 2). Такое уменьшение данного дыхания было больше по сравнению с аналогичным снижением дыхания в опытах с контрольными митохондриями (МСК(K+)) (рис. 1a, кривые 1 и 2). Эксперименты с ингибитором МКЗП циклоспорином А (CsA) показали, что индуцированное кальцием снижение дыхания в состоянии 3РДНФ полностью исчезало в контроле (рис. 1a, кривая 3) и дыхание этих митохондрий показало значения, найденные в бескальциевых опытах (рис. 1a, кривая 1). В подобных опытах с МСК(Na+) воздействие CsA было явно слабее (рис. 1b, кривая 3) и дыхание этих митохондрий в состоянии 3РДНФ практически не изменилось в сравнении с опытами с Ca2+ без CsA (рис. 1b, кривая 2). Поскольку снижение дыхания в состоянии 3РДНФ не обязательно является результатом открытия кальций-зависимой поры во ВММ, а может быть связано с увеличением митохондриального объема [23, 24], поэтому мы изучали набухание митохондрий, МСК(Na+) и МСК(K+), в средах с NH4NO3 или с K-ацетатом и сахарозой.

Набухание неэнергизованных митохондрий в среде, содержащей NH4NO3, дает возможность изучить пассивную проницаемость ВММ для H+, поскольку эта мембрана имеет высокую проницаемость для анионов NO3 и молекул аммиака (NH3), образующихся при диссоциации катионов аммония (NH4+) на NH3 и протоны [25]. В этом случае набухание органелл зависит только от поступления H+ в матрикс. На рис. 2a (кривые 1 и 2) можно увидеть, что независимо от присутствия кальция, деэнергизованные МСК(K+) слабее набухали в этой среде в сравнении с аналогичными результатами, найденными в опытах с МСК(Na+) (рис. 2b, кривые 1 и 2). Возможно, большая пассивная протонная проницаемость ВММ, найденная нами ранее в опытах с МСК(Na+) [9], является причиной такого результата, что позволяет предположить отсутствие влияния ионов Ca2+ на эту проницаемость. Можно увидеть (рис. 2а и 2b, кривая 1), что митохондрии активно сжимались после внесения в среду глутамата и малата по причине откачки ионов аммония (${\text{NH}}_{4}^{ + }$) из матрикса в результате работы K+/H+ обменника [25, 26]. Обнаруженное здесь (рис. 2а, кривая 2) массивное набухание нагруженных кальцием МСК(K+) обусловлено появлением во внутренней мембране МКЗП [23]. При наличии в этой среде ингибиторов МКЗП (АДФ и CsA) набухание этих митохондрий сменилось их заметным сжатием (рис. 2а, кривая 3). С другой стороны, такого результата не удалось достичь в аналогичных опытах с МСК(Na+) (рис. 2b, кривая 3). Кальциевая нагрузка этих митохондрий стимулировала большее их набухание после внесения субстратов, а влияние АДФ и CsA было слабее (рис. 2b, кривая 3).

Изучение набухания энергизованных митохондрий в 160 мОсм среде с CH3COOK и сахарозой дает возможность оценить электрофоретический транспорт K+ в матрикс энергизованных митохондрий [20, 26]. В этом случае ионы K+ накапливаются в матриксе электрофоретически при помощи K+-унипортера митохондрий. Анион ацетата во внешней среде находится в равновесии со свободно проникающими через ВММ молекулами CH3COOH, которые, проникнув в митохондрии, снова диссоциируют на CH3COO и протоны, которые далее удаляются из матрикса протонными помпами электрон-транспортной цепи энергизованных митохондрий [27]. В конечном итоге происходит накопление в матриксе ацетата калия и идущей за ним воды, что влечет за собой набухание митохондрий (рис. 3а и 3b, кривая 1). В сравнении с МСК(K+), набухание МСК(Na+) было больше после внесения субстратов в калий ацетатную среду с Ca2+ (рис. 3а и 3b, кривая 2). Независимо от наличия кальция в калий ацетатной среде, набухание МСК(Na+) оказывалось всегда больше аналогичного набухания МСК(K+).

Индуцированное кальцием набухание энергизованных митохондрий (рис. 3а и 3b, кривая 3) заметно снижалось в среде с АДФ и CsA, и стало сопоставимо с результатами опытов без кальция (рис. 3а и 3b, кривая 1). Однако данные ингибиторы действовали слабее в экспериментах с МСК(Na+).

Как известно, снижение флюоресценции сафранина О в митохондриальной суспензии свидетельствует о возникновении электрохимического потенциала (ΔΨмито) внутренней мембраны [28]. В этом случае на ее матриксной стороне возникает отрицательный заряд являющейся движущей силой при движении сафранина О в митохондрии. В опытах без Ca2+ и ингибиторов потенциал внутренней мембраны МСК(K+) после добавки глутамата и малата снижался медленнее (рис. 4а, кривая 1), чем в аналогичных опытах с МСК(Na+) (рис. 4b, кривая 1). После добавки Ca2+ в среду наблюдалось ощутимое снижение ΔΨмито в опытах с МСК(Na+) (рис. 4b, кривая 2), однако этот эффект был не так выражен в аналогичных опытах с МСК(K+) (рис. 4а, кривая 2) и был сопоставим со снижением потенциала, найденным в опытах без кальция (рис. 4а, кривая 1). Индуцированное кальцием открытие поры во ВММ приводит к снижению ΔΨмито и выходу сафранина О из митохондрий в инкубационную среду, что регистрируется как увеличение флуоресценции этого красителя [23, 29, 30]. Индуцированное кальцием уменьшение ΔΨмито в опытах с МСК(K+) было ингибировано в присутствии АДФ и CsA (рис. 4а, кривая 3), однако эффект последних был заметно слабее в аналогичных экспериментах с МСК(Na+) (рис. 4b, кривая 3).

Существует точка зрения [12], что в цитоплазме миоцитов существует некий микродомен, натриевое пространство с нечеткими границами (Na+ “Fuzzy Space”), тесно примыкающий к саркоплазматическому ретикулуму. Регулирование концентрации Na+ в этом пространстве обеспечивается за счет Na+–Ca2+ обменника и Na+ канала сарколеммы, а также активностью Na+ помпы (Na+/K+-АТФазы). Увеличение поступления Na+ в цитоплазму миоцитов связывают с открытием Na+ канала в плазмолемме [12]. Приток ионов Na+ в это пространство вследствие ишемии может способствовать поступлению Ca2+ в цитоплазму по механизму Na+/Ca2+ обмена, что усиливает кальциевую перегрузку миоцитов [12]. Другими причинами Na+ и Ca2+ перегрузки миоцитов во время ишемии/реперфузии могут быть приток Na+ в миоплазму через Na+/H+ обменник, а также нарушение функции Na+/K+-АТФазы из-за истощения АТФ и увеличение притока Na+ через гемиканалы коннексина [12]. Как известно, результатом ишемии является увеличение концентрации Na+, H+ и Ca2+ в матриксе митохондрий с одновременным увеличением ионной проницаемости внутренней мембраны [4].

При последующей реперфузии концентрация H+ в плазмолемме снижается, а концентрация Ca2+ еще больше возрастает, и в частности за счет Ca2+/Na+ обменника, который транспортирует ионы Na+ в цитопламу с последующим их удалением из цитоплазмы кардиомиоцитов Na+/K+-АТФазой [4]. Ранее было обнаружено, что концентрация Ca2+ в матриксе митохондрий [Ca2+]м сапонин пермеабилизованных кардиомиоцитов дозозависимо уменьшалась при FCCP-индуцированном снижении ΔΨмито и достигала 50% от исходного уровня при полном обнулении потенциала в условиях полного ингибирования Ca2+ унипортера [31]. Снижение ΔΨмито при условии эксперимента [Ca2+]м < [Ca2+]с стимулировало открытие МКЗП и вход ионов Ca2+ в матрикс деэнергизованных митохондрий. Однако в присутствии CsA (игибитора МКЗП) происходило уменьшение [Ca2+]м, что связывали с удалением Ca2+ из матрикса посредством Na+/Ca2+ обмена. При этом ингибирование этого обменника в безнатриевом растворе устраняло этот эффект, и в матриксе сохранялась высокая концентрация Ca2+ [31, 32]. Поскольку наша среда не содержала Na+, то в этом случае Na+/Ca2+ обменник был не активен и концентрация Ca2+ в матриксе МСК(Na+) не могла снижаться в опытах с CsA.

Поглощение митохондриями кальция в основном катализируется расположенным во внутренней мембране кальциевым унипортером, тогда как удаление ионов Ca2+ из матрикса возбудимых тканей осуществляется в основном за счет митохондриального Ca2+/Na+ обменника [13, 31, 33]. При наличии кальция запускается катализируемый циклофилином D процесс структурной перестройки белков, ответственных за открытие МКЗП во внутренней мембране [4]. Этот процесс ингибируется селективным ингибитором этой поры циклоспорином А (CsA) уже в наномолярных концентрациях. При умеренной кальциевой нагрузке органелл МКЗП открывается в низко-проводящем состоянии и ВММ становится проницаемой для небольших неорганических катионов, и в том числе для Ca2+ [35]. В связи с этим ряд исследователей предположили, что открытие такой поры, возможно, является еще одним путем удаления кальция из энергизованных митохондрий [11, 13]. С другой стороны, открытие МКЗП при патофизиологических условиях может служить в качестве пути транспорта Ca2+ в митохондрии [11, 13, 33].

Ранее показали, что скорости дыхания энергизованных NAD-зависимыми субстратами митохондрий в состоянии 3 заметно снижались при уменьшении концентрации ионов K+ в их матриксе [36]. При этом было обнаружено [9, 36, 37] (рис. 1a, 1b, кривые 1), что в результате нагрузки ионами Na+ митохондрий печени и сердца крысы их дыхание в состоянии 3РДНФ снижалось в сравнении с дыханием контрольных органелл (без Na+ нагрузки). Одной из причин такого снижения дыхания может быть уменьшение транспорта электронов в НАДН-убихиноновом участке дыхательной цепи [38]. Индуцированное кальцием снижение дыхания митохондрий в состоянии 3РДНФ (рис. 1a и 1b, кривые 2) и в этом случае было более заметно в опытах с МСК(Na+). Возможно, такой результат может быть связан с тем, что Na+ увеличивал выход Mg2+ и адениновых нуклеотидов из матрикса нагруженных кальцием митохондрий [39 ] .

Влияние избыточной концентрации натрия на амплитуду спонтанных сокращений предсердий лягушки. В наших экспериментах увеличение внеклеточной концентрации Na+ на 30 мМ приводило к положительному инотропному эффекту (сокращения 4 и 5 на рис. 5с). Амплитуда спонтанных сокращений увеличивалась на 22 ± 2% (n = 3, p < 0.05).

Рис. 5.

Влияние ионов Nа+ и Са2+ на спонтанные мышечные cокpащения сегмента предсердий cеpдца лягушки. Регистрация спонтанных сокращений в бескальциевых растворах (a) и при аппликации в растворе с высокой концентрацией натрия – 140 мМ NaCl (с) показана гоpизонтальной линией над миограммами. b – показаны одиночные сокращения, отмеченные черными кружками с цифрами на записях a и с, при другой временной шкале. На панелях а и с показана непрерывная регистрация сокращений.

Причем время нарастания напряжения и время полурелаксации одиночного сокращения практически не изменялись при увеличении внеклеточного натрия. Однако инкубация предсердий в бескальциевом растворе при повышенной концентрации натрия приводила к отрицательному инотропному эффекту. Амплитуда спонтанных сокращений снижалась на 31 ± 7% (n = 3, p < 0.01) (сокращение 4 vs. 7 на рис. 5с) и полностью не восстанавливалась при нормальной концентрации кальция. При этом в бескальциевом растворе инотропный эффект натрия полностью нивелировался (сокращение 2 vs. 6 на рис. 5). Поэтому, мы можем предположить, что инотропный эффект повышенной концентрации натрия может быть обусловлен изменением [Ca2+]i. Частота спонтанных сокращений была практически постоянной как в растворе с высокой концентрацией натрия, так и в бескальциевых растворах, что свидетельствует о том, что ионы натрия практически не влияют на пейсмекерную активность предсердий. Однако в некоторых экспериментах мы наблюдали появление аритмий при инкубации предсердий в растворе с высокой концентрацией натрия. Положительный инотропный эффект в наших экспериментах мог быть обусловлен увеличением [Na+]i, что приводит к увеличению [Сa2+]i. Однако отрицательный инотропный эффект натрия при преинкубации в бескальциевом растворе (рис. 5с) был обнаружен нами впервые и молекулярные механизмы такого снижения неизвестны. Однако нельзя исключить, что одной из причин является нарушение митохондриальных функций.

Заключение. И так, натриевая перегрузка митохондрий сердца крысы привела к увеличению чувствительности этих органелл к действию на них Ca2+, что проявилось в заметном снижении дыхания этих митохондрий в состоянии 3РДНФ, уменьшении ΔΨмито и увеличении их набухания в солевых средах в сравнении с такими же опытами с МСК(K+). Более слабое действие ингибиторов МКЗП (АДФ и CsA) на кальциевые эффекты в экспериментах с МСК(Na+) дает основание предположить, что нагрузка матрикса ионами Na+ облегчает открытие МКЗП во внутренней мембране и делает эту пору менее чувствительной к действию ингибиторов. Наряду с увеличением [Na+]i в цитоплазме это может приводить к усилению кальциевой перегрузки кардиомиоцитов, обусловливая, в свою очередь, еще большее их повреждение при ишемии и последующей реперфузии.

Список литературы

  1. Tanonaka K., Motegi K., Arino T., Marunouchi T., Takagi N., Takeo S. (2012) Possible pathway of Na+ flux into mitochondria in ischemic heart. Biol Pharm Bull 35: 1661–1668. https://doi.org/10.1248/bpb.b12-00010

  2. Gursahani H.I., Schaefer S. (2004) Acidification reduces mitochondrial calcium uptake in rat cardiac mitochondria. Am J Physiol Heart Circ Physiol 287: H2659–H2665. https://doi.org/10.1152/ajpheart.00344.2004

  3. Iwai T., Tanonaka K., Inoue R., Kasahara S., Motegi K., Nagaya S., Takeo S. (2002) Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts. Cardiovasc Res 55: 141–149. https://doi.org/10.1016/s0008-6363(02)00282-1

  4. Saris N.E., Eriksson K.O. (1995) Mitochondrial dysfunction in ischaemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Scand Suppl 107: 171–176. https://doi.org/10.1111/j.1399-6576.1995.tb04353.x

  5. Costa A.D., Quinlan C.L., Andrukhiv A., West I.C., Jabůrek M., Garlid K.D. (2006) The direct physiological effects of mitoK(ATP) opening on heart mitochondria. Am J Physiol Heart Circ Physiol 290: H406–H415. https://doi.org/10.1152/ajpheart.00794.2005

  6. Dos Santos P., Laclau M.N., Boudina S., Garlid K.D. (2004) Alterations of the bioenergetics systems of the cell in acute and chronic myocardial ischemia. Mol Cell Biochem 256–257: 157–166. https://doi.org/10.1023/b:mcbi.0000009866.75225.e2

  7. Tani M., Neely J.R. (1989) Role of intracellular Na+ in Ca2+ overload and depressed recovery of ventricular function of reperfused ischemic rat hearts Possible involvement of H+–Na+ and Na+–Ca2+ exchange. Circ Res 65: 1045–1056. https://doi.org/10.1161/01.res.65.4.1045

  8. Iwai T., Tanonaka K., Inoue R., Kasahara S., Kamo N., Takeo S. (2002) Mitochondrial damage during ischemia determines post-ischemic contractile dysfunction in perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol 34: 725–738. https://doi.org/10.1006/jmcc.2002.2002

  9. Korotkov S.M., Nesterov V.P., Demina I.N. (2009) Effect of sodium load of the matrix on properties of isolated rat heart mitochondria. Dokl Biochem Biophys 424: 56–60. https://doi.org/10.1134/s1607672909010165

  10. Halestrap A.P., Richardson A.P. (2015) The mitochondrial permeability transition: a current perspective on its identity and role in ischaemia/reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol 78: 129–141. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2014.08.018

  11. Bernardi P. (1999) Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability transition. Physiol Rev 79: 1127–1155. https://doi.org/10.1152/physrev.1999.79.4.1127

  12. Barry W.H. (2006) Na “Fuzzy space”: does it exist, and is it important in ischemic injury? J Cardiovasc Electrophysiol 17: S43–S46. https://doi.org/10.1111/j.1540-8167.2005.00396.x

  13. Wei A.C., Liu T., Cortassa S., Winslow R.L., O’Rourke B. (2011) Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine. A Biochim Biophys Acta 1813: 1373–1381. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2011.02.012

  14. Perry C.N., Huang C., Liu W., Magee N., Carreira R.S., Gottlieb R.A. (2011) Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury. PLoS One 6: 1–11. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016288

  15. Pieske B., Houser S.R. (2003) Na+i handling in the failing human heart. Cardiovasc Res 57: 874–886. https://doi.org/10.1016/s0008-6363(02)00841-6

  16. Bers D.M., Despa S. (2006) Cardiac myocytes Ca2+ and Na+ regulation in normal and failing hearts. J Pharmacol Sci 100: 315–322. https://doi.org/10.1254/jphs.cpj06001x

  17. Flesch M., Erdmann E. (2002) Na channel activators as positive inotropic agents for the treatment of chronic heart failure. Cardiovasc Drugs Ther 15: 379–386. https://doi.org/10.1023/a:1013329203750

  18. Coppini R., Ferrantini C., Mugelli A., Poggesi C., Cerbai E. (2018) Altered Ca2+ and Na+ Homeostasis in Human Hypertrophic Cardiomyopathy: Implications for Arrhythmogenesis. Front Physiol 16: 1391. https://doi.org/10.3389/fphys.2018.01391

  19. Goldhaber J.I., Philipson K.D. (2013) Cardiac Sodium-Calcium Exchange and Efficient Excitation-Contraction Coupling: Implications for Heart Disease. Adv Exp Med Biol 961: 355–364. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-4756-6_30

  20. Коротков С.М., Соболь К.В., Шемарова И.В., Фураев В.В., Новожилов А.В., Нестеров В.П. (2018) Действие Nd3+ на кальций-зависимые процессы в изолированных митохондриях сердца крысы и сердечной мышце лягушки. Биол мембраны 35: 200–207. [Korotkov S.M., Sobol K.V., Shemarova I.V., Furaev V.V., Novozhilov A.V., Nesterov V.P. (2019) Effects of Nd3+ on calcium-dependent processes in isolated rat heart mitochondria and frog heart muscle Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology 13: 161–167.] https://doi.org/10.7868/S0233475518030040

  21. Панов А.В. (2015) Практическая митохондриология Новосибирск. [Panov A.V. (2015) Practical mitochondriology Novosibirsk (In Russ)]. https://doi.org/10.13140/2.1.1599.3127

  22. Cоболь К.В., Коpотков C.М., Неcтеpов В.П. (2014) Инотропное действие нового пробиотического продукта на сокращение миокарда Сравнение с эффектами диазоксида. Биофизика 59: 959–966. [Sobol C.V., Korotkov S.M., Nesterov V.P. (2014) Inotropic effect of a new probiotic product on myocardial contractility Comparison with diazoxide. Biophysics 59: 780–785.] https://doi.org/10.1134/S000635091405025X

  23. Korotkov S.M., Emel’yanova L.V., Brailovskaya I.V., Nesterov V.P. (2012) Effects of pinacidil and calcium on isolated rat heart mitochondria. Dokl Biochem Biophys 443: 113–117. https://doi.org/10.1134/S1607672912020147

  24. Biasutto L., Azzolini M., Szabò I., Zoratti M. (2016) The mitochondrial permeability transition pore in AD 2016: An update Biochim. Biophys Acta 1863: 2515–2530. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2016.02.012

  25. Mitchell P., Moyle J. (1969) Translocation of some anions cations and acids in rat liver mitochondria. Eur J Biochem 9: 149–155. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00588.x

  26. Garlid K.D., Paucek P. (2003) Mitochondrial potassium transport: the K+ cycle. Biochim Biophys Acta 1606: 23–41. https://doi.org/10.1016/s0005-2728(03)00108-7

  27. Brierley G.P. (1976) The uptake and extrusion of monovalent cations by isolated heart mitochondria. Mol Cell Biochem 10 (1): 41–63. https://doi.org/10.1007/BF01731680

  28. Waldmeier P.C., Feldtrauer J.J., Qian T., Lemasters J. (2002) Inhibition of the mitochondrial permeability transition by the nonimmunosuppressive cyclosporin derivative NIM811. Mol Pharmacol 62: 22–29. https://doi.org/10.1124/mol.62.1.22

  29. Korotkov S., Konovalova S., Emelyanova L., Brailovskaya I. (2014) Y3+, La3+, and some bivalent metals inhibited the opening of the Tl+-induced permeability transition pore in Ca2+-loaded rat liver mitochondria. J Inorg Biochem 141: 1–9. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2014.08.004

  30. Korotkov S.M., Nesterov V.P., Brailovskaya I.V., Furaev V.V., Novozhilov A.V. (2013) Tl+ induces both cationic and transition pore permeability in the inner membrane of rat heart mitochondria. J Bioenerg Biomembr 45: 531–539. https://doi.org/10.1007/s10863-013-9526-8

  31. Saotome M., Katoh H., Satoh H., Nagasaka S., Yoshihara S., Terada H., Hayashi H. (2005) Mitochondrial membrane potential modulates regulation of mitochondrial Ca2+ in rat ventricular myocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol 288: H1820–1828. https://doi.org/10.1152/ajpheart.00589.2004

  32. Vajda S., Mándi M., Konràd C., Kiss G., Ambrus A., Adam-Vizi V., Chinopoulos C. (2009) A re-evaluation of the role of matrix acidification in uncoupler-induced Ca2+ release from mitochondria. FEBS J 276: 2713–2724. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2009.06995.x

  33. Gunter T.E., Buntinas L., Sparagna G., Eliseev R., Gunter K. (2000.) Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium 28: 285–296. https://doi.org/10.1054/ceca.2000.0168

  34. Ichas F., Mazat J.P. (1998) From calcium signaling to cell death: two conformations for the mitochondrial permeability transition pore Switching from low- to high-conductance state. Biochim Biophys Acta 1366: 33–50. https://doi.org/10.1016/s0005-2728(98)00119-4

  35. Gómez-Puyou A., Sandoval F., Chávez E., Tuena M. (1970) On the role of K+ on oxidative phosphorylation. J Biol Chem 245: 5239–5247.

  36. Глазунов В.В., Коротков С.М. (1997) Дыхание и набухание изолированных митохондрий печени крысы модифицированных замещением калия в их матриксе на натрий. ДАН 356: 551–554. [Glazunov V.V., Korotkov S.M. (1997) Respiration and swelling of isolated rat liver mitochondria, modified by replacing potassium for sodium in their matrix. Dokl Akad Nauk 356: 551–554. (In Russ)].

  37. Gómez-Puyou A., Tuena de Gómez-Puyou M. (1977) Monovalent cations in mitochondrial oxidative phosphorylation. J Bioenerg Biomembr 9: 91–102. https://doi.org/0.1007/BF00745045

  38. Harris E.J., Cooper M.B. (1981) Calcium and magnesium ion losses in response to stimulants of efflux applied to heart, liver and kidney mitochondria. Biochem Biophys Res Commun 103: 788–796. https://doi.org/10.1016/0006-291x(81)90518-0

Дополнительные материалы отсутствуют.