Журнал физической химии, 2022, T. 96, № 6, стр. 895-903

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве объекта исследования использовали личинки GM, выращенные в питомнике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН [15]. Антибактериальные пептиды индуцировались в гемолимфе личинок GM в результате их иммунизации бактериями Escherichia сoli (E.сoli) штамм М17 или несимметричным диметилгидразином [12–14]. Способы получения гемолимфы личинок, подготовки образцов к биохимическим и физико-химическим исследованиям подробно описаны в [13].

Использовали ацетонитрил АсСN (for HPLC, Aldrich, США), 99% трифторуксусную кислоту ТФУ (Alfa Aesar, Германия) и тридистиллированную воду, очищенную на фильтрах Millipore (Milli-P QG, Waters, США).

Анализ и разделение антибактериальных пептидов методом ОФ ВЭЖХ проводили на колонке Zorbax Eclipse XDB-С18, заполненной SiO₂–С18 (Agilent Technologies Inc., США), размером 150 × 4.6 мм (размер зерна 5 мкм, диаметр пор 80 Å, температура 25°С), упакованной в жидкостной хроматограф Agilent 1200 с диодно-матричным детектором и программным обеспечением ChemStation А.10.02. Свободный объем колонки определяли, используя нитрит натрия. Разделение пептидов (объем вводимой пробы 20 мкл) осуществляли в условиях градиентного элюирования при переменном во времени составе бинарного растворителя: А – 0.04% (${v}{\text{/}}{v}$) раствор ТФУ в воде (pH 2.5), B = АсСN. Скорость элюента 0.5 мл мин^–1. Режим градиентного элюирования: 5–80% В в диапазоне 0–30 мин, 80–100% В в диапазоне 30–32 мин. Отбор фракций производили каждую минуту.

Различия в термодинамических величинах удерживания исследуемых веществ оценивали по разности их дифференциальных мольных энергий адсорбции Гиббса: δ(ΔG) = –RTln(k_i$k_{s}^{{ - 1}}$), где k_i и k_s – факторы удерживания исследуемого вещества и стандарта, в качестве которого был выбран пептид Galleria defensin 1.

Масс-спектрометрическое исследование фракций гемолимфы GM методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) проводили с помощью масс-спектрометра UltraFlex II TOF (Bruker Daltoniks, Германия), оснащенного азотным лазером (λ = 337 нм, энергия лазерного излучения 110 кДж, частота импульса до 20 Гц), времяпролетным масс-анализатором с рефлектоном и программным обеспечением для сбора и обработки масс-спектров FlexControl 3.4 и FlexAnalysis 3.4. Ускоряющее напряжение 25 кВ. Масс-спектры получали в режиме регистрации положительных ионов. Изучение фрагментации исходных метастабильных протонированных молекул пептидов в режиме распада за пределами ионного источника (метод МАЛДИ-МС/МС) проводили с помощью масс-спектрометра UltraFlex II TOF-TOF (Bruker Daltoniks), оснащенного неодимовым лазером (λ = 355 нм, энергия лазерного излучения 105 кДж, частота импульса до 20 Гц) и времяпролетным масс-анализатором с рефлектоном. Масс-спектры ионов-продуктов регистрировали методом LIFТ (Bruker Daltonics): начальное напряжение и ускоряющая разность потенциалов составляли 7 и 28 кВ, соответственно. Точность измеренных моноизотопных масс [M + H]⁺ в режиме рефлектрона составляла 0.007%, точность измеренных усредненных масс в линейном режиме 0.05–0.1%, точность измеренных масс фрагментов 1–2 Да (0.02–0.1%). Образцы для МАЛДИ готовили на мишенях AnchorChip с матрицей HCCA (α-циано-4-гидроксикоричная кислота) от Bruker Daltoniks (Германия).

Использовали поисковую систему Mascot [16] для определения первичной структуры обнаруженных пептидов на основании информации, получаемой при их диссоциации [17]. Поиск проводили по массам метастабильных протонированных молекул пептидов [M + H]⁺, полученным в работах [12–14] и присутствующим в базе данных NCBI [18]. Первичную структуру неизвестных пептидов определяли на основании результатов процедуры секвенирования de novo [19].

Для расчетов теоретических времен удерживания пептидов t_R использовали алгоритмы SSRCalc [2] и BioLCCC [9].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В табл. 1 приведены антибактериальные пептиды, идентифицированные методом МАЛДИ-МС в составе гемолимфы GM [12–14]. В соответствии с аминокислотными последовательностями и структурными особенностями, эти пептиды относят к трем разным классам: 1) линейные α-спиральные пептиды, не содержащие остатков цистеина (например, цекропины); 2) цистеинстабилизированные пептиды, содержащие дисульфидные мостики (например, дефензины); 3) пролинсодержащие пептиды со сверхпредставлением пролина и/или глициновых остатков. По данным антимикробных тестов [13, 14], эти пептиды обладают антибактериальной активностью по отношению к грамотрицательным бактериям E.сoli, а также индуцируются в ответ на воздействие токсичного несимметричного диметилгидразина.

Результаты экспериментального определения времен удерживания t_R пептидов на сорбенте SiO₂–С18 приведены в табл. 2, 3. Кроме данных пептидов, исследованы их фрагменты и неизвестные пептидные компоненты массой 1–3 кДа, обнаруженные в составе гемолимфы иммунизированных личинок GM и идентифицированные масс-спектрометрически [12–14]. Образование новых пептидных продуктов, обладающих антимикробной активностью, связывают как с развитием иммунного ответа организма GM на воздействие бактерий и токсикантов, так и с деструкцией пептидов под их воздействием. Экспериментальные значения t_R пептидных продуктов сопоставлены с результатами расчетов, использующих анализ параметров гидрофобности пептидов (модель SSRCalc) и эффективных энергий адсорбции аминокислотных остатков и компонентов растворителя (модель BioLCCC). Для всех пептидов рассчитаны факторы удерживания k относительно стандартов – Galleria defensin 1 или Nisin и определены дифференциальные мольные энергии Гиббса, характеризующие процесс разделения. Обнаружено, что экспериментальные значения t_R антибактериальных пептидов растут с увеличением их массы М и количества N аминокислотных остатков в цепи при переходе от пептида № 3 (N 37) к пептидам № 5 и 6 (N 43, 42) с линейной структурой. Значения t_R, рассчитанные с использованием алгоритма BioLCCC, растут в той же последовательности, что и экспериментальные, но их значения сильно отличаются между собой. Наиболее корректно эта модель описывает поведение пептидов №№ 2, 8 и их фрагментов (2f, 8f). Модель SSRCalc практически идеально предсказывает хроматографическое поведение пептида № 5 и несколько хуже – пептидов № 2, 3, 6, 8. Обе модели смогли предсказать аномальное поведение пептида № 2 (N 39), который выходит из хроматографической колонки позже массивного пептида № 8 (N 60).

Модель SSRCalc объясняет сильное удерживание на SiO₂-С18 пептида № 2 его высокой относительной гидрофобностью Р, так как в первичной структуре цекропинов содержится более половины гидрофобных остатков (табл. 1). В свою очередь, слабое удерживание пептида № 8 модель BioLCCC объясняет ионизацией в кислой среде его N-концевой аминогруппы (лизин, К) и электростатическим отталкиванием от гидрофобной поверхности твердой фазы. У цекропина № 2 в данной среде стандартная энергия взаимодействия с поверхностью концевых –СООН-групп (E и D, аспарагиновая и глутаминовая кислоты) будет достаточно большой.

Дефензины GM №№ 4 и 5 имеют одинаковое количество аминокислотных остатков (N 43), расположенных в одинаковой последовательности, и отличаются только одним звеном: S (серин) у № 4 и R (аргинин) у № 5. Модели SSRCalc и BioLCCC прогнозируют примерно одинаковые значения t_R для этих пептидов (табл. 2). Но их экспериментальные значения t_R отличаются между собой на 1.4 мин: первым из колонки выходит дефензин № 5 с 2 дисульфидными связями в первичной структуре. Его значение t_R почти идеально предсказывает модель SSRCalc. Пептид № 4, имеющий три дисульфидные связи, которые усиливают его взаимодействие с гидрофобной поверхностью сорбента, выходит позже, и его значение t_R не удается правильно предсказать ни одной моделью.

При добавлении 0.04% ТФУ в AcCN при градиентном элюировании пептидных смесей в течение 40 мин порядок выхода пептидов из колонки в целом сохраняется при увеличении времени удерживания. За исключением S-содержащих дефензина и низина, а также цекропинов № 1, 2 экспериментальные значения t_R пептидов растут с увеличением длины их цепи (табл. 3). Наблюдаемая инверсия выхода пептидов №№ 2 и 8, по сравнению с данными табл. 2, связана с изменением состава и кислотности элюента, влияющей, как было отмечено выше, на степень ионизации этих пептидов.

Прогнозы значений t_R (SSRCalc и BioLCCC) хорошо сбываются для пептидов №№ 3 и 6, но обе модели неадекватно прогнозируют удерживание пептидов №№ 2, 8, 10. Особенно далеки от истины прогнозы для этих пептидов модели BioLCCC. Модель SSRCalc в этой системе работает несколько лучше, так как дает меньшие ошибки в прогнозах удерживания пептидов №№ 1, 2, 7, 8, 10. Наличие трех и двух дисульфидных связей в структуре дефензина и низина, отличает характер их взаимодействия с неполярной поверхностью октадецилсиликагеля от других пептидов, не содержащих этих связей.

В табл. 4 приведены значения относительной гидрофобности Р исследованных пептидов, рассчитанные с помощью алгоритма SSRCalc. Крупные молекулы фермента лизоцима (№ 9, N 121), белка гемолимфы 27 кДа (№ 11, N 219) и аполипофорина-3 (№ 10, N 186), обнаруженные в гемолимфе иммунизированных личинок GM, удерживаются на SiO₂–С18 лишь немного дольше, чем небольшие пептиды с N 39, 42, 60. Сравнительно небольшая величина относительной гидрофобности этих белков обусловлена ионизацией в кислой среде ряда их аминокислотных остатков и превращением пептидов в многозарядные катионы, энергия взаимодействия которых с гидрофобной поверхностью невелика.

Использование для расчетов алгоритма предсказания вторичной структуры антибактериальных пептидов HyperChem 6.0 (опция Sequence Editor [20]) позволило объяснить эту аномалию тем, что объем биологически активной конформации молекулы пептида № 11 с учетом радиусов Ван-дер-Bаальса меньше объема молекулы пептида № 10 (табл. 5). Уменьшение объема приводит к уменьшению площади гидрофобного контакта молекулы с поверхностью неподвижной фазы и, как следствие, к уменьшению фактора удерживания. Обнаруженная зависимость факторов удерживания пептидов от их поляризуемости и ван-дер-ваальсовых объемов (табл. 5) свидетельствует о превалирующем вкладе в процесс адсорбции исследуемых пептидов дисперсионных взаимодействий с гидрофобной поверхностью.

Как отмечалось выше, алгоритм SSRCalc сравнительно лучше предсказывает удерживание небольших пептидов, поэтому он был использован для расчета параметров удерживания индуцированных пептидов массой 1–3 кДа, ранее не представленных в базах данных. Экспериментальное исследование данных пептидов позволило получить совокупность хроматографических и масс-спектрометрических характеристик, отражающих их уникальные физико-химические свойства. В табл. 6 приведены результаты de novo секвенирования, т.е. установления аминокислотной последовательности некоторых неизвестных пептидов, предсказанные на основе анализа масс-спектров их фрагментации.

Результаты такой идентификации носят вероятностный характер, так как на основании данных МАЛДИ-МС/МС для ионов с одинаковой массой можно предположить несколько разных аминокислотных последовательностей (табл. 6). Выбрать единственно верную последовательность можно путем сопоставления прогнозируемого и экспериментально измеренного времени удерживания каждого пептида. Жирным шрифтом в табл. 6 выделены структуры, хроматографические параметры которых наиболее соответствуют экспериментальным данным. Таким образом, использование хроматографической информации позволяет из нескольких кандидатов на возможные аминокислотные последовательности, полученные из спектров МАЛДИ-МС/МС, выбрать те, которые наиболее надежно описывают аминокислотный состав пептида.

Важной характеристикой, подтверждающей достоверность масс-спектрометрической идентификации новых пептидов, служит наличие зависимости порядка их элюирования от физико-химических характеристик (например, относительной гидрофобности Р и поляризуемости α), теоретически рассчитанных для полученных последовательностей аминокислот (рис. 1). Для короткоцепочечных пептидов, проявляющих антибактериальную активность против E. сoli, получены линейные зависимости: $\lg k$ = 1.796$\lg P$ – ‒ 0.268 (коэффициент корреляции r² = 0.963) и k = 51.290α – 95.369 (r² = 0.975). Они характеризуют потенциальную возможность данных пептидов удерживаться на SiO₂-С18 в соответствии со своей относительной гидрофобностью и поляризуемостью.

Рис. 1.

Зависимости рассчитанных значений относительной гидрофобности Р (а) и поляризуемости α (б) индуцированных пептидов Galleria mellonella от фактора удерживания k.

Как уже отмечалось, исследованные пептиды, проявляющие антибактериальную активность, имеют множество различных функциональных групп и принадлежат к трем разным классам в соответствии с их аминокислотными последовательностями и структурными особенностями. Ни одна из использованных моделей не может предсказать разделение всех данных пептидов, так как их удерживание определяется совокупностью различных факторов, отражающих взаимодействия на границе раздела фаз (заряд и конформация молекул, их гидрофобность, поляризуемость, объем, дипольный момент и др.), и преобладанием какой-либо составляющей, связанной с особенностями первичной структуры пептидов. На рис. 2 сопоставлены экспериментальные и рассчитанные разными методами времена удерживания некоторых антибактериальных пептидов, обнаруженных в составе иммунизированной гемолимфы GM [14].

Рис. 2.

Сопоставление экспериментальных и рассчитанных времен хроматографического удерживания антибактериальных пептидов Galleria mellonella; а – алгоритм SSRCalc, б – алгоритм BioLCCC.

Коэффициенты корреляции между экспериментальными и рассчитанными значениями t_R, полученными методами SSRCalc (пептиды массой 1–4 кДа и №№ 2, 5, 8, 10) и BioLCCC (пептиды массой 1–4 кДа и №№ 8, 8f, 2, 2f) составляют соответственно 0.887 и 0.775. Ни один из рассмотренных алгоритмов полностью не описывает разделения всех антимикробных пептидов GM, по-видимому, вследствие того, что взаимодействие пептидов с силикагелем С18 является не только дисперсионным. Наибольшие погрешности аппроксимации соответствуют пептидам, структура которых стабилизирована дисульфидными мостиками, а также пептидам с незащищенными концевыми группами, так как вклады этих полярных функциональных групп в баланс гидрофильных и гидрофобных свойств наиболее существенны. Аддитивная схема расчета SSRCalc позволяет добиться приемлемой надежности прогнозирования удерживания небольших пептидов массой 1–7 кДа. Полученные корреляционные зависимости могут стать основой для разработки способа идентификации неизвестных антибактериальных пептидов. Они служат определяющим фактором при оценке надежности и достоверности идентификации пептидов для проведения de novo секвенирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассмотренные модели прогнозирования хроматографического разделения пептидов SSRCalc и BioLCCC являются упрощенными моделями, а предложенный подход – первым приближением, так как многие детали строения реальной структуры пептидов оказываются за рамками рассмотрения. Кроме того, данные теоретические модели строятся в предположении об идеальности модели адсорбирующейся цепи, т.е. о локальности адсорбционного взаимодействия аминокислотного остатка с поверхностью, происходящего при замене контакта растворитель–поверхность на контакт аминокислотный остаток–поверхность. Ни один из использованных алгоритмов полностью не описывает разделения всех антимикробных пептидов GM, так как данные соединения относятся к разным классам в соответствии с их аминокислотными последовательностями и структурными особенностями. Их удерживание на гидрофобной поверхности определяется совокупностью множества факторов, отражающих взаимодействия на границе раздела фаз. Теоретические модели никак не учитывают, что реальные пептиды при определенных условиях хроматографического эксперимента содержат заряженные аминокислотные остатки, что в белках могут существовать вторичные структуры типа спиралей, шпилек или цепей –S–S–, которые вносят свой вклад и искажают теоретические зависимости. Наибольшие погрешности аппроксимации соответствуют пептидам с незащищенными концевыми группами, так как вклады этих полярных функциональных групп в баланс гидрофильных и гидрофобных свойств наиболее существенны, а взаимодействие таких пептидов с силикагелем С18 является не только дисперсионным. Экспериментальные результаты хроматографического разделения антимикробных пептидов иммунизированной гемолимфы GM сравнительно лучше предсказывает модель SSRCalc, которая позволяет добиться практически приемлемой надежности прогнозирования удерживания пептидов массой 1–7 кДа.

Накопление физико-химических данных по удерживанию пептидов в режиме ОФ ВЭЖХ позволит в дальнейшем корректировать имеющиеся модели физико-химического поведения этих соединений, создавать новые модели, обосновывать оптимальные условия разделения смесей, а в сочетании методов ОФ ВЭЖХ с МАЛДИ-МС проводить идентификацию компонентов сложных смесей пептидов.