1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Журнал физической химии
  4. T. 96, № 6, 2022

Журнал физической химии, 2022, T. 96, № 6, стр. 828-833

Равновесия в системе бычий сывороточный альбумин–пиридоксаль-5-фосфат 4-гидроксибензоилгидразон–ион La3+

Д. Н. Яруллин a, М. Н. Завалишин a, В. А. Шарнин a, Г. А. Гамов a, *

a Ивановский государственный химико-технологический университет
Иваново, Россия

* E-mail: ggamov@isuct.ru

Поступила в редакцию 08.11.2021
После доработки 08.11.2021
Принята к публикации 10.11.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

В настоящей работе спектрофлуориметрическим методом исследовано взаимодействие в растворе между гидразоном, образованным пиридоксаль-5-фосфатом и гидразидом 4-гидроксибензойной кислоты, с бычьим сывороточным альбумином. Двумя методами рассчитана константа связывания гидразона с белком, обсуждаются особенности расчетных методов. Спектрофотометрически изучен раствор, в котором присутствуют гидразон, ионы La3+ и бычий сывороточный альбумин. Показано, что увеличение концентрации белка приводит к постепенному разрушению комплекса лантан(III)-гидразон за счет связывания лиганда с белком.

Ключевые слова: пиридоксаль-5-фосфат, гидразон, бычий сывороточный альбумин, константа равновесия

Пиридоксаль (PL) и пиридоксаль-5-фосфат (PLP) – формы витамина В6, коферменты, принимающие участие в большом количестве разнообразных биохимических реакций, включая трансаминирование, дезаминирование и рацемизацию аминокислот [1]. PLP-зависимые ферменты также важны для биосинтеза жирных кислот, нейротрансмиттеров и связывания активных форм кислорода [2, 3]. Пониженный уровень форм витамина В6 может быть связан с различными патологическими состояниями, поэтому концентрация пиридоксаля и пиридоксаль-5-фосфата в плазме важна с диагностической точки зрения [4].

Благодаря наличию альдегидной группы в составе молекулы, PL и PLP способны достаточно легко вступать в реакцию сочетания с гидразидами, образуя гидразоны. Они, в свою очередь, также обладают высокой биологической активностью, преимущественно вследствие способности связывать такие жизненно важные ионы d-элементов как Fe2+, Fe3+, Cu2+ в устойчивые хелатные комплексы. Так, например, ряд гидразонов пиридоксаля подавляет ангиогенез в опухолях за счет комплексообразования с ионами железа [5, 6]. Комплексы меди(II) с гидразонами, образованными пиридоксалем и гидразидами с фенольной группой, способны имитировать активность фермента супероксиддисмутазы, играющего важную роль в защите организма от образующихся кислородных радикалов [7].

Учитывая потенциальную биологическую значимость как свободных гидразонов, так и их комплексов с различными металлами, важным становится исследование взаимодействия этих соединений с белками [8]. В настоящей работе мы изучили связывание с бычьим сывороточным альбумином (БСА) гидразона, образованного пиридоксаль-5-фосфатом и гидразидом 4-гидроксибензойной кислоты, аналог которого (с пиридоксалем) показал высокую антиоксидантную активность [7]. Кроме того, проанализировали взаимодействия в системе, содержащей белок, гидразон и ионы лантана(III), учитывая, что комплексообразование La3+ с этим соединением PLP уже было изучено [9].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Процедура синтеза гидразона PLP и гидразида 4-гидроксибензойной кислоты (в дальнейшем PLP-4OH, рис. 1) описана в [9]. Бычий сывороточный альбумин (Sigma Aldrich, США) и LaCl3 ⋅ 7H2O (Редкийметалл.рф, Россия) использовались без предварительной очистки. Заявленная производителем чистота белка составляла >98%, а соли лантанида – 99.2%.

Рис. 1.

Формула гидразона, образованного пиридоксаль-5-фосфатом и гидразидом 4-гидроксибензойной кислоты.

Растворы готовились на бидистиллированной воде (κ = 3.6 мкСм/см, pH 6.6). Использовались два буферных раствора с рН 7.4: фосфатный, приготовленный из Na2HPO4 ⋅ 12H2O и NaH2PO4 ⋅ ⋅ 2H2O (Реахим, Россия), и ТРИС-HCl, приготовленный из трис(гидроксиметил)аминометана (Sigma, США) и стандартизованной соляной кислоты. Стоковый раствор белка в фосфатном или ТРИС-HCl буфере хранился в темном месте при 4оС, причем, концентрация БСА определялась каждый раз перед основными экспериментами спектрофотометрически с использованием литературного значения молярного коэффициента светопоглощения ε280 = 43824 [10].

Взаимодействие гидразона PLP-4OH с БСА исследовали на спектрофлуориметре Solar CM2203 (Белоруссия), возбуждая флуоресценцию белка при 270 нм и измеряя испускание при 280–400 нм. Ширина оптической щели возбуждения составляла 2 нм, испускания – 5 нм. Использовались стандартные кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 1 см. Раствор БСА в фосфатном буфере (pH 7.4) концентрацией 1.18 × × 10–5 либо 5.52 × 10–6 моль/л и объемом 2.5 мл титровали 10 добавками буферного раствора гидразона концентрацией 0.0005–0.0006 моль/л. Объем каждой добавки составлял 10 мкл.

В соответствии с рекомендациями [11, 12] проводилась корректировка результатов спектрофлуориметрического титрования на эффект внутреннего фильтра по уравнению:

(1)
${{F}_{{{\text{corr}}}}} = {{F}_{{{\text{obs}}}}} \times {{10}^{{0.5({{A}_{{{\text{ex}}}}} + {{A}_{{{\text{em}}}}})}}}.$

Константы связывания гидразона с белком рассчитывались при помощи программного обеспечения KEV [13], а также недавно предложенного Е.А. Ширшиным с соавторами способа [14].

Взаимодействие БСА с комплексом La3+ с PLP-4OH в буферном растворе ТРИС-HCl (фосфатный буфер в системах, содержащих ионы лантанидов(III), неприменим из-за образования малорастворимых фосфатов Ln3+) исследовали спектрофотометрически на приборе Shimadzu UV1800 (США) в диапазоне длин волн 200–500 нм и оптической плотности 0–2 ед. Использовались стандартные кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 1 см. Раствор объемом 2.7 мл, содержащий гидразон концентрацией 0.8 × 10–5–1.0 × 10–4 моль/л и La3+ концентрацией 5.3 × 10–5–5.6 × 10–4 моль/л, титровали 10 добавками раствора БСА концентрацией 0.0020–0.0021 моль/л. Объем каждой добавки составлял 20 мкл. Результаты эксперимента обрабатывались при помощи программного обеспечения KEV [13].

Известно, что ТРИС, обладающий аминогруппой, способен образовывать основание Шиффа с PLP [15], а реакции образования гидразонов PLP обратимы [16–18]. Следовательно, при длительном пребывании гидразона в буферном растворе с относительно высокой концентрацией ТРИС, равновесие смещается в сторону образования имина PLP-ТРИС. По этой причине растворы использовались в течение получаса после приготовления.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Скорректированные спектры флуоресценции БСА концентрацией 1.18 × 10–5 и 5.52 × 10–6 моль/л в присутствии возрастающего количества гидразона PLP-4OH приведены на рис 2а, б.

Рис. 2.

Скорректированные на эффект внутреннего фильтра спектры эмиссии бычьего сывороточного альбумина: а) С0(БСА) = 1.18 × 10–5 моль/л; б) С0(БСА) = 5.52 × 10–6 моль/л при добавлении гидразона PLP-4OH: а) С0(PLP-4OH) = 5.996 × × 10‒4 моль/л; б) С0(PLP-4OH) = 5.091 × 10–4 моль/л. В обоих случаях начальный объем 2.5 мл, 10 добавок титранта по 10 мкл.

Анализ уменьшения интенсивности флуоресценции БСА при помощи уравнения Штерна–Фольмера [11, 12]:

(2)
$\frac{{{{F}_{0}}}}{F} = 1 + {{k}_{q}}{{\tau }_{0}}[Q],$
(где F0 и F – интенсивности флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя соответственно; kq – бимолекулярная константа скорости тушения; τ0 – время затухания флуоресценции в отсутствие тушителя; [Q] – концентрация тушителя) дает величину kq порядка 1013 с учетом времени затухания флуоресценции τ0 = 10 нс [11]. Это значительно выше, чем 2 × 1010, указанное как предельное значение для динамического тушения [11], следовательно, можно предположить связывание малой молекулы с белком.

Константу связывания гидразона PLP-4OH с БСА рассчитывали двумя способами. Во-первых, расчет проводился при помощи программного обеспечения KEV [13], отыскивающего минимум суммы квадратов разностей между экспериментальными результатами и рассчитанными при разных значениях оптимизируемых параметров. Кроме того, мы использовали метод, предложенный авторами [14] и разработанное ими же программное обеспечение [19]. Суть идеи [14] заключается в модификации уравнения Штерна–Фольмера таким образом, что член F0/F зависит от общей концентрации флуорофора и тушителя, без применения необоснованных допущений о равенстве общей и равновесной концентраций тушителя, а также о всегда нулевом относительном квантовом выходе продукта взаимодействия. При этом, для того, чтобы воспользоваться уравнением [14] и программным обеспечением [19], необходимо получить как минимум две серии экспериментальных данных, в которых бы различались общие концентрации флуорофора. Несмотря на то, что KEV позволяет выполнить надежный расчет всего по одной экспериментальной серии, мы не считаем, что более трудозатратный способ [14] хуже применим при исследовании равновесий “малая молекула–белок”. Для того, чтобы удостовериться в надежности результатов, вычисляемых при помощи подхода максимального правдоподобия [13], имеет смысл повторение опытов в разных концентрационных условиях. Величины оптимизируемых параметров при этом должны возвращаться одни и те же.

Более важной проблемой может оказаться выбор концентраций флуофора таким образом, чтобы оставаться в концентрационном диапазоне, в котором, с одной стороны, не превышены пределы выполнения аддитивного закона для измеряемой величины, а с другой, флуорофора все еще достаточно для надежного измерения экспериментальных данных. Например, при снижении концентрации БСА с 11.8 мкмоль/л, использованной в первой серии (рис. 2а) до 1.18 мкмоль/л в начале титрования интенсивность флуоресценции составляла бы всего лишь порядка 25–27 единиц, дополнительно убывая в дальнейшем с ходом титрования.

Однако, метод [14] вполне надежно может быть применен и при всего лишь двукратной разнице в общей концентрации белка в двух разных сериях, получившейся в нашем эксперименте. Так, по данным рис. 2а KEV возвращает величину константы $\lg \beta $ = 5.12 ± 0.11 с величиной Fпродукт/Fбелок = 0.43%, по данным рис. 2б – $\lg \beta $ = 5.13 ± 0.03 с величиной Fпродукт/Fбелок = = 0.38%, а расчет в программе [19] дает $\lg \beta $ = 5.11 и Fпродукт/Fбелок = 0.30% (рис. 3). При этом, метод [14] дает информацию, что у белка единственный сайт связывания. Расчеты в KEV, при которых тестировались стехиометрические модели с коэффициентом перед гидразоном больше единицы, а также две параллельные реакции образования продуктов белок : гидразон = 1 : 1 и 1 : 2 подтверждают этот вывод. Все модели, кроме единственной реакции между PLP-4OH и БСА в соотношении 1 : 1, оказались неадекватны и были отвергнуты.

Рис. 3.

Результаты обсчета данных рис. 2 при помощи программного обеспечения [19].

Введение в систему, содержащую белок и гидразон, ионов La3+ существенно увеличивает количество параллельных равновесий в растворах. Сывороточные альбумины склонны к связыванию большого количества ионов d-элементов (например, до 14 катионов Zn2+ на 1 молекулу белка [20]); вероятно, это справедливо и для ионов лантанидов(III). Как было выше показано (рис. 2а, б), БСА связывает и свободный лиганд. Устойчивость комплексов La3+ с гидразоном PLP-4OH в буферном растворе ТРИС-HCl относительно невелика [9], следовательно, добавление белка к смеси гидразона и катиона будет приводить к смещению равновесия комплексообразования в сторону исходных продуктов. Наконец, возможно, хотя и маловероятно присоединение металлокомплекса как единого целого к белку.

Следовательно, происходящие при титровании раствором БСА смеси гидразона и ионов La3+ изменения в электронном спектре поглощения (рис. 4) необходимо интерпретировать с учетом следующих равновесий:

(3)
${{{\text{H}}}^{ + }} + {\text{ТРИС}} = {\text{НТРИ}}{{{\text{С}}}^{ + }};\quad \lg \beta = 8.09\;[21],$
(4)
${\text{L}}{{{\text{a}}}^{{3 + }}} + {\text{ТРИС}} = {\text{LaТРИ}}{{{\text{С}}}^{{3 + }}};\quad \lg \beta = 2.53\;[21],$
(5)
$\begin{gathered} {\text{L}}{{{\text{a}}}^{{3 + }}} + {\text{HOH}} = {\text{LaO}}{{{\text{H}}}^{{2 + }}} + {{{\text{H}}}^{ + }}; \\ \lg \beta = --9.06\;[22,\;{\text{p}}.\;257], \\ \end{gathered} $
(6)
$\begin{gathered} {\text{L}}{{{\text{a}}}^{{3 + }}} + 2{\text{HOH}} = {\text{La}}({\text{OH}})_{2}^{ + } + 2{{{\text{H}}}^{ + }}; \\ \lg \beta = --17.86\;[22,\;{\text{p}}.\;259], \\ \end{gathered} $
(7)
$\begin{gathered} {\text{L}}{{{\text{a}}}^{{3 + }}} + 3{\text{HOH}} = {\text{La}}{{({\text{OH}})}_{3}} + 3{{{\text{H}}}^{ + }}; \\ \lg \beta = --27.23\;[22,\;{\text{p}}.\;259], \\ \end{gathered} $
(8)
$\begin{gathered} {\text{L}}{{{\text{a}}}^{{3 + }}} + 2{\mathbf{PLP}}{\text{ - }}{\mathbf{4OH}}{\kern 1pt} ' = {\text{La}}{{({\mathbf{PLP}}{\text{ - }}{\mathbf{4OH}}{\kern 1pt} ')}_{2}}; \\ \lg \beta {\kern 1pt} ' = 10.48\;[9], \\ \end{gathered} $
(9)
$\begin{gathered} {\text{PLP - }}4{\text{OH}} + {\text{БСА}} = {\mathbf{PLP}}{\text{ - }}{\mathbf{4OH}}{\text{ - БСА}}; \\ \lg \beta = 5.12\;({\text{эта}}\;{\text{работа}}), \\ \end{gathered} $
(10)
${\text{L}}{{{\text{a}}}^{{3 + }}} + {\text{БСА'}} = {\text{LaБС}}{{{\text{А}}}^{{3 + }}};\quad \lg \beta {\kern 1pt} '\;{\text{неизвестна}},$
(11)
$\begin{gathered} {\text{L}}{{{\text{a}}}^{{3 + }}} + {\text{БСА'}} + 2{\mathbf{PLP}}{\text{ - }}{\mathbf{4OH}}{\kern 1pt} ' = \\ = {\text{La}}{{({\mathbf{PLP}}{\text{ - }}{\mathbf{4OH}}{\kern 1pt} ')}_{2}}{\text{БСА}}; \\ \lg \beta {\kern 1pt} '\;{\text{неизвестна}}. \\ \end{gathered} $
Рис. 4.

Электронные спектры поглощения раствора гидразона PLP-4OH, его смеси с ионами La3+ и раствором БСА; С0(PLP-4OH) = 8.061 × 10–5 моль/л, С0(La3+) = 5.367 × 10–5 моль/л, С0(БСА) = 2.092 × × 10‒5 моль/л. Начальный объем 2.7 мл, 9 добавок БСА по 20 мкл.

Символ ' означает, что рассматривается совокупность всех возможных протонированных форм вещества при данной рН среды.

Сравнивая спектр свободного лиганда (рис. 4, пунктир) со спектром после добавления ионов La3+, можно видеть понижение интенсивности пика с максимумом при 300–310 нм и усиление светопоглощения при 391 нм. Последующее добавление белка, напротив, приводит к некоторому снижению оптической плотности при 391 нм и незначительному увеличению интенсивности светопоглощения при 312 нм. Это может означать разложение металлокомплекса La3+–PLP-4OH и связывание высвобождающихся катионов и молекул лиганда белком. При этом, спектр смеси становится более похожим на электронный спектр поглощения свободного лиганда. Расчеты, проведенные в KEV [13], показывают, что наиболее адекватной моделью является набор реакций (3)–(9) либо (3)–(10); использование этой модели возвращает значение константы связывания гидразона с БСА $\lg \beta $ = 4.99 ± 0.65, что близко к величине, определенной из спектрофлуориметрических данных. В то же время, процесс (10) не оказывает влияния на расчет; при титровании БСА раствором LaCl3 не наблюдалось изменений в электронном спектре поглощения белка. Следовательно, на основании данных спектрофотометрии невозможно утверждать точно, связываются ли ионы лантана(III) с бычьим сывороточным альбумином, а если связываются – какова константа этого равновесия. Лишь одно можно сказать наверняка: если данный процесс все же протекает, то его константа не может превышать $\lg \beta $ (9) – в противном случае, комплекс разрушался бы в более значительной степени, чем наблюдается по экспериментальным спектрам.

Таким образом, в настоящей работе исследовано взаимодействие в растворе пиридоксаль-5-фосфат 4-гидроксибензоилгидразона с бычьим сывороточным альбумином. Добавление гидразона к белку понижает интенсивность флуоресценции БСА, что не может быть объяснено динамическим тушением. Наиболее вероятной причиной наблюдаемого понижения интенсивности люминесценции является связывание лиганда с белком, приводящее к изменению конформации последнего и, как следствие, микроокружения остатков флуоресцентных аминокислот. Величина $\lg \beta $, рассчитанная двумя методами по спектрофлуориметрическим данным, составляет 5.11–5.13. Показано, что добавление БСА к раствору, содержащему гидразон PLP-4OH и ионы La3+, приводит к разрушению металлокомплекса за счет связывания лиганда с белком.

Теоретическая часть работы и спектрофотометрические измерения выполнены в НИИ термодинамики и кинетики химических процессов Ивановского государственного химико-технологического университета в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования (проект FZZW-2020-0009). Спектрофлуориметрический эксперимент выполнен при поддержке Совета по грантам при Президенте Российской Федерации (проект СП-1556.2021.4). При этом использованы ресурсы Центра коллективного пользования научным оборудованием ИГХТУ (при поддержке Минобрнауки России, соглашение № 075-15-2021-671).

Список литературы

  1. Percudani R., Peracchi A. // EMBO Rep. 2003. V. 4. P. 850. https://doi.org/10.1038/sj.embor.embor914

  2. Havaux M., Ksas B., Szewczyk A. et al. // BMC Plant Biol. 2009. V. 9. Article number 130. https://doi.org/10.1186/1471-2229-9-130

  3. Geng M., Saito H., Katsuki H. // Neurosci. Res. 1995. V. 24. P. 61. https://doi.org/10.1016/0168-0102(96)81279-X

  4. Jun Y.W., Hebenbrock M., Kool E.T. // Chem. Commun. 2020. V. 56. P. 317. https://doi.org/10.1039/C9CC08458D

  5. Richardson D.R., Milnes K. // Blood. 1997. V. 89 (8). P. 3025.https://doi.org/10.1182/blood.V89.8.3025

  6. Chen X., Li H., Luo H. et al. // Pharmacology. 2019. V. 104. P. 244. https://doi.org/10.1159/000501630

  7. Siqueira J.D., Pellegrin S.F., dos Santos S.S. et al. // J. Inorg. Biochem. 2020. V. 204. Article number 110950. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2019.110950

  8. McFedries A., Schwaid A., Saghatelian A. // Chem. & Biol. 2013. V. 20. P. 667. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2013.04.008

  9. Гамов Г.А., Завалишин М.Н. // Журн. неорган. химии. 2021. Т. 66. № 10. С. 1474. 10.31857/S0044457X21100056 (Gamov G.A., Zavalishin M.N. // Russ. J. Inorg. Chem. 2021. V. 66. № 10. P. 1561. https://doi.org/10.1134/S0036023621100053)

  10. ThermoScientific. Extinction Coefficients: A guide to understanding extinction coefficients, with emphasis on spectrophotometric determination of protein concentration (https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/Application-Notes/TR0006-Extinction-coefficients.pdf).

  11. van de Weert M., Stella L. // J. Mol. Struct. 2011. V. 998 (1–3). P. 144. https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2011.05.023

  12. van de Weert M. // J. Fluoresc. 2010. V. 20. P. 625. https://doi.org/10.1007/s10895-009-0572-x

  13. Meshkov A.N., Gamov G.A. // Talanta. 2019. 198. P. 200. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.01.107

  14. Gayer A.V., Yakimov B.P., Budylin G.S., Shirshin E.A. // J. Biomed. Photon. Eng. 2020. V. 6. № 2. Article number 3365. https://doi.org/10.18287/JBPE20.06.020303

  15. Mitra J., Metzler D.E. // Biochim. Biophys. Acta – Gen. Subj. 1988. V. 965 (1). P. 93. https://doi.org/10.1016/0304-4165(88)90156-0

  16. Echevarria-Gorostidi G.R., Basagoitia A., Pizarro E. et al. // Helv. Chim. Acta. 1998. V. 81. P. 837. https://doi.org/10.1039/P29890001617

  17. Echevarria G.R., Basagoitia A., Santos J.B., Blanco F.G. // J. Mol. Cat. A. 2000. V. 160. P. 209. https://doi.org/10.1016/S1381-1169(00)00266-1

  18. Гамов Г.А., Завалишин М.Н., Усачева Т.Р., Шарнин В.А. // Журн. физ. химии. 2017. Т. 91. № 5. С. 800. https://doi.org/10.7868/S004445371705011910.7868/S0044453717050119 (Gamov G.A., Zavalishin M.N., Usacheva T.R., Sharnin V.A. // Russ. J. Phys. Chem. A. 2017. V. 91. № 5. P. 843.https://doi.org/10.1134/S0036024417050107).

  19. http://lid.phys.msu.ru/fluorescence-quenching/ (Доступ 2 августа 2021 г.)

  20. Zhou Y., Wang Y., Hu X. et al. // Biophys. Chem. 1994. V. 51 (1). P. 81. https://doi.org/10.1016/0301-4622(94)00032-8

  21. Gamov G.A., Zavalishin M.N., Pimenov O.A., Klochkov V.V., Khodov I.A. // Inorg. Chem. 2020. V. 59. Iss. 23. P. 17783. https://doi.org/10.1021/acs.inorgchem.0c03082

  22. Ekberg C., Brown P.L. Hydrolysis of Metal Ions. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Germany, 2016. 917 p.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Журнал физической химии

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал