Физиология растений, 2019, T. 66, № 2, стр. 121-127

ВВЕДЕНИЕ

Цитоплазматическая АТФ-цитратсинтаза, также обозначаемая как АТФ-цитратлиаза (АТФ-ЦЛ, КФ 4.1.3.8), катализирует образование ацетил-СоА и оксалоацетата из цитрата и CoA. Известно, что ацетил-СоА является предшественником в биосинтезе широкого спектра соединений в растительном организме, поэтому растения должны иметь различные системы метаболизма ацетил-СоА в митохондриях (для цикла Кребса), в пластидах (для биосинтеза жирных кислот de novo), в пероксисомах (продукт окисления жирных кислот), и в цитозоле (для биосинтеза изопреноидов, флавоноидов) [1].

В клетках растений цитозольный пул ацетил-СоА, в накоплении которого принимает активное участие цитозольная АТФ-цитратлиаза, необходим для поддержки биосинтеза широкого диапазона биомолекул, которые важны для роста, развития и защиты растений. Эти биомолекулы включают масла, содержащие очень длинную цепь жирных кислот, воски [2, 3], флавоноиды, мевалоновую кислоту [4] и изопреноиды [5].

От регуляции активности фермента цитратлиазы зависят многие жизненно необходимые процессы в клетке. Особый интерес вызывает световая регуляция функционирования этого энзима. Участие фитохромной и криптохромной систем было показано в регуляции ферментов цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути [6, 7]. При этом была обнаружена четкая световая регуляция различных изоферментов цитратсинтазы (ЦС, КФ 2.3.3.1) в листьях кукурузы. Митохондриальная форма ЦС резко снижала активность при облучении красным и синим участками спектра, а цитоплазматическая цитратсинтаза, наоборот, активировалась в этих условиях освещения [8]. Механизм трансдукции светового сигнала связан с регуляцией на генном уровне. Как правило, гены, отвечающие за митохондриальный окислительный метаболизм, ингибируются красным светом, а за пероксисомальный и цитоплазматический – активируются [9]. Особая роль в регуляции экспрессии генов, кодирующих ферменты энергетического метаболизма, в том числе ЦТК, отводится метилированию ДНК [10]. Нами было показано, что экспрессия генов, кодирующих субъединицы А и В сукцинатдегидрогеназы у кукурузы, регулируется степенью метилирования их промоторов [11, 12].

В связи с этим целью данного исследования было выяснение механизма регуляции активности АТФ-цитратлиазы на уровне экспрессии гена в листьях кукурузы в условиях различного светового режима и роли метилирования СpG-островков промотора гена csy3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения экспериментов использовали 14-дневные растения кукурузы, выращенные гидропонным способом при температуре 22°С и интенсивности света 25 Вт/м². Для этого растения помещали в темную камеру на 24 ч (вариант “темнота”), после чего облучали красным (вариант “КС”) и/или дальним красным (вариант “ДКС”) светом в течение 15 мин, синим светом (СС) с помощью светодиодов с областью испускания, 640–680 нм (КИПД40М40-К-П6, Россия), 710–750 нм (3Л127А-5, Россия) и 465–470 нм (ОАО “Протон“, Россия) соответственно. Интенсивность света составляла 0.044 Вт/м². Пробы для дальнейшего анализа отбирали через 3 часа с момента облучения.

Активность АТФ-цитратлиазы измеряли с применением дополнительного фермента малатдегидрогеназы [13]. Среда спектрофотометрирования содержала следующие компоненты: 0.1 М Трис-НС1, рН 7.6, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ цитрата натрия, 100 мМ НАД ∙ Н, 3 Е малатдегидрогеназы, 5 мкМ CoASH, 3 мМ АТФ. Реакцию проводили при 340 нм.

Суммарную РНК из листьев кукурузы выделяли методом гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной экстракции [14].

Обратная транскрипция РНК осуществлялась с использованием набора “РЕВЕРТА-L” (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.

ПЦР в реальном времени проводили на приборе LightCycler96 (“Roche”, Швейцария), используя в качестве красителя SYBR Green I. В качестве праймеров, подобранных с помощью программного обеспечения Primer3 [15], использовали следующую нуклеотидную последовательность для гена csy3 (pco080711, NC_024461.2): прямой − GAGTGCTTTTGGATTGCGCT, обратный − TGGCGAGTCCAGTTTGGTAG.

Параметры амплификации: предварительная денатурация 95°С – 5 мин, затем цикл: 95°С – 30 с, 56°С – 30 с, 72°С – 30 с (детекция), финальная элонгация: 72°С – 10 мин. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации фактора элонгации ef-1α с ген-специфичными праймерами [16]. В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции.

Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов проводили с применением 2^-ΔΔCt-метода [17] с использованием программного обеспечения Lightcycle 96 v1.1 (“Roche”).

ДНК выделяли из кукурузы с помощью набора “ПРОБА-ГС” (“ДНК-Технология”, Россия) согласно рекомендациям производителя. Пробу ДНК (50 мкг) денатурировали 0.3 М раствором NaOH и подвергали дезаминированию, используя 4.15 М раствор бисульфита и 0.2 М раствор гидрохинона при pH 5.0. Полученный образец обессоливали с помощью набора ПРОБА–ГС (“ДНК-Технология”). Десульфонирование проводили 0.3 М раствором NaOH с последующей нейтрализацией 10 М раствором ацетата аммония и 96% этанолом при pH 5.6 [18].

Для анализа нуклеотидного состава промотора гена csy3 на наличие G-участков использовали известные последовательности, аннотированные в международной базе данных GenBank.

Полимеразную цепную реакцию с метил-специфичными праймерами проводили с помощью набора реактивов DreamTaq PCR MasterMix (2x) (“Thermo Fisher Scientific”, США). Реакция ПЦР проводилась на приборе “Терцик” (ДНК-Технология) со следующими параметрами амплификации: предварительная денатурация при 95°С в течение 10 мин, затем 35 циклов [95°С – 20 с, 54–60°С – 20 с, 72°С – 30 с], финальная элонгация: 72°С – 4 мин.

Праймеры для метилспецифической ПЦР подбирали с помощью программы MethPrimer (http:// www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2/MethPrimer.cgi).

Эксперименты осуществлялись в трех повторностях. Достоверность результатов устанавливалась с помощью методов вариационной статистики [19]. Обсуждаются статистически достоверные различия при Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для выяснения световой регуляции активности АТФ-зависимой цитратлиазы в листьях кукурузы растения, выращенные на свету с интенсивностью 25 Вт/м², облучали светом различной длины волны. В темноте наблюдали значительное снижение активности исследуемого фермента. При анализе прямой реакции скорость функционирования АТФ-цитратлиазы снижалась более чем в 5 раз по сравнению с растениями, находящимися на свету (рис. 1). Облучение листьев кукурузы красным светом увеличивает активность фермента до 240.1 Е/г сырой массы, что в 3.7 раза выше по сравнению с вариантом “темнота”. Действие дальнего красного и последовательное действие красного и дальнего красного света на активность АТФ-цитратлиазы аналогично варианту “темнота”, величина исследуемого показателя составила 85.3 и 91.25 Е/г сырой массы, соответственно.

Рис. 1.

Активность АТФ-цитратлиазы в листьях кукурузы в условиях различного освещения. 1 – прямая реакция, 2 – обратная реакция. КС – красный свет, ДКС – дальний красный свет, СС – синий свет.

Сходные данные были получены и при исследовании скорости обратной реакции, синтеза изоцитрата из оксалоацетата и ацетил-СоА. Активность АТФ-цитратлиазы по обратной реакции снижалась в 1.4 раза при инкубации растений в условиях темноты относительно контроля (свет). Облучение листьев кукурузы красным светом также приводило к активации обратной реакции АТФ-цитратлиазы: величина данного показателя составила 49.53 Е/г сырой массы. Действие дальнего красного и последовательное действие красного и дальнего красного света были аналогичны результатам по прямой реакции, что проявлялось в снижении данного показателя относительного варианта “свет”.

При облучении проростков кукурузы синим светом с длиной волны 465 нм было установлено, что каталитическая активность АТФ-цитратлиазы как по прямой, так и по обратной реакции сходна с вариантом “свет”, что указывает на активацию работы исследуемого фермента.

Проведенный анализ образцов кДНК из кукурузы с праймерами к гену csy3 в условиях разного освещения позволил установить, что в растениях на свету и после облучения красным светом с длиной волны 660 нм относительный уровень транскриптов исследуемого гена выше такового показателя растений в темноте в 4 и 2.6 раза соответственно (рис. 2). Облучение зеленых листьев кукурузы дальним красным светом и последовательное облучение красным и дальним красным светом приводило к снижению активности ЦС по сравнению со световым вариантом. При этом изучаемый показатель становился близким к таковому в варианте “темнота”. Относительное содержание мРНК гена csy3 в этих случаях составило 0.26 и 0.27 ед.

Рис. 2.

Относительный уровень транскриптов гена csy3 в листьях кукурузы при облучении красным, дальним красным и синим светом. КС – красный свет, ДКС – дальний красный свет, СС – синий свет.

Относительное содержание транскриптов гена csy3 в листьях кукурузы при их облучении синим светом было значительно выше, чем при всех остальных вариантах светового режима растений. Содержание мРНК гена csy3 составило 2.52 ед., что в 10 раз больше этого показателя в темноте.

В качестве промотора использовали нуклеотидную последовательность, включающую 1000 нуклеотидов перед точкой начала транскрипции и первый экзон. Анализ промоторной последовательности гена csy3 кукурузы показал наличие трех CpG-островков: размером 176 п.н. в положении 49–224 нукл., 260 п.н. в положении 367–626 нукл. и 396 п.н. в положении 829–1224 нукл. (рис. 3). Координаты исследуемых CpG-островков определяли относительно последнего нуклеотида первого экзона исследуемого гена.

Рис. 3.

Нуклеотидная последовательность промотора гена cys3 с указанием точки начала транскрипции и CpG-островков.

Данные анализа нуклеотидной последовательности промотора гена csy3 АТФ-цитратлиазы позволили разработать праймеры для метилспецифичной ПЦР, обеспечивающие оценку статуса метилирования отдельных CG-динуклеотидов (табл. 1). Координаты трех исследуемых CpG-динуклеотидов определяли относительно точки начала транскрипции.

При анализе статуса метилирования отдельных CG-динуклеотидов промотора гена АТФ-цитратлиазы в зеленых листьях кукурузы в условиях различного светового режима был установлен дифференцированный характер изменения изучаемого показателя. Установлено, что на свету при облучении красным и синим светом наблюдается низкое значение степени метилирования исследуемых CG-динуклеотидов по сравнению с данными показателями в растениях в темноте и при облучении ДКС и КС + ДКС (табл. 2).

На основе полученных данных была построена диаграмма зависимости относительного уровня транскриптов гена csy3 от степени метилирования его промотора. Показано, что в листьях кукурузы в условиях темноты при облучении дальним красным светом и при последовательном облучении красным и дальним красным светом наблюдается высокий уровень метилирования промотора, что проявляется в снижении концентрации мРНК данного гена. Обратную ситуацию наблюдали в растениях, находящихся на свету и при облучении красным и синим светом, в данных условиях степень метилирования CG-динуклеотидов промотора гена csy3 составила 25–50%, что обуславливает увеличение активности исследуемого фермента.

ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение динамики работы АТФ-зависимой цитратлиазы в листьях кукурузы при последовательном экспонировании зеленых проростков кукурузы в условиях разного светового режима дало возможность выявить изменение ее активности в зависимости от условий освещения.

Обнаруженная высокая активность АТФ-цитратлиазы в цитозоле растений при освещении, по-видимому, необходима для образования ацетил-СоА, участвующего в различных биосинтетических процессах. Цитоплазматическая АТФ-цитратлиаза может синтезировать ацетил-СоА, используемый для метаболизма мевалоновой кислоты, приводящего к синтезу стеролов и других изопреноидных метаболитов [20]. Кроме того, было установлено повышение активности АТФ-цитратлиазы в сладком картофеле, наряду с накоплением сесквитерпеноидных фитоалексинов, что указывает на участие АТФ-цитратлиазы в обеспечении ацетил-СоА для биосинтеза изопреноидов [21]. В ряде исследований показано, что цитозольная АТФ-цитратлиаза может обеспечить синтез ацетил-СоА, который идет на удлинение цепи жирных кислот до C20–C30, при отсутствии классической ацетил-CoA-синтетазы в цитозоле [22]. Следовательно, можно предположить, что увеличение каталитической активности АТФ-цитратлиазы на свету необходимо для обеспечения нескольких метаболических путей.

В ходе работы было выявлено, что фитохромная и криптохромная системы принимают непосредственное участие в регуляции функционирования исследуемой АТФ-цитратлиазы. Активная форма фитохрома, а также активная форма криптохрома, приводят к возрастанию активности исследуемого фермента в 3−5 раз. Воздействие дальнего красного света на растения кукурузы имело противоположный характер, что проявлялось в снижении активности АТФ-цитратлиазы. Это указывает на фитохром-зависимый механизм регуляции исследуемого фермента. Аналогичный эффект был обнаружен ранее в наших работах и в работах других авторов. На большинство митохондриальных изоформ ферментов окислительного метаболизма красный и синий свет влияют негативно. В то же время, они резко активируют цитоплазматические изоформы цитратсинтазы, фумаразы и аконитазы [23, 7, 8 ]. Следует отметить, что на свету в листьях образуется большое количество первичных ассимилятов, в том числе ди- и трикарбоновых органических кислот, которые требуют дальнейшей метаболизации [24].

Изменение статуса метилирования ДНК – один из эпигенетических механизмов, контролирующих экспрессию генов и обеспечивающих регуляцию активности ферментов в адаптации клеточного метаболизма к свету [25].

Метилирование остатков цитозина в ДНК играет важную роль в регуляции экспрессии генов. При этом метилирование, как правило, происходит в CG-динуклеотидах кодирующей области [26, 27]. Также установлено, что в растениях Arabidopsis thaliana активная форма фитохрома А действует путем транскрипционного фактора PIL5, связывающегося с G-участком промотора в качестве регулятора гена, теряющего данную способность, по мнению авторов, при гиперметилировании CG-динуклеотидов [28]. Изменение статуса метилирования промоторов гена csy3 может служить механизмом регуляции работы АТФ-цитратлиазы. Регулирование активности фермента цитратлиазы красным светом в листьях кукурузы происходит через фитохромный механизм, который реализуется путем изменения степени метилирования CpG-островков промотора гена csy3. Было также показано участие криптохромов в регуляции синим светом активности цитратлиазы. При этом эффект действия синего света можно опосредовать также через изменение степени метилирования CpG-островков промотора гена csy3.

Распределение CG-динуклеотидов в геноме важно для нормального функционирования клетки и регуляторных участков генов. Большое значение для уровня транскрипции гена играет статус метилирования CpG-островков в его промоторе [29]. При этом неметилированный CpG-островок не всегда ассоциирован с активно транскрибируемым геном. Однако отсутствие метилирования CpG-островка в промоторе гена является условием, необходимым для транскрипции. Как правило, в такой ситуации CpG-динуклеотиды не метилированы в промоторах активно экспрессирующихся генов и метилированы в промоторах неэкспрессирующихся генов [30].

Анализ нуклеотидов промоторов гена АТФ‑цитратлиазы в листьях кукурузы позволил установить наличие в их составе CpG-островков, что может обуславливать их регуляцию за счет изменения степени метилирования. Вероятно, для него характерна ко-регуляция, обусловленная необходимостью синтеза группы пептидов, обеспечивающего функционирование определенных метаболических процессов в адаптации при изменении типа питания [11, 12].

Анализ данных по изменению экспрессии гена, кодирующего АТФ-цитратлиазу, и степени метилирования CG-динуклеотидов промотора в листьях кукурузы в условиях различного светового режима выявил определенные закономерности. Для гена csy3 была обнаружена четкая зависимость степени метилирования его промотора с экспрессией этого гена (табл. 2). Анализ влияния степени метилирования на уровень транскрипции гена АТФ-цитратлиазы при воздействии на растения света различной длины волны выявил, что данный показатель может являться важным фактором, регулирующим работу исследуемого фермента. Невысокая степень метилирования CG-динуклеотидов промотора гена csy3 в растениях, экспонируемых на свету и после облучения красным и синим светом, совпадала с высоким уровнем экспрессии исследуемого гена и, как следствие, высокой активностью АТФ-цитратлиазы. Обратная ситуация наблюдается в темноте и при облучении растений дальним красным светом и последовательным облучением красным и дальним красным светом. В данных вариантах опыта наблюдается увеличение степени метилирования CG-динуклеотидов исследуемого промотора, что приводит к снижению активности фермента.

Таким образом, в ходе исследования показано, что изменение статуса метилирования промотора гена csy3 АТФ-цитратлиазы является механизмом контроля его активности. При этом, активные формы фоторецепторов (фитохром и криптохром) принимают непосредственное участие в данном процессе, выступая в качестве регулятора активности исследуемого гена за счет опосредованного соответствующими факторами транскрипции взаимодействия со специфическим G-участком его промотора [28]. Увеличение степени метилирования CG-динуклеоидов в составе промотора гена csy3, по-видимому, препятствует данному взаимодействию, что обуславливает активацию работы АТФ-цитратлиазы на свету и при облучении растений красным и синим светом.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№17-04-01039).