Физиология растений, 2021, T. 68, № 1, стр. 20-35

Растительные экспрессионные системы – новый этап в производстве биофармацевтических препаратов

А. А. Загорская a*, Е. В. Дейнеко ab

a Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”
Новосибирск, Россия

b Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Национальный исследовательский Томский государственный университет”
Томск, Россия

* E-mail: zagorska@bionet.nsc.ru

Поступила в редакцию 20.04.2020
После доработки 17.06.2020
Принята к публикации 19.06.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Биопродукция рекомбинантных фармацевтических препаратов в растительных системах становится перспективной альтернативой существующим платформам на основе клеток млекопитающих или бактерий. Культивирование растительных клеток в контролируемых условиях биореакторов обеспечивает продукцию белка высокого качества в соответствии с нормами GMP (Good Manufacturing Practice), а быстрый рост клеток, невысокая стоимость компонентов питательных сред и полное отсутствие риска контаминации вирусами и прионами животного происхождения свидетельствуют о неоспоримом преимуществе растительных экспрессионных систем. В связи с одобрением контролирующими органами и последующей коммерциализацией первого в мире рекомбинантного фармацевтического препарата β-глюкоцереброзидазы для лечения болезни Гоше, синтезированного в растительных клетках, наступил новый период, в котором данная технология решительно теснит некоторые устоявшиеся экспрессионные платформы на биофармацевтических рынках. В обзоре рассматриваются характеристики “идеальной” культуры растительных клеток для производства рекомбинантных белков in vitro, технологические особенности используемых в настоящее время биореакторных систем, обсуждаются проблемы, которые необходимо преодолеть для повышения конкурентоспособности данной платформы, а также освещаются последние коммерческие успехи молекулярного фермерства.

Ключевые слова: суспензионные культуры, растительные системы экспрессии, биореакторы, рекомбинантные белки, биофармацевтические препараты

ВВЕДЕНИЕ

Молекулярное фермерство – это использование растений, растительных тканей и клеток для получения коммерчески значимых рекомбинантных белков, в том числе и медицинского назначения [1]. Коммерческий потенциал данной технологии стал очевиден после проведения многолетних исследований возможности использования растений для синтеза и накопления различных рекомбинантных белков, и, в частности, способности растений конкурировать с уже существующими экспрессионными системами на основе клеток млекопитающих, насекомых, дрожжей и микроорганизмов. Хотя преимущества растительных экспрессионных систем широко обсуждались, продвижение этих разработок происходило чрезвычайно медленно. Это объяснялось негативным восприятием общественностью технологий, связанных с генетически модифицированными культурами, а также с инертностью и нежеланием производителей отходить от платформ с устоявшейся репутацией и существующей инфраструктурой. Отсутствовала также и нормативно-правовая база по вопросам использования растительных биотехнологических препаратов, в результате чего данные препараты попадали между юрисдикциями и компетенциями ответственных учреждений, занимающихся вопросами сельского хозяйства и вопросами производства биотехнологических препаратов. Однако на сегодняшний день наработка рекомбинантных белков в растительных системах является быстро развивающимся сегментом экономики. Крупнейшие биотехнологические и фармацевтические компании, такие как Protalix Biotherapeutics (Израиль), Synthon (Нидерланды), Ventria (США), Medicago (Канада), Greenovation (Германия), и Pfizer (США), проявляют огромную заинтересованность и инвестируют значительные средства в развитие научных исследований и разработку новых платформ для производства ценных рекомбинантных белков. На российском рынке преобладают импортные биотехнологические препараты. Тем не менее, в последние годы отечественные компании стали активно разрабатывать как новые биофармацевтические препараты, так и аналоги уже имеющихся зарубежных лекарственных средств, в том числе при финансовой поддержке государства. Хотя в настоящее время в России не ведется промышленного получения рекомбинантных белков в растительных экспрессионных системах, очевидно, что эта перспективная платформа скоро займет достойное место в современном производстве.

Современное молекулярное фермерство разделилось на три главных направления: выращивание растений со стабильной экспрессией трансгенов для масштабного производства белков в течение длительного периода, применение транзиентной экспрессии для быстрого получения белков за короткое время и, наконец, использование для синтеза растительных клеток или тканей, культивируемых в биореакторах (рис. 1).

Рис. 1.

Основные направления молекулярного фермерства.

Выращивание растений со стабильной экспрессией трансгенов в полевых условиях с применением уже имеющихся агротехнических схем и приемов дает практически неограниченную масштабируемость при минимальных затратах [2]. Поэтому данное направление оптимально подходит для производства продуктов с большим объемом потребления, таких как ферменты и гормоны (например, липаза желудка и инсулин), а также антитела и вакцины для профилактики заболеваний, особенно в развивающихся странах с большой численностью населения. Трансгенные растения также являются привлекательным средством для создания пероральных вакцин, поскольку антигены могут быть синтезированы в съедобных тканях [3], хотя существуют сомнения по поводу оптимального дозирования из-за вариабельности по содержанию рекомбинантного белка в растительных тканях. Первой крупной компанией, применившей растения для промышленного получения рекомбинантного белка, стала компания ProdiGeneInc. (США), которая использовала генетически модифицированную кукурузу для синтеза промышленных ферментов, реагентов для исследовательских работ и биофармацевтических препаратов. Важно отметить, что в компании ProdiGeneInc. впервые было проведено исследование экономической целесообразности молекулярного фермерства с учетом затрат на выращивание, выделение и очистку конечного рекомбинантного продукта [4, 5]. Было показано, что полученные из кукурузы рекомбинантный авидин и β-глюкуронидаза были доступны и конкурентоспособны по сравнению с существующими коммерческими продуктами авидина, полученными из куриных яиц [6], и β-глюкуронидазой бактериального происхождения [7]. Многие из концепций извлечения и очистки конечного продукта из растительной ткани, разработанных ProdiGeneInc., были в последующем использованы другими компаниями. В настоящее время одобрено производство в полевых условиях генетически модифицированных растений риса, в зернах которого синтезируются рекомбинантные человеческие лизоцим [8], лактоферрин [9] и сывороточный альбумин [10], а также трансгенного сафлора, способного накапливать в семенах аполипопротеин [11] и поверхностный антиген гепатита В [12], и кукурузы (браззеин) [13, 14].

Второе направление современного молекулярного фермерства связано с наработкой в растениях рекомбинантных белков на основе транзиентной экспрессии. Сжатые сроки производства белков и быстрое масштабирование делают данное направление привлекательным для крупного производства вакцин, особенно при необходимости экстренного реагирования. Подтверждением перспективности данной системы экспрессии для обеспечения быстрой вакцинации населения и защиты от вспышек заболеваний послужили работы D’Aoust с соавт. [15], когда в растениях Nicotiana benthamiana были продуцированы большие количества (50 мг/кг) антигенов из штаммов вируса гриппа H5N1 (птичий грипп) и H1N1 (свиной грипп) менее чем за 3 недели с момента определения последовательности вирусной РНК. Данные вакцины против гриппа завершили II фазу испытаний на людях. Компания Fraunhofer USA, Inc. также использовала транзиентную трансформацию растений для ускоренного получения значительных количеств рекомбинантного белка на основе выделенной последовательности РНК вируса H1HA [16, 17].

Первый экспериментальный “коктейль” против вируса Эбола, представляющий собой смесь из трех моноклональных антител, синтезированных посредством транзиентной экспрессии в растениях N. benthamiana, был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA – Food and Drug Administration) на случай чрезвычайной ситуации и получил название ZMappTM [18]. Перспективна эта платформа и для мелкосерийного производства персонализированных лекарственных препаратов, таких как анти-идиотипные антитела scFv для неходжкинской лимфомы, где инвестиции в крупномасштабные объекты были бы нерациональны.

Для доставки целевых генов в ткани растений разработаны системы агроинфильтрации с использованием вирусных векторов, например, вируса мозаики вигны РНК-2 от Sainsbury с соав-т. [19], а также система “магнифекции” (IconGenetics). Накопление целевого рекомбинантного белка в листьях N. benthamiana в таких системах может достигать 80% от общего растворимого белка (ОРБ) [20].

Следует отметить, что, несмотря на низкую стоимость полученных рекомбинантных белков при использовании трансгенных растений со стабильной экспрессией целевых генов, в настоящее время четко прослеживается тенденция переноса производства биофармацевтических препаратов в ограниченные среды, то есть в системы на основе биореакторов [21, 22]. Культивирование в биореакторе полностью освобождает от проблем, связанных с изменениями погоды, почвы, наличием вредителей и дрейфом трансгенов в окружающую среду [23]. Из-за коротких циклов роста клеток, культивируемых в суспензии, сроки производства рекомбинантных белков в культуре растительных клеток, сокращаются до недель по сравнению с месяцами, необходимыми для их производства в целых трансгенных растениях [24]. Кроме того, выращивание растительных клеток в стерильных и контролируемых средах, таких как биореакторная система, позволяет точно регулировать условия роста клеток и качество продукта от партии к партии. Дополнительным преимуществом производства в культуре растительных клеток является тот факт, что рекомбинантные белки могут секретироваться из клеток в культуральные среды, и, следовательно, последующая обработка для извлечения и очистки белков становится намного дешевле, чем из целых растений. Эти преимущества значительно перевешивают недостаток, связанный с более низким выходом белка в системе растительных клеток по сравнению с другими платформами [25].

Таким образом, следующая волна фармацевтического молекулярного фермерства возникла в связи с разработкой производственных процессов, которые соответствовали жестким правилам, касающимся фармацевтических продуктов, и оказались экономичными в промышленном масштабе. Это привело к консолидации молекулярного фермерства вокруг меньшего числа наиболее перспективных производственных систем, центральное место среди которых заняли технологии, основанные на использовании суспензионных культур растительных клеток и полностью соответствующих существующим правилам GMP [26].

ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Первые разработки в области промышленного получения фармацевтически ценных рекомбинантных белков на платформе культур клеток высших растений были выполнены на клеточных линиях табака (Nicotiana tabacum L.): BY-2 (cv. BrightYellow-2) и NT-1, риса (Oryza sativa L.) и моркови (Daucus carota L.) (табл. 1). Эти культуры клеток являются быстрорастущими и легко подвергаются трансформации, опосредованной Agrobacterium tumefaciens. К тому же для клеток риса была создана сахароиндуцибельная промоторная система, позволяющая разделять во времени фазы роста культуры и накопления продукта, что обеспечивало большую продуктивность. На основе клеточной линии табака BY-2 с использованием современного метода редактирования генома CRISPR/Cas9 и методов гликоинженерии получена линия, в которой отсутствовало гликозилирование белков по растительному типу со специфичными для растений остатками β(1,2)-ксилозы и α(1,3)-фукозы [27, 28].

Таблица 1.  

Культуры клеток различных видов высших растений, используемые для крупномасштабного производства рекомбинантных белков

Растение-донор клеточной культуры Клеточные линии Компании-производители Ссылки
Табак (N. tabacum L.) BY-2;
NT-1
Protalix Biotherapeutics http://protalix.com/faq/procellex-platform/
Морковь (D. carota L.)   Protalix Biotherapeutics http://protalix.com/faq/procellex-platform/
Рис (O. sativa L.)   Natural Bio-Materials, Jeollabuk-do, Korea http://www.nbms.co.kr

В дополнение к этим трем коммерческим платформам в молекулярном фермерстве были использованы несколько других видов растений. Клетки люцерны усеченной (Medicago truncatula Gaertn.) обычно используют для анализа вторичного метаболизма, однако в последнее время было показано, что клеточные линии, полученные из зрелых семядолей, листьев, корней или проростков этого вида, обеспечивают высокий выход рекомбинантного белка за счет гораздо более низкого содержания протеаз, обнаруженных в среде после культивирования, чем в среде после культивирования клеток BY-2 [29]. К настоящему времени сообщается о двух биофармацевтических продуктах, синтезированных в клеточных линиях M. truncatula [30]. Другие белки были получены в линиях клеток томата (Solanum lycopersicum L.), сои (Glycine max L.), картофеля (Solanum tuberosum L.), подсолнечника (Helianthus annus L.), сладкого картофеля (Ipomoea batatas L.) и лекарственных растений, таких как свободноягодник колючий (Eleutherococcus senticosus Rupr. & Maxim.) и корейский женьшень (Panax ginseng C.A. Mey.). Однако данные линии используются лишь в исследовательских целях в рамках лабораторных экспериментов [31].

Стандартная схема получения трансгенных клеточных линий представлена на рисунке 2. На первом этапе проводят генетическую трансформацию растительных клеток методами агробактериальной трансформации или биобаллистики. Затем осуществляют индукцию трансгенного каллуса в том случае, если в качестве экспланта для трансформации были использованы дифференцированные ткани растения, или наращивание популяции трансгенных клеток при использовании клеточных суспензий. Индукция каллуса происходит благодаря добавлению в состав питательной среды соответствующих ростовых факторов (ауксинов и цитокининов), подобранных в определенных соотношениях. После проведения трансформации культура растительных клеток представляет собой гетерогенную массу генетически и эпигенетически отличающихся клеток с различными уровнями экспрессии, количеством копий трансгенов и разными инсерционными сайтами, что значительно влияет на их продуктивность. Только небольшая доля клеток из исходных трансформантов способна продуцировать рекомбинантный белок с высокой эффективностью, и важной задачей представляется селекция “элитных” высокопродуктивных клеток и использование их затем для формирования моноклональных суспензионных клеточных культур. Отбор продуктивных клеток может проводиться при использовании плейтинга – метода массового культивирования отдельных изолированных клеток с последующим определением уровня накопления белка в индивидуальных микрокаллусах или с помощью методики флуоресцентно-активированной клеточной сортировки FACS (Fluorescence-activated cell sorting), позволяющей проводить отбор единичных протопластов с высоким уровнем экспрессии флуоресцентного маркера, слитого с целевым продуктом [32].

Рис. 2.

Разработка трансгенных клеточных линий для производства целевого рекомбинантного белка.

Идеальная растительная система для крупномасштабного производства рекомбинантных белков должна обладать следующими характеристиками: высокий темп роста; легкость генетической трансформации; высокий уровень продукции целевого белка; стабильность рекомбинантного целевого продукта и в процессе синтеза внутри клеток, и вне их; низкая концентрация вторичных метаболитов, способных вызывать изменения структурных и биологических свойств целевого белка и/или усложнять процессы выделения и очистки; корректность пост-трансляционных изменений в клетках, включая единые паттерны гликозилирования и конечный фолдинг белка; а также клеточная суспензия должна быть гомогенной и не содержать крупных агрегатов для стабильного функционирования биореакторов.

Если первые три требования к культурам растительных клеток не нуждаются в расшифровке, то на остальных необходимо остановиться подробнее.

ПРОТЕОЛИЗ

Протеолиз – один из ключевых процессов, влияющих на качество и устойчивый уровень производства рекомбинантных белков в растительных клетках. Протеолитические ферменты участвуют во многих физиологических реакциях в клетке, и их количество и многообразие является серьезной проблемой при использовании суспензионных культур растительных клеток. На сегодняшний день разработано несколько стратегий для преодоления протеолитической деградации белковых молекул, таких как сайт-направленный мутагенез для удаления сайтов чувствительности к протеазам [33], присоединение сигналов накопления белка в клеточных компартментах [34] или образование белковых телец включения для снижения протеолитической деградации [35]. Предложены технологии нарушения экспрессии генов протеаз с помощью антисмысловых последовательностей ДНК или РНК [36, 37] или коэкспрессии ингибиторов протеаз с транспортом их в питательные среды [3840].

ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ

Известно, что выделение и очистка рекомбинантного белка из сырой биомассы является неотъемлемой частью любого биопроизводства, и независимо от выбранной платформы стоимость переработки достигает до 80% от общих затрат. Для каждого продукта разрабатывают специфические этапы выделения и очистки, хотя широко применяются и стандартизованные подходы, такие как аффинная хроматография или выделение с использованием фракционирования сульфатом аммония. Образование в культурах клеток вторичных метаболитов, таких как масла или алкалоиды, требует значительных дополнительных затрат на очистку продукта и представляется крайне нежелательным. Используемые в настоящее время в крупном промышленном производстве клеточные линии моркови и риса не содержат значительных количеств вторичных метаболитов, а линия табака BY-2 не продуцирует никотин, лишь небольшое количество анатабина и некоторых других алкалоидов [41].

ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ

Одной из самых больших проблем при использовании растительных систем экспрессии остаются различия, существующие в гликозилировании по растительному типу и по типу клеток человека. Особенности гликоформы белка могут влиять на его фолдинг, агрегацию, устойчивость к протеолитической деградации, растворимость, транспорт, а также изменять его функциональную активность и иммуногенность [42]. Фармакологическая ценность рекомбинантных белков, синтезированных в растительных клетках и гликозилированных по растительному типу, снижается, а, следовательно, способность рекомбинантных систем экспрессии эффективно и корректно гликозилировать белки по человеческому типу является необходимой для производства современных фармакологических белков. К настоящему времени разрабатывается целый ряд стратегий для изменения ферментативных путей гликозилирования белков, синтезируемых в растительных системах экспрессии [43]. Наиболее простой подход к улучшению профиля гликозилирования рекомбинантного белка и его частичной гуманизации заключается в изменении его внутриклеточной адресации, например, в удерживании белка в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) с помощью добавления к нему C-терминальной сигнальной последовательности аминокислотных остатков H/KDEL и SEKDEL или направлении его в аппарат Гольджи, вакуоли, хлоропласты и пр. [44, 45]. Однако эта стратегия является мало предсказуемой и подходит не для всех белков и не всех растительных систем экспрессии. Другая стратегия в гликоинженерии растительных систем экспрессии заключается в элиминировании растительных гликозилтрансфераз с помощью современной CRISPR/Cas9-технологии адресной модификации генов [46, 47]. В настоящее время основные усилия в гликоинженерии растений сосредоточены на сочетании приемов, которые обеспечивают ингибирование биосинтеза растительных гликоэпитопов с последующим переносом в растительный геном генов гликозилтрансфераз млекопитающих. Это дает возможность максимально приблизить картину гликозилирования рекомбинантных белков, синтезированных в растительных системах экспрессии, к человеческой [48].

АГРЕГАТИВНОСТЬ

При создании высокопродуктивных клеточных суспензий важно поддержание клеточных культур в гомогенном состоянии для равномерного их снабжения питательными веществами и кислородом. Однако во время экспоненциальной фазы роста суспензии и интенсивного деления клеток формируются агрегаты разной величины, что приводит к появлению гетерогенных клеточных субпопуляций, различающихся морфологически и метаболически [49]. Клетки, находящиеся внутри больших агрегатов, ограничены в поступлении кислорода и питательных веществ, и, соответственно, в них снижается продукция рекомбинантного белка. Кроме того, с увеличением размера клеточных агрегатов возрастает их чувствительность к повреждениям при перемешивании среды, приводящая к гибели и лизированию клеток. Разрушение клеток при культивировании ведет не только к снижению продуктивной биомассы, но и к освобождению большого количества клеточных протеаз, вызывающее быструю деградацию целевого рекомбинантного продукта. Другой проблемой, связанной с образованием агрегатов, являются реологические проблемы и трудности перемешивания, так как крупные агрегаты обычно оседают на дно и стенки реакционного сосуда, блокируя отверстия и функциональные блоки биореактора [50]. Публикации разных лет подтверждают, что размер агрегатов в суспензионных культурах растительных клеток является ключевым параметром, определяющим их продуктивность в отношении синтеза вторичных метаболитов. Наиболее показательны исследования Kolewe с соавт. [51], в которых уменьшение размеров клеточных агрегатов сопровождалось резким возрастанием синтетических способностей растительных клеток в культуре in vitro не только в отдельных экспериментах, но и при длительном субкультивировании. Для разных видов растений описано как негативное, так и положительное влияние высокой степени агрегированности суспензионной клеточной культуры на уровень накопления вторичных метаболитов. Вероятно, что для каждого вида существует оптимальный диапазон размеров агрегатов, при котором биосинтетический потенциал клеток наиболее высок. Предполагается, что между продуктивностью процесса биосинтеза рекомбинантных белков и степенью агрегативности суспензионных культур существует обратная корреляция. В связи с этим, исследователями предпринимаются усилия для получения культур клеток с мелкими агрегатами. Предложены технологии механической фильтрации и отбора агрегатов при достижении ими критических размеров с последующим удалением их из биомассы, а также химические и ферментативные методы разделения клеточных агрегатов. Однако показано, что короткие импульсные обработки ферментами, способные диссоциировать агрегаты, лишь незначительно повышают содержание в суспензии отдельных клеток [52], а продолжительные обработки приводят к лизису клеток [53]. Добавление в среду для культивирования ингибиторов полимеризации тубулина, подобных колхицину, запатентованное группой американских ученых [54], также не нашло применения в практике.

Перспективными работами по снижению агрегативности клеток в суспензионных культурах, можно считать, исследования, связанные с сайт-направленным нокаутированием при помощи системы CRISPR/Cas9 [55] гена галактуронозилтрансферазы-1 – одного из основных ферментов биосинтеза пектина [56]. Предполагается, что снижение функции данного гена приведет к уменьшению адгезионных свойств клеток, их способности образовывать крупные агрегаты и, следовательно, к повышению выхода рекомбинантного белка. Однако необходимо отметить, что ни один из описанных выше методов не является универсальным для клеток разных видов растений, и с их помощью невозможно добиться устойчивого состояния дезагрегации в суспензионной культуре без видимых изменений в ее биохимическом статусе.

ПРОБЛЕМЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

Описывая преимущества использования суспензионных культур растительных клеток при получении рекомбинантных белков в промышленных масштабах, необходимо отметить и те сложности, которые приходится преодолевать компаниям-разработчикам. Кроме уже упомянутой низкой производительности культур растительных клеток исследователи столкнулись с переменным качеством фармацевтических препаратов растительного происхождения. Это обусловлено тем, во время длительного культивирования и периодического субкультивирования происходит снижение или даже полное исчезновение ожидаемой продукции, связанное с замолканием генов или рекомбинационными событиями в клетках. Для решения этой проблемы и создания стабильного производства начали применять технологию сохранения элитных клеточных линий в так называемых клеточных банках, имеющих трехступенчатую систему и состоящих из клеточного банка, банка мастер-клеток и рабочего банка клеток. Элитные, высокоэффективные по синтезу целевого белка клеточные линии сохраняются по правилам GMP в замороженном состоянии. Линии клеток млекопитающих хранятся по так называемым золотым стандартам, позволяющим использовать общие стратегии криоконсервации. Свойства растительных клеток разнообразны, зависят от вида и требуют разработки уникальных протоколов для разных клеточных линий [57, 58]. Эти протоколы основаны на трех главных принципах контролируемого охлаждения: двухступенчатое/равновесное замораживание, которое требует медленного охлаждения на 1°С в минуту до промежуточных низких температур (–30/–40°С) перед быстрым охлаждением в жидком азоте; обработка 5–8 молярными растворами криопротекторов, способствующая обезвоживанию перед сверхбыстрым охлаждением в жидком азоте, или высушивание с или без капсулирования в альгинатных гранулах. Успешно работающие протоколы были разработаны для различных видов растительных клеток, однако все они оптимизировались с использованием нетрансгенных клеток и оценивались по таким критериям, как клеточная морфология и рост культуры. Для трансгенных клеточных линий имеются лишь ограниченные данные, и существует необходимость оценки продуктивности этих клеток перед введением их в производство [59]. Альтернативный подход – постоянный скрининг высокопродуктивных линий, подтверждающих сохранение в культуре высокого уровня продукции рекомбинантного белка, и создание математических моделей, характеризующих стабильность продукции и обеспечивающих планирование работ. В дополнение к методам сохранения элитных линий разрабатываются методики коэкспрессии супрессоров генетического замолкания, способных поддержать высокую продуктивность элитных клеточных линий.

Вторая проблема связана со сложностью масштабирования при переходе от лабораторных исследований к индустриальным технологиям промышленного культивирования растительных клеток. Разработка и оптимизация клеточной линии обычно осуществляется с использованием небольших сосудов, таких как микротитрационные планшеты, колбы или одноразовые биореакторы объемом 0.5 л. Культивирование же клеток в промышленности происходит в биореакторах, достигающих в объеме 25 тысяч литров и более. При использовании сосудов большого объема главной проблемой становится достаточная аэрация и перемешивание среды при отсутствии повреждений клеток, так как многие культуры оптимально растут в условиях повышенной плотности и вязкости, могут образовывать на поверхности пену [60] и часто обладают свойствами неньютоновских жидкостей [61]. Необходимо отметить, что в настоящее время для производства биофармацевтических продуктов используют реакторы как многоразового, так и одноразового действия. Многоразовые биореакторы требуют систематической обработки агрессивными реагентами во избежание контаминации. Эти реагенты достаточно дороги, а процедуры чистки и стерилизации занимают время. Поэтому в последние годы все чаще применяют одноразовые, изготовленные из пластика биореакторы [62]. Одноразовые системы стоят дорого с точки зрения расходных материалов, но дополнительные расходы компенсируются экономией за счет отсутствия процедур чистки и стерилизации, а также снижения риска контаминации. Именно такие системы используют в производстве рекомбинантных белков фирмой Pfizer [63].

ТИПЫ ПРОМЫШЛЕННЫХ БИОРЕАКТОРОВ

Конструкция оптимального биореактора должна учитывать несколько факторов, включая простоту процессов инокуляции и сбора продукта, масштабируемость, эффективность системы циркуляции питательной среды и аэрации и возможности стерилизации системы. При разработке биореакторов для конкретных задач биофарминга учитывают как важнейшие характеристики клеточных культур, например, кинетику или интенсивность роста клеточной культуры, так и свойства экспрессионного вектора, содержащего конститутивный или индуцируемый промотор, локализацию конечного продукта, его стабильность и многие другие характеристики растительной экспрессионной системы [64, 65]. Тип биореактора и особенности перемешивания определяются размерами клеток и клеточных агрегатов используемых клеточных культур, так как от них зависят реологические свойства культуры, потребность в питательных веществах и кислороде, а, в конечном итоге, и производительность биотехнологического процесса [66]. Растительные клетки имеют тенденцию переходить от сферических к удлиненным формам при прекращении клеточного деления, а также увеличиваться в размерах. Крупные клетки сильнее подвержены повреждениям, а уменьшение перемешивания приводит к плохой подаче кислорода и питательных веществ в клеточную культуру, увеличивает слипание клеток в агрегаты и снижает производительность всей системы [67].

В настоящее время с целью создания оптимальных условий для клеточного роста и продукции рекомбинантных белков разработаны различные системы биореакторов (табл. 2). Как было сказано выше, используемые биореакторы делятся на реакторы многоразового и однократного использования. Многоразовые реакторы чаще всего представляют собой стальной сосуд для культивирования, оснащенный системой стерилизации, и подразделяются на типы по способу перемешивания культуральной среды: оборудованные лопастями, пневматические, ротационные барабанные реакторы или реакторы с неподвижным слоем для иммобилизованных клеток. У всех перечисленных типов имеются как преимущества, так и недостатки. В ферментерах с лопастными мешалками достигается хорошее перемешивание среды и аэрация, однако возникающая вокруг лопастей турбулентность может приводить к сильному повреждению клеток. Тем не менее, реакторы с механическим перемешиванием продолжают широко применяться и усовершенствоваться для достижения лучшей аэрации при низких скоростях движения лопастей. Для этого используются мешалки измененных конфигураций, такие как изогнутые дисковые турбины, подводные крылья, клеточный лифт. Разрабатываются новейшие системы аэрации, например, беспузырьковая аэрация с применением мембран, обеспечивающих поступление кислорода путем контролируемой диффузии [68]. Пневматические или пузырьковые биореакторы состоят из цилиндрического сосуда, в котором перемешивание и аэрация осуществляются с помощью сжатого воздуха или газовой смеси, поступающей с его дна. Такие реакторы отличает невысокая стоимость и отсутствие механических частей, однако в них невозможно достичь полной гомогенности культуры [69].

Таблица 2.

Сравнение биореакторных систем для производства рекомбинантного белка растительными клеточными культурами

Характеристики C мешалкой (STB) Пузырьковая колонна Аэрлифт Временные иммерсионные STB одноразового использования Волновой Мембранный
Уровень повреждения клеток Высокий Низкий Низкий Низкий Средний Низкий Низкий
Степень аэрации Средняя Высокая Высокая Низкая Средняя Низкая Низкая
Период перемешивания Короткий Длинный Средний Длинный/средний Средний Средний Средний
Сложность управления Среднее Простое Простое Сложное Среднее Среднее Среднее
Масштабируемость Средняя Легкая Легкая Сложная Средняя Сложная Сложная
Тип культуры Суспензионные культуры Суспензионные культуры Суспензионные культуры Иммобилизованные клетки Суспензионные культуры Суспензионные культуры Иммобилизованные клетки
Плотность клеток Низкая/средняя Средняя Средняя Высокая Низкая/средняя Средняя Высокая
Производительность Средняя Низкая Средняя Низкая средняя Средняя Средняя Высокая
Мониторинг и контроль Прямой, легкий, многократный Прямой, легкий, многократный Прямой, легкий, многократный Косвенный, ограниченный Прямой, легкий, ограниченный Прямой, средний, ограниченный Косвенный, ограниченный
Соответствие GMP Да Да Да Неполное Да Да Неполное

Реакторы с так называемым фиксированным слоем обычно используют для культивирования растительных клеток, дифференцированных растительных тканей или органов, иммобилизованных на микроносителях, расположенных в фиксированных зонах и гораздо менее чувствительных к механическому повреждению, чем при культивировании в суспензии. Питательная среда циркулирует сквозь слой клеток, и целевые продукты могут быть извлечены из нее по мере их накопления. Главным недостатком этой системы является недостаточная тепло- и элементная емкость, вызванная низкой скоростью обтекания жидкости. Подобные реакторы чаще применяются для перфузионного культивирования животных клеток, но при правильном выборе микроносителя для иммобилизации растительных клеток может быть достигнута их высокая плотность и, соответственно, повышение продуктивности культуры [70].

Биореакторы одноразового употребления имеют используемые однократно контейнеры для культивирования, изготовленные из пластика, отвечающего высоким критериям качества, утвержденным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA). Такие реакторы все более широко используются в последнее десятилетие для биологических процессов в малых и средних объемах. Их широкое распространение объясняется низкими рисками контаминации, снижением временных затрат, минимизацией потерь и влияния на окружающую среду. Однако 20–30% снижение стоимости, о которой иногда сообщается, возможно только при высокоэффективном синтезе целевого продукта, что объясняется чрезвычайно высокой ценой GMP-контейнеров. Несмотря на этот факт, пластиковые контейнеры все более широко используются при культивировании растительных клеток для получения различных рекомбинантных белков и вторичных метаболитов [71].

В целом точная классификация многоразовых и систем однократного применения для культивирования растительных клеток сложна, так как существуют многочисленные варианты дизайна, приспособленные для определенных культур и операций. Поэтому в данном обзоре рассмотрены только коммерчески используемые типы реакторов.

УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ РАСТИТЕЛЬНОЙ БИОФАРМАЦЕВТИКИ

В последние годы PMP-сообщество (Plant-Made Pharmaceuticals) добилось значительного прогресса в разработке и получении рекомбинантных белков медицинского назначения. За 20–25 лет в культуре растительных клеток был успешно получен широкий спектр биологически значимых белков. К ним в основном относятся антитела, вакцинные антигены, гормоны и факторы роста, цитокины и ферменты. Из различных групп терапевтических белков, синтезируемых в системе культивируемых растительных клеток, наиболее востребованными остаются антитела. Антитела являются доминирующим классом рекомбинантных белков для фармацевтической промышленности, т.к. они относительно стабильны, накапливаются в высоких концентрациях (>100 мг/л), а также могут быть достаточно легко очищены от среды или клеточных экстрактов с помощью аффинной хроматографии [72].

На сегодняшний день разработаны технологии получения в растительных системах так называемых “специальных белков”, к которым относят, например, желатин и коллаген для капсулирования лекарств [73, 74], промышленные энзимы, такие как целлюлаза и липаза для производства биотоплива [7579].

Несмотря на то, что культуры растительных клеток зарекомендовали себя в качестве многообещающей альтернативной платформы биопродукции фармацевтических белков лишь несколько биотехнологических или фармацевтических компаний занимаются разработкой и коммерциализацией этой платформы. Важно отметить, что существует большой пласт перспективных разработок, способных обеспечить крупный прорыв в этой области в ближайшие годы, а некоторые биофармацевтические продукты уже одобрены для применения в медицине или проходят клинические и доклинические исследования. Так компания Dow AgroSciences разработала систему растительных клеток Concert в качестве передовой платформы для производства вакцинного антигена против вируса ньюкаслской болезни домашней птицы. В январе 2006 года Dow AgroSciences получила разрешение на использование первой в мире вакцины, синтезированной растительными клетками (клетками табака BY-2) и представляющей собой рекомбинантный гликопротеин гемагглютинин-нейраминидазы, одного из поверхностных гликопротеинов вируса ньюкаслской болезни, и главный поверхностный антиген, индуцирующий продукцию нейтрализующих антител. Несмотря на то, что вакцина, полученная из растительных клеток, доказала свою эффективность и получила одобрение регулирующих органов, она осталась лишь проверкой концепции. Dow AgroSciences никогда не намеревалась продавать этот продукт и использовала эту вакцину для животных в качестве примера полного прохождения процесса. Однако компания проложила путь к будущим терапевтическим средствам на основе растительных клеток.

Биофармацевтическая компания Protalix Biotherapeutics (www.protalix.com) является наиболее успешной фирмой, использующей свою собственную запатентованную систему экспрессии ProCellEx® на основе растительных клеток для разработки и коммерциализации рекомбинантных биофармацевтических препаратов. Используя ProCellEx®, Protalix Biotherapeutics разрабатывает процессы производства новых рекомбинантных белков, предназначенные для крупных и устоявшихся фармацевтических рынков. В мае 2012 года компания Protalix Biotherapeutics заключила партнерское соглашение с Pfizer для коммерциализации талиглюцеразы-α для инъекций (ELELYSO) – первого в мире человеческого терапевтического белка, получаемого в растительных клетках и одобренного FDA. Фермент используется для лечения болезни Гоше, наиболее распространенного заболевания, вызванного снижением активности лизосомального фермента кислой β-глюкоцереброзидазы, и накоплением в связи с этим глюкозилкерамида [80]. Талиглюцераза-α является активной рекомбинантной формой β-глюкоцереброзидазы, которая продуцируется в суспензионной культуре клеток корня моркови, культивируемых в одноразовой биореакторной системе. Данный продукт был разработан с использованием гена глюкоцереброзидазы человека (GCD) с заменой нативного сигнального пептида на сигнальный пептид эндохитиназного гена A. thaliana для перемещения в ЭПР, а также присоединением сигнала из хитиназы А табака для транспорта рекомбинантного белка в вакуоли [81]. В настоящее время основным вариантом лечения пациентов с тяжелой болезнью Гоше является энзимотерапия. С 1994 года для энзимотерапии использовался Cerezyme® – аналог человеческого фермента β‑глюкоцереброзидазы, производимый компанией Genzyme в клетках млекопитающих CHO (Chinese hamster ovary). Поскольку для оптимальной активности фермента и нацеливания на макрофаги требуется правильное гликозилирование β-глюкоцереброзидазы, функциональный фермент не может продуцироваться прокариотической кишечной палочкой [82]. Даже продуцируемая клетками СНО имиглюцераза должна подвергаться ферментативной обработке in vitro, чтобы сделать доступными концевые остатки маннозы, специфически распознаваемые эндоцитарными углеводными рецепторами на макрофагах для эффективного поглощения [83, 84]. Вырабатываемая растительными клетками глюкоцереброзидаза считается “биоподобной”, так как она структурно гомологична Cerezyme® с сопоставимой ферментативной активностью и поглощением в макрофагах [85]. Рекомбинантный фермент не требует дополнительных модификаций для клинического применения после биопродукции, что приводит к значительному снижению затрат (примерно на 25%), по сравнению с затратами на производство его конкурента Cerezyme® [86]. Необходимо отметить, что одобрение данного препарата FDA в 2012 году явилось крупным прорывом, проложившим путь новым разработкам в области биофармацевтики.

Возможность пероральной доставки фармацевтических белков представляется желанной целью биофармацевтической промышленности. Перорально доставляемые белки обеспечивают более удобное введение лекарственного средства, чем некоторые существующие варианты доставки белков, включая внутривенные, внутримышечные и подкожные инъекции. Считается, что возможность пероральной доставки приведет к лучшим результатам лечения пациентов наряду с повышением качества их жизни. На сегодняшний день, успехи в разработке таких препаратов весьма ограничены из-за деградации белков в пищеварительном тракте. Однако, по мнению специалистов фирмы Protalix Biotherapeutics, такая возможность может быть реализована при синтезе белков на платформе ProCellEx®. При пероральном введении и прохождении через пищеварительный тракт растительные клетки функционируют в качестве естественного средства доставки благодаря защитным свойствам целлюлозной клеточной стенки. В настоящее время в компании Protalix Biotherapeutics на II стадии клинических испытаний находятся несколько продуктов, производимых на платформе ProCellEx® и предназначенных для перорального применения.

Дополнительные исследования проводятся для отработки пероральной доставки талиглюцеразы-α (продукт PRX-112) [87]. Эксперименты на животных и I этап клинических испытаний для изучения фармакокинетики PRX-112 и его безопасности, на котором пациенты с болезнью Гоше получали ресуспендированные лиофилизированные клетки-продуценты, показали присутствие фермента в крови в период до 30 часов после перорального введения и среднее увеличение ферментативной активности более чем на 100% (в пределах от 50 до 350%). Таким образом, считают, что суточная доза PRX-112 позволит достичь устойчивого уровня ферментативной активности, обнаруженной у здоровых людей [88].

Продукт OPRX-106 представляет собой продуцируемый растительными клетками рецептор II рекомбинантного фактора некроза опухоли человека, слитый с Fc-доменом IgG1 (TNFRII-Fc) и предназначенный для ингибирования TNF-α. В настоящее время этот продукт прошел II фазу клинических испытаний при аутоиммунных воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, включая язвенный колит и болезнь Крона [89]. Терапия основана на блокировании цитокина, вовлеченного в воспалительные реакции. Перорально вводимые клетки моркови, продуцирующие OPRX-106, могут быть использованы для лечения иммунных расстройств, а также в качестве противовоспалительного, противоревматического, гепатопротекторного средства. В ходе доклинической оценки этого продукта на мышах показано, что пероральное введение позволяет избежать системного воздействия, которое возникает при инъекции или внутривенной инфузии других ингибиторов TNF-α. Пероральное введение может потенциально привести к более безопасному использованию анти-TNF-α. OPRX-106 также является менее иммуногенным, что приводит к более длительному сроку эффективной терапии.

Еще одной успешной разработкой фирмы Protalix Biotherapeutics является модифицированная дезоксирибонуклеаза (ДНКазаI) человека, производимая клетками моркови [90]. Этот продукт, обозначенный PRX-110 и вводимый ингаляторно, предназначен для снижения вязкости мокроты, накапливающейся в легких у больных муковисцидозом. Традиционно терапия муковисцидоза для улучшения функции легких и уменьшения обострений проводится ДНКазойI (дорназой-α). Однако активность ДНКазы I снижается из-за актина – глобулярного многофункционального белка, являющегося мощным ингибитором ДНКазы I и обнаруженного в высокой концентрации в мокроте пациентов с муковисцидозом. Для уменьшения взаимодействия актина и ДНКазы I специалисты фирмы Protalix Biotherapeutics разработали альдорназу-α – химическую модификацию фермента ДНКаза I, резистентную к ингибированию актином. Этот новый перспективный препарат, производимый на платформе клеток табака BY-2, может привести к улучшению функции легких и снижению заболеваемости рецидивирующими инфекциями у пациентов с муковисцидозом, а рекомбинантная форма фермента демонстрирует повышенную эффективность у пациентов по сравнению с одобренным в настоящее время лечением ДНКазой (Pulmozyme®-дорназа-α). Первичные результаты II фазы клинических исследований показывают, что лечение альдорназой-α привело к клинически значимому улучшению функции легких, ее активность, как продемонстрировано в исследованиях in vitro, остается практически без изменений в концентрации актина, обнаруженной у пациентов с муковисцидозом, в то время как активность Pulmozyme® значительно снижается. Кроме того, PRX-110 продемонстрировал значительное ингибирование Pseudomonas аeruginosa – бактерий, которые широко распространены в окружающей среде и являются основной причиной легочных инфекций у пациентов с муковисцидозом. Количество колоний P. аeruginosa уменьшилось более, чем на 50% по сравнению с исходным уровнем. Это действие препарата PRX-110 представляется чрезвычайно ценным, так как хроническая легочная инфекция является основной причиной заболеваемости и смертности у пациентов с муковисцидозом, несмотря на активное использование антибиотиков.

Завершается II этап клинических исследований рекомбинантного биофармацевтика, продуцируемого в клетках табака, названного PRX-102 [91]. PRX-102 (pegunigalsidase alfa) представляет собой рекомбинантную химически модифицированную версию белка альфа –галактозидазы A и предназначен для лечения болезни Фабри, развитие которой связано со снижением ферментативной активности лизосом. PRX-105 (ацетилхолинэстераза человека; AChE-R) представляет собой еще один из рекомбинантных биофармацевтиков, синтезированных в растительных клетках с использованием системы ProCellEx®в компании Protalix Biotherapeutics [92]. В настоящее время данный препарат прошел доклинические испытания и первые оценки на людях, которые показали его безопасность и высокую переносимость. PRX-105 заявлен в качестве кандидата для профилактики и лечения отравлений теплокровных фосфорорганическими соединениями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суспензионная культура клеток растений объединила преимущества недорогого микробного синтеза и достоинства эукариотической системы наработки рекомбинантного белка без риска контаминации инфекционными агентами животного происхождения. Первый в мире терапевтический препарат из растительных клеток β-глюкоцереброзидаза стал коммерческим успехом биофарминга, некоторые другие препараты проходят доклинические и клинические испытания. Следовательно, можно сказать, что биофармацевтическая промышленность вступила в период широкого использования уникальных свойств растительных систем. Решающим моментом в продвижении этой технологии будет повышение уровня экспрессии рекомбинантного белка, обеспечение его секреции из клетки, а также осуществление гуманизации или использование специфических гликанов для повышения эффективности белка. Применение в крупномасштабном производстве высокоэффективных и безопасных биореакторов одноразового применения делает процесс полностью соответствующим высоким требованиям GMP.

Работа поддержана бюджетным проектом 0324-2019-0040-C-01 “Генетические основы биотехнологий и биоинформатика”.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.

Список литературы

  1. Tschofen M., Knopp D., Hood E., Stoger E. Plant molecular farming: Much more than medicines // Annu. Rev. Anal. Chem. 2016. V. 9. P. 271.

  2. Buyel J.F., Hubbuch J., Fischer R. Comparison of tobacco host cell protein removal methods by blanching intact plants or by heat treatment of extracts // J. Vis. Exp. 2016. V. 114. https://doi.org/10.3791/54343

  3. Spiegel H., Stöger E., Twyman R.M., Buyel J.F. Current status and perspectives of the molecular farming landscape. Molecular Pharming // Molecular Pharming: Applications, Challenges, and Emerging Areas, First Edition / Ed. Kermode A.R.: John Wiley & Sons, Inc. 2018. P. 3. https://doi.org/10.1002/9781118801512.ch1

  4. Hood E.E., Kusnadi A., Nikolov Z., Howard J. Molecular farming of industrial proteins from transgenic maize// Chemicals via Higher Plant Bioengineering / Eds. Shahidi F., Kolodziejczyk P., Whitaker J., Munguia A., Fuller G.: Plenum Publishers, New York. 1999. P. 127.

  5. Kusnadi A.R., Evangelista R., Hood E., Howard J., Nikolov Z. Processing of transgenic corn seed and its effect on the recovery of recombinant 13-glucuronidase // Biotech. Engin. 1998. V. 60. P. 44.

  6. Hood E.E., Witcher D.R., Maddock S., Meyer T., Baszczynski C., Bailey M., Flynn P., Register J., Marshall L., Bond D., Kulisek E., Kusnadi A., Evangelista R., Nikolov Z., Wooge C., et al. Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and purification // Mol. Breed. 1997. V. 3. P. 291.

  7. Witcher D., Hood E., Peterson D., Bailey M., Bond D., Kusnadi A., Evangelista R., Nikolov Z., Wooge C., Mehigh R., Kappel W., Register J., Howard J.A. Commercial production β-glucuronidase (GUS): a model system for the production of proteins in plants // Molecular Breeding. 1998. V. 4. P. 301.

  8. Yang D., Guo F., Liu B., Huang N., Watkins S.C. Expression and localization of human lysozyme in the endosperm of transgenic rice // Planta. 2003. V. 216. P. 597.

  9. Huang N., Bethell D., Card C., Cornish J., Marchbank T., Wyatt D., Mabery K., Playford R. Bioactive recombinant human lactoferrin, derived from rice, stimulates mammalian cell growth // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2008. V. 44. P. 464.

  10. Yang H., Ninga T., Xiea T., Qiua Q., Zhanga L., Suna Y., Jianga D., Fua K., Yinb F., Zhangb W., Shenc L., Wangc H., Lid J., Line Q., Sunf Y., et al. Large-scale production of functional human serum albumin from transgenic rice seeds // PNAS. 2011. V. 108. № 47. P. 19078.

  11. Nykiforuk C.L., Shen Y., Murray E.W., Boothe J.G., Busseuil D., Rhéaume E., Tardif J.C., Reid A., Moloney M.M. Expression and recovery of biologically active recombinant apolipoprotein AI(Milano) from transgenic safflower (Carthamus tinctorius) seeds // Plant Biotechnol. J. 2011. V. 9. № 2. P. 250. https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2010.00546.x

  12. Valdés R., Reyes B., Alvarez T., García J., Montero J.A., Figueroa A., Gómez L., Padilla S., Geada D., Abrahantes M.C., Dorta L, Fernández D., Mendoza O., Ramirez N., Rodriguez M., et al. Hepatitis B surface antigen immunopurification using a plant-derived specific antibody produced in large scale // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 310. P. 742.

  13. Azzoni A.R., Farinas C.S., Miranda E.A. Transgenic corn seed for recombinant protein production: relevant aspects on the aqueous extraction of native component // J. Sci. Food Agr. 2005. V. 85. P. 609.

  14. Lee Y.R., Akter Sh., Lee I.H., Jung Y.J., Park S.Y., Cho Y.-G., Kang K.K., Jung Y.J. Stable expression of brazzein protein, a new type of alternative sweetener in transgenic rice // J. Plant Biotechnol. 2018. V. 45. P. 63. https://doi.org/10.5010/JPB.2018.45.1.063

  15. D'Aoust M.A., Couture M.M., Charland N., Trépanier S., Landry N., Ors F., Vézina L.P. The production of hemagglutinin based virus-like particles in plants: A rapid, efficient and safe response to pandemic influenza // Plant Biotechnol. J. 2010. V. 8. № 5. P. 607.

  16. Shoji Y., Chichester J.A., Bi H., Musiychuk K., de la Rosa P., Goldschmidt L., Horsey A., Ugulava N., Palmer G.A., Mett V., Yusibov V. Plant-expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate // Vaccine. 2008. V. 26. P. 23. P. 2930.

  17. Shoji Y., Chichester J.A., Jones M., Manceva S.D., Damon E., Mett V., Musiychuk K., Bi H., Farrance C., Shamloul M., Kushnir N., Sharma S., Yusibov V. Plant-based rapid production of recombinant subunit hemagglutinin vaccines targeting H1N1 and H5N1 influenza // Hum. Vaccin. 2011. V. 7. P. 41.

  18. Na W., Park N., Yeom M., Song D. Ebola outbreak in Western Africa 2014: What is going on with Ebola virus? // Clin. Exp. Vaccine Res. 2015. V. 4. P. 17.

  19. Sainsbury F., Sack M., Stadlmann J., Quendler H., Fischer R., Lomonossoff G.P. Rapid transient production in plants by replicating and non-replicating vectors yields high quality functional anti-HIV antibody // PLoS One. 2010. V. 5. e13976

  20. Gleba Y., Klimyuk V., Marillonnet S. Magnifection: a new platform for expressing recombinant vaccines in plants // Vaccine. 2005. V. 23. P. 2042.

  21. Wilken L.R., Nikolov Z.L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins // Biotechnology Advances. 2012. V. 30. P. 419.

  22. Basaran P., Rodríguez-Cerezo E. Plant molecular farming: opportunities and challenges // Crit. Rev. Biotechnol. 2008. V. 28. № 3. P. 153. https://doi.org/10.1080/07388550802046624

  23. Donini M., Marusic C. Current state-of-the-art in plant-based antibody production systems // Biotechnol. Lett. 2019. V. 41. № 3. P. 335. https://doi.org/10.1007/s10529-019-02651-z

  24. Plasson C., Michel R., Lienard D., Saint-Jore-Dupas C., Sourrouille C., de March G.G., Gomord V. Production of recombinant proteins in suspension-cultured plant cells // Methods Mol. Biol. 2009. V. 483. P. 145.

  25. Schillberg S., Raven N., Fischer R., Twyman R.M., Schiermeyer A. Molecular farming of pharmaceutical proteins using plant suspension cell and tissue cultures // Curr. Pharm. Des. 2013. V. 19. № 31. P. 5531.

  26. Huang T.-K., McDonald K.A. Bioreactor systems for in vitro production of foreign proteins using plant cell cultures // Biotechnology Advances. 2012. V. 30. P. 398. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2011.07.016

  27. Ozawa K., Takaiwa F. Highly efficient Agrobacterium-mediated transformation of suspension-cultured cell clusters of rice (Oryza sativa L.) // Plant Sci. 2010. V. 179. № 4. P. 333.

  28. Xu J., Ge X., Dolan M.C. Towards high-yield production of pharmaceutical proteins with plant cell suspension cultures // Biotechnol. Adv. 2011. V. 29. № 3. P. 278.

  29. Santos R.B., Chandrasekar B., Mandal M.K., Kaschani F., Kaiser M., Both L., van der Hoorn R.A.L., Schiermeyer A., Abranches R. Low protease content in Medicago truncatula cell cultures facilitates recombinant protein production // Biotechnol. J. 2018. V. 13. № 7: e1800050. https://doi.org/10.1002/biot.201800050

  30. Pires A.S., Rosa S., Castanheira S., Fevereiro P., Abranches R. Expression of a recombinant human erythropoietin in suspension cell cultures of Arabidopsis, tobacco and Medicago // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2012. V. 110. P. 171. https://doi.org/10.1007/s11240-012-0141-x

  31. Santos R.B., Abranches R., Fischer R., Sack M., Holland T. Putting the spotlight on plant suspension culture // Front. Plant Sci. V. 7. P. 297. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00297

  32. Kirchhoff J., Raven N., Boes A., Roberts J.L., Russell S., Treffenfeldt W., Fischer R., Schinkel H., Schiermeyer A., Schillberg S. Monoclonal tobacco cell lines with enhanced recombinant protein yields can be generated from heterogeneous cell suspension cultures by flow sorting // Plant Biotechnol. J. 2012. V. 10. P. 936.

  33. Jutras P.V., Goulet M.-C., Lavoie P.-O., D’Aoust M.-A., Sainsbury F., Michaud D. Recombinant protein susceptibility to proteolysis in the plant cell secretory path way is pH-dependent // Plant Biotechnol. J. 2018. V. 16. P. 1928.

  34. Faye L., Boulaflous A., Benchabane M., Gomord V., Michaud D. Protein modifications in the plant secretory pathway: current status and practical implications in molecular pharming // Vaccine. 2005. V. 23. P. 770.

  35. Conley A.J., Joensuu J.J., Richman A., Menassa R. Protein body-inducing fusions for high-level production and purification of recombinant proteins in plants // Plant Biotechnol. J. 2011. V. 9. P. 419.

  36. Duwadi K., Chen L., Menassa R., Dhaubhadel S. Identification, characterization and down-regulation of cysteine protease genes in tobacco for use in recombinant protein production // PLoS One. 2015. V. 10: e0130556.

  37. Mandal M.K., Fischer R., Schillberg S., Schiermeyer A. Biochemical properties of the matrix metalloproteinase NtMMP1 from Nicotiana tabacum cv. BY-2 suspension cell // Planta. 2010. V. 232. P. 899.

  38. Goulet C., Khalf M., Sainsbury F., D’Aoust M.-A., Michaud D. A protease activity-depleted environment for heterologous proteins migrating towards the leaf cell apoplast // Plant Biotechnol. J. 2012. V. 10. P. 83.

  39. Jutras P.V., D’Aoust M.-A., Couture M.M.-J., Vézina L.P., Goulet M.C., Michaud D., Sainsbury F. Modulating secretory pathway pH by proton channel co-expression can increase recombinant protein stability in plants // Biotechnol. J. 2015. V. 10. P. 1478.

  40. Robert S., Jutras P.V., Khalf M., D’Aoust M.-A., Goulet M.-C., Sainsbury F., Michaud D. Companion protease inhibitors for the in situ protection of recombinant proteins in plants // Meth. Mol. Biol. 2016. V. 1385. P. 115.

  41. Hashimoto S. TobaccoBY-2 cells // Biotechnology in agriculture and forestry / Ed. By Nagata T., Hasezawa S., Inze D. Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg. 2004. https://doi.org/10.1007/978-3-662-10572-6

  42. Розов С.М., Пермякова Н.В., Дейнеко Е.В. Основные стратегии гликоинженерии растительных систем экспрессии для получения гуманизированных рекомбинантных фармацевтических белков // Биохимия. 2018. Т. 83. № 3. С. 328.

  43. Schoberer J., Strasser R. Plant glyco-biotechnology // Semin. Cell Dev. Biol. 2018. V. 80. P. 133. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2017.07.005

  44. Sriraman R., Bardor M., Sack M., Vaquero C., Faye L., Fischer R., Finnern R, Lerouge P. Recombinant anti-HCG antibodies retained in the endoplasmic reticulum of transformed plants lack core-xylose and core-alpha(1,3)-fucose residues // Plant. Biotechnol. J. 2004. V. 2. P. 279.

  45. Triguero A., Cabrera G., Rodriguez M., Soto J., Zamora Y., Perez M., Wormald M.R., Cremata J.A. Differential N-glycosylation of a monoclonal antibody expressed in tobacco leaves with and without endoplasmic reticulum retention signal apparently induces similar in vivo stability in mice // Plant. Biotechnol. J. 2011. V. 9. P. 1120.

  46. Mercx S., Smargiasso N., Chaumont F., De Pauw E., Boutry M., Navarre C. Inactivation of the β(1,2)xylosyl transferase and the α(1,3)fucosyltransferase genes in Nicotiana tabacum BY2 cells by a multiplex CRISPR/Cas9 strategy results in glycoproteins without plant specific glycans // Front. Plant Sci. 2017. V. 8. P. 403. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00403

  47. Hanania U., Ariel T., Tekoah Y., Fux L., Gubbay Y., Weiss M., Oz D., Azulay Y., Turbovsky A., Forster Y., Shaaltiel Y. Establishment of a tobacco BY2 cell line devoid of plant specific xylose and fucose as a platform for the production of biotherapeutic proteins // Plant Biotechnol. J. 2017. V. 15. P. 1120.

  48. Castilho A., Gattinger P., Grass J., Jez J., Pabst M., Altmann F., Gorfer M., Strasser R., Steinkellner H. N-glycosylation engineering of plants for the biosynthesis of glycoproteins with bisected and branched complex N-glycans // Glycobiology. 2011. V. 21. P. 813.

  49. Kolewe M.E., Henson M.A., Roberts S.C. Characterization of aggregate size in Taxus suspension cell culture // Plant Cell Rep. 2010. V. 29. № 5. P. 485. https://doi.org/10.1007/s00299-010-0837-5

  50. Ochoa-Villarreal M., Howat S., Hong S., Jang M.O., Jin Y.-W., Lee E.-K., Loake G.J. Plant cell culture strategies for the production of natural products // BMB Rep. 2016. V. 49. № 3. P. 149.

  51. Kolewe M.E., Henson M.A., Roberts S.C. Analysis of aggregate size as a process variable affecting paclitaxel accumulation in Taxus suspension cultures // Biotechnol. Prog. 2011. V. 27. № 5. P. 1365. https://doi.org/10.1002/btpr.655

  52. Lee T.J., Schultz R.W., Hanley-Bowdoin L., Thompson W.F. Establishment of rapidly proliferating rice cell suspension culture and its characterization by fluorescence-activated cell sorting analysis // Plant Mol. Biol. Rep. 2004. V. 22. P. 259.

  53. Naill M.C., Roberts S.C. Culture of isolated single cells from Taxus suspensions for the propagation of superior cell populations // Biotechnol. Lett. 2005. V. 27. № 21. P. 1725.

  54. Garrison R., Jayakumar S. In vitro methods for the induction and maintenance of plant cell lines as single suspension cells with intact cell walls // Patent US 8206983 B2. 2012

  55. Сидорчук Ю.В., Щелокова А.С., Пермякова Н.В., Дейнеко Е.В. Исследование агрегативности суспензионной клеточной культуры Arabidopsis thaliana с нокаутом гена GAUT1 // Гены и клетки. 2018. Приложение № 2. с. 47.

  56. Sterling J.D, Atmodjo M.A., Inwood S.E., Kumar Kolli V.S., Quigley H. F., Hahn M. G., Mohnen D. Functional identification of an Arabidopsis pectin biosynthetic homogalacturonan galacturonosyltransferase // Proc. Natl. Acad. Sci. 2006. V. 103. № 13. P. 5236. https://doi.org/10.1073/pnas.0600120103

  57. Grout B.W.W. Cryopreservation of plant cell suspensions // Methods Mol. Biol. 2007. V. 368. P. 153.

  58. Mustafa N.R., de Winter W., van Iren F., Verpoorte R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures // Nat. Protoc. 2011. V. 6. P. 715.

  59. Schmale K., Rademacher T., Fischer R., Hellwig S. Towards industrial usefulness: cryo-cell-banking of transgenic BY-2 cell cultures // J. Biotechnol. 2006. V. 124. P. 302.

  60. Wongsamuth R., Doran P.M. Foaming and cell flotation in suspended plant-cell cultures and the effect of chemical antifoams // Biotechnol. Bioeng. 1994. V. 44. P. 481.

  61. Kieran P.M., MacLoughlin P.F., Malone D.M. Plant cell suspension cultures: Some engineering considerations // J. Biotechnol. 1997. V. 59. P. 39.

  62. Raven N., Schillberg S., Kirchhoff J., Brandli J., Imseng N., Eibl R. Growth of BY-2 suspension cells and plantibody production in single-use bioreactors // Single-use technology in biopharmaceutical manufacture / Eds. Eibl R., Eibl D. John Wiley & Sons: Hoboken, NJ. 2011. P. 251.

  63. Schillberg S., Raven N., Fischer R., Twyman R.M., Schiermeyer A. Contained molecular farming using plant cell and tissue cultures // Applied Bioengineering / Ed. Yoshida T. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 2017. P. 259. https://doi.org/10.1002/9783527800599.ch9

  64. Georgiev M.I., Weber J. Bioreactors for plant cells: hardware configuration and internal environment optimization as tools for wider commercialization // Biotechnol Lett. 2014. V. 6. № 7. P. 1359.

  65. Valdiani A., Hansen O.K., Nielsen U.B., Johannsen V.K., Shariat M., Georgiev M.I., Omidvar V., Ebrahimi M., Tavakoli Dinanai E., Abiri R. Bioreactor-based advances in plant tissue and cell culture: challenges and prospects // Crit. Rev. Biotechnol. 2018. V. 15. P. 11. https://doi.org/10.1080/07388551.2018.1489778

  66. Kieran P.M. Bioreactor design for plant cell suspension cultures // Multiphase bioreactor design / Eds. Cabral J., Mota M., Tramper J.: Taylor and Francis, London. 2001. P. 391.

  67. Kieran P., Malone D., MacLoughlin P. Effects of hydrodynamic and interfacial forces on plant cell suspension systems // Influence of stress on cell growth and product formation / Eds. Schügerl K., Kretzmer G.: Springer, Berlin, Heidelberg. 2000. P. 139.

  68. AL-Mashhadania M.K.H., Wilkinson S.J., Zimmerman W.B. Airlift bioreactor for biological applications with microbubble mediated transport processes // Chemical Engineering Science. 2015. V. 137. P. 243.

  69. Eibl R., Eibl D. Design of bioreactors suitable for plant cell and tissue cultures // Phytochem. Rev. 2008. V. 7. P. 593.

  70. Medina-Bolivar F., Cramer C. Production of recombinant proteins by hairy roots cultured in plastic sleeve bioreactors // Methods Mol. Biol. 2004. V. 267. P. 351.

  71. Shaaltiel Y., Baum G., Bartfeld D., Hashmueli S., Lewkowicz A. Production of high mannose proteins in plant culture // United States Patent 20080038232. 2008

  72. Xu J., Zhang N. On the way to commercializing plant cell culture platform for biopharmaceuticals: present status and prospect // Pharm. Bioprocess. 2014. V. 2. № 6. P. 499.

  73. Dodge C.N., McDonald K.A., Sudarshana M.R., Baez J. Production of recombinant human gelatin in rice cell cultures // AIChE Annual Meeting. 2006.

  74. Shoseyov O., Posen Y., Grynspan F. Human collagen produced in plants: more than just another molecule // Bioengineered. 2014. V. 5. № 1. P. 49. https://doi.org/10.4161/bioe.26002

  75. Zhang D., VanFossen A., Pagano R., Johnson J., Parker M., Pan S., Gray B.N., Hancock E., Hagen D.J., Lucero H.A., Shen B., Lessard P.A., Ely C., Moriarty M., Ekborg N.A., et al. Consolidated pretreatment and hydrolysis of plant biomass expressing cell wall degrading enzymes // BioEnergy Res. 2011. V. 4. P. 276.

  76. Sainz M. Commercial cellulosic ethanol: The role of plant-expressed enzymes // Vitr. Cell Dev. Biol. Plant. 2009. V. 45. P. 314.

  77. Garvey M., Klose H., Fischer R., Lambertz C., Commandeur U. Cellulases for biomass degradation: Comparing recombinant cellulase expression platforms // Trends Biotechnol. 2013. V. 10. P. 581.

  78. Abdeev R.M., Musiichuk K.A., Goldenkova I.V., Sotchenkov D.V., Salekhi Dzhuzani G.R., Alyavina A.K., Zagoskina N.V., Piruzian E.S. Morphology and phytohormone content in transgenic tobacco plants expressing bacterial thermostable cellulose // Russ. J. Plant Physiol. 2004. V. 51. P. 642.

  79. Klose H., Gün M., Usade B., Fischer R., Commandeur U. Cell wall modification in tobacco by differential targeting of recombinant endoglucanase from Trichoder mareesei // BMC Plant Biology. 2015. V. 15. P. 54. https://doi.org/10.1186/s12870-015-0443-3

  80. Grabowski G.A. Lysosomal storage disease 1 – Phenotype, diagnosis, and treatment of Gaucher’s disease // Lancet. 2008. V. 372. № 9645. P. 1263.

  81. Rosales-Mendoza S., Tello-Olea M.A. Carrot cells: a pioneering platform for biopharmaceuticals production // Mol. Biotechnol. 2015. V. 57. № 3. P. 219. https://doi.org/10.1007/s12033-014-9837-y

  82. Wilson S.A., Roberts S.C. Recent advances towards development and commercialization of plant cell culture processes for the synthesis of biomolecules // Plant Biotechnol. J. 2012. V. 10. № 3. P. 249.

  83. Schillberg S., Raven N., Fischer R., Twyman R.M., Schiermeyer A. Molecular farming of pharmaceutical proteins using plant suspension cell and tissue cultures // Curr. Pharm. Des. 2013. V. 19. № 31. P. 5531.

  84. Friedman B., Vaddi K., Preston C., Mahon E., Cataldo J.R., McPherson J.M. A comparison of the pharmacological properties of carbohydrate remodeled recombinant and placental-derived beta-glucocerebrosidase: implications for clinical efficacy in treatment of Gaucher disease // Blood. 1999. V. 93. № 9. P. 2807.

  85. Aviezer D., Brill-Almon E., Shaaltiel Y., Hashmueli S., Bartfeld D., Mizrachi S., Liberman Y., Freeman A., Zimran A., Galun E. A plant-derived recombinant human glucocerebrosidase enzyme – a preclinical and phase I investigation // PLoS One. 2009. V. 4. № 3: e4792. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004792

  86. Shaaltiel Y., Bartfeld D., Hashmueli S., Baum G., Brill-Almon E., Galili G., Dym O., Boldin-Adamsky S.A., Silman I., Sussman J.L., Futerman A.H., Aviezer D. Production of glucocerebrosidase with terminal mannose glycans for enzyme replacement therapy of Gaucher’s disease using a plant cell system // Plant Biotechnol. J. 2007. V. 5. № 5. P. 579.

  87. Shaaltiel Y., Gingis-Velitski S., Tzaban S., Fiks N., Tekoah Y., Aviezer D. Plant-based oral delivery of β-glucocerebrosidase as an enzyme replacement therapy for Gaucher’s disease // Plant Biotechnol. J. 2015. V. 8. P. 1033. https://doi.org/10.1111/pbi.12366

  88. Protalix BioTherapeutics initiates phase II study with PRX-112, an orally-administered enzyme replacement therapy for the treatment of Gaucher disease // Press Release by Protalix BioTherapeutics, Inc., 2018. https://protalixbiotherapeutics.gcs-web.com/node/6796/pdf

  89. Protalix BioTherapeutics announces additional positive results from final analysis of the phase II clinical trial of OPRX-106 for the treatment of ulcerative colitis // Press Release by Protalix BioTherapeutics, Inc., 2018. https://protalixbiotherapeutics.gcs-web.com/node/10911/pdf

  90. Tekoah Y., Shulman A., Kizhner T., Ruderfer I., Fux L., Nataf Y., Bartfeld D., Ariel T., Gingis-Velitski S., Hanania U., Shaaltiel Y. Large-scale production of pharmaceutical proteins in plant cell culture-the Protalix experience // Plant Biotechnol. J. 2015. V. 13. № 8. P. 1199. https://doi.org/10.1111/pbi.12428

  91. Kizhner T., Azulay Y., Hainrichson M., Tekoah Y., Arvatz G., Shulman A., Ruderfer I., Aviezer D., Shaaltiel Y. Characterization of a chemically modified plant cell culture expressed human α-Galactosidase-A enzyme for treatment of Fabry disease // Mol. Genet. Metab. 2015. V. 14. № 2. P. 259. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2014.08.002

  92. Atsmon J., Brill-Almon E., Nadri-Shay C., Chertkoff R., Alon S., Shaikevich D., Volokhov I., Haim K.Y., Bartfeld D., Shulman A., Ruderfer I., Ben-Moshe T., Shilovitzky O., Soreq H., Shaaltiel Y. Preclinical and first-in-human evaluation of PRX-105, a PEGylated, plant-derived, recombinant human acetylcholinesterase-R // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2015. V. 287. № 3. P. 202

Дополнительные материалы отсутствуют.