Физиология растений, 2023, T. 70, № 7, стр. 846-857

ВВЕДЕНИЕ

Род базилик (Оcimum L.) включает 67 видов однолетних и многолетних травянистых растений и кустарников, относящихся к подсемейству Котовниковые (Nepetoideae) семейства Яснотковые (Lamiaceae) [1]. В диком виде представители этого рода произрастают в Южной Америке, Иране, Китае, на юге Европейской части России, на Кавказе, в Средней Азии и на Дальнем Востоке. Многие виды рода базилик культивируют в Западной Европе, Азии, Африке и Америке [2]. Виды базилика различаются по характеру запаха, степени ароматичности, окраске и площади листовой пластинки, габитусу куста. У растений с мелким листом сбор эфирного масла на 10% больше, чем у растений с крупным листом.

Базилик душистый (O. basilicum L.) содержит огромный спектр биологически активных веществ (БАВ), например, эфирные масла (до 1.5%), фенольные соединения (включая флавоноиды и антоцианы), дубильные вещества (до 6%), гликозиды, сапонины, аскорбиновую кислоту, клетчатку, сахара, минеральные вещества [3]. Базилик душистый используют как источник рутина – витамина Р и каротина, а препараты на его основе применяют для стимуляции сердечной и дыхательной систем, что связано с наличием в эфирном масле камфоры.

Повысить содержание БАВ в растении можно путем выращивания культуры клеток и тканей in vitro. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными способами получения БАВ, таких как, возможность регуляции синтеза целевых продуктов с помощью контроля факторов роста, подбора оптимального режима культивирования для отдельных сортов и др. Метод культуры клеток и тканей in vitro можно использовать как альтернативу химическому производству БАВ.

Обоснованность проведения данного исследования связана с сортоспецифической реакцией растений на условия культивирования in vitro. Кроме того, метод культуры клеток и тканей позволяет получать генетически стабильный растительный материал, который может представлять большой научный интерес для дальнейших исследований по получению штаммов-суперпродуцентов.

Цель работы − получение каллусной ткани и асептических микроклонов растений различных сортов и ex vitro популяций базилика душистого, а также изучение возможности управления биосинтетическим потенциалом, используя биологические (минеральный и гормональный состав питательной среды для культивирования) и физические (наночастицы) элиситоры.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения микроклонов и каллусной ткани базилика душистого (Ocimum basilicum L.) использовали семена следующих сортов: Любимчик (ООО “Агрофирма Аэлита”), Василиск (Компания “Гавриш”), Фиолетовый бархат (ООО “Биотехника-СПб”). В работе также использовали видовые семена O. basilicum, полученные из ботанических садов Европы: Ogród Botaniczny Uniwersytetu Wroclawskiego, Польша (далее по тексту образец обозначен как Poland), Plantentuin Meise, Бельгия (далее Belgium), Orto Botanico dell’Università di Siena, Италия (далее Italy), Botanischer Garten Tübingen, Германия (далее Germany).

Семена стерилизовали 5% раствором NaOCl или 0.1% раствором HgCl₂, трижды промывали стерильной дистиллированной водой и высевали в чашки Петри (диаметр 90 мм) на агаризованную МС-среду [4] без добавления регуляторов роста. рН МС-среды доводили до 5.6–5.8 перед автоклавированием. Чашки Петри с семенами помещали на стеллажи под белые линейно-люминесцентные лампы (OSRAM AG, Германия) с интенсивностью освещения 150 мкмоль/м² с, и проращивали при температуре 23 ± 1°C и 16-часовом световом дне.

В дальнейшем 14-дневные проростки пересаживали в пластиковые контейнеры объемом 500 мл на безгормональную МС-среду для формирования асептических растений с правильной морфологией.

Все работы по стерилизации семян, введению в культуру in vitro, по изучению каллусогенеза и морфогенеза проводили в асептических условиях ламинарного бокса.

Клональное микроразмножение сортов O. basilicum. Асептические растения O. basilicum трех сортов в возрасте 10 нед. черенковали и помещали на МС-среды, содержащие минеральные соли в концентрации 1 нормы или ½ нормы без добавления фитогормонов и регуляторов роста или с добавлением 0.5 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК), нафтилуксусной кислоты (НУК) или индолилмасляной кислоты (ИМК). Учет параметров (высота растений (см), количество листьев (шт.), частота корнеобразования (%)) проводили на 42 сут. культивирования.

Клональное микроразмножение видовых растений O. basilicum зарубежных ex situ популяций. Асептические видовые растения, полученные из 4 европейских ботанических садов (Польша, Бельгия, Италия, Германия), в возрасте 1 мес. разделяли на черенки и помещали на МС-среду без добавления фитогормонов (контроль) и с добавлением 1 мг/л ИУК или ИМК. Учет параметров (высота растений (см), количество листьев (шт.), частота корнеобразования (%)) проводили на 42 сут. культивирования.

Индукция каллусогенеза и органогенеза. Каллусную ткань получали из различных типов экспланта (сегменты семядольных листьев, гипокотили, сегменты листовой пластинки, сегменты междоузлий, узлы) на МС-среде, дополненной регуляторами роста: ИУК (0.5 мг/л) в сочетании с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) (2 мг/л); БАП (1 мг/л); БАП (3 мг/л) в сочетании с ИУК (0.3 мг/л). Контролем служила безгормональная МС-среда. Повторность опыта 5-кратная, по 10 эксплантов каждого типа на повторность.

Выращивание каллусной культуры осуществляли в чашках Петри (диаметр 90 мм) при освещении белыми линейно-люминесцентными лампами (OSRAM, Германия) ‒ интенсивность освещения 150 мкмоль/м² с и 16-часовом световом дне.

Первичный фитохимический скрининг асептических растений. На растениях O. basilicum сортов Любимчик, Василиск (зеленолистные) и Фиолетовый бархат (фиолетоволистный), культивируемых на МС-средах, содержащих минеральные соли в концентрации 1 нормы или ½ нормы, был проведен первичный фитохимический скрининг по таким показателям как: танины [5], флавоноиды (с 10% NaOH и с 10% ацетатом свинца) [6], сапонины [5], алкалоиды (тест Майера, тест Драгендорфа) [6, 7], терпеноиды и стеролы (реакция Сальковского) [8], восстанавливающие сахара [9], протеины (биуретовая проба) [9], гликозиды (реакция Келлера–Килиани) [6].

Определение суммарного содержания фенольных соединений (ССФС) в микроклонах и каллусной культуре. Количественный анализ ССФС в микроклонах и каллусных культурах проводили на свежесобранном материала (сорта Любимчик, Василиск, Фиолетовый бархат). Свежую растительную массу или каллус измельчали в фарфоровой ступке с добавлением этилового спирта. После измельчения экстракт переливали в стеклянные пробирки и ставили на роторный шейкер на 1 ч. По прошествии этого времени экстракт фильтровали с помощью бумажных фильтров. К полученному отфильтрованному экстракту объемом 0.25 мл добавляли 3 мл дистиллированной воды, 0.25 мл реактива Фолина–Дениса. После чего ждали 3 мин, затем добавляли 0.5 мл насыщенного раствора гидрокарбонат натрия (8%) и 1 мл дистиллированной воды. ССФС определяли спектрофотометрически спустя 1 ч при длине волны 765 нм [10, 11]. Эксперимент осуществляли в 3 повторностях. Калибровочный график строили по галловой кислоте.

Определение суммарного содержания флавоноидов в растениях и каллусе O. basilicum. Свежую растительную массу или каллус (сорта Любимчик, Василиск, Фиолетовый бархат) измельчали в фарфоровой ступке с добавлением спирта. После измельчения экстракт переливали в стеклянные пробирки и ставили на роторный шейкер на 1 ч. По истечению этого времени экстракт фильтровали с помощью бумажных фильтров. В пробирку наливали 1.5 мл полученного экстракта, добавляли 75 мкл 10% AlCl₃ (спиртовой) и 75 мкл 1М CH₃COOK (водный), после этого приливали 2.1 мл дистиллированной воды. Через 30 мин на спектрофотометре производили измерение оптической плотности при длине волны 415 нм. Эксперимент осуществляли в 3 повторностях. Калибровочный график строили по кверцетину.

Суммарное содержание флавоноидов (С, мг/г) в пересчете на кверцетин определяли по формуле [12, 13]:

где R – значение, полученное согласно калибровочной кривой, мкг/мл; V – объем экстракта, мл; m – масса растительного образца, используемого при экстракции, г.

Влияние наночастиц (НЧ) феррата цинка на накопление вторичных метаболитов в каллусной культуре. Каллус, полученный из растительных эксплантов (сорт Фиолетовый бархат), выращивали на МС-среде с добавлением различных концентраций НЧ феррата цинка, полученных ранее методом “зеленого” синтеза на основе экстракта петрушки. НЧ предварительно обрабатывали ультразвуком в течение 4 ч и добавляли в состав МС-среды перед автоклавированием в концентрациях 12.5, 25 и 50 мкг/л. После автоклавирования и перед разливом МС-среды по чашкам Петри проводили ее обработку ультразвуком в течение 2 ч. Контролем служила питательная среда без добавления НЧ. Базовая МС-среда содержала 2,4-Д в концентрации 2 мг/л. Эксперимент проводился в 3-кратной повторности.

В конце цикла выращивания (30 сут.) определяли сухую и сырую биомассу, жизнеспособность (окрашивание клеток синькой Эванса в камере Горяева, подсчет мертвых и живых клеток), а также индекс роста (I), который рассчитывали по следующей формуле:

где W₀ – начальная масса каллуса, г; W_t – масса каллуса в конце цикла выращивания, г.

Определение фенольных соединений по вариантам проводили также в конце цикла выращивания (30 сут.) по методикам, описанным выше.

Статистическая обработка данных. Средние значения всех данных были рассчитаны с использованием Microsoft Excel 2013 (Microsoft, США). В таблицах представлены средние арифметические значения и доверительные интервалы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Первым этапом работ было получение хорошо растущей стерильной культуры O. basilicum. В качестве стерилизующего агента применяли NaOCl в концентрации 5.0% и HgCl₂ в концентрации 0.1%. Семена O. basilicum проращивали на безгормональной МС-среде в чашках Петри в условиях световой комнаты. Контролем служил вариант нестерильного прорастания семян на фильтровальной бумаге в чашках Петри. Экспериментально установлено, что прорастание семян начиналось на 5 сут., а на 14 сут. формировались полноценные проростки. Данные по всхожести семян приведены в табл. 1. Последующее культивирование проростков на МС-среде в пластиковых контейнерах объемом 500 мл приводило к появлению первых настоящих листьев и формированию растений правильной морфологии.

Как следует из табл. 1, различий между всхожестью у всех трех сортов в нестерильных условиях не обнаружено. При этом для сорта Василиск предпочтительной была стерилизация 5% раствором гипохлорита натрия в течение 15 мин, для сорта Фиолетовый бархат ‒ 0.1% раствором хлорида ртути(II) в течение 10 мин, для сорта Любимчик предпочтений нет.

Клональное микроразмножение сортов O. basilicum. Асептические растения O. basilicum различных сортов в возрасте 10 нед. черенковали и помещали на питательные МС-среды, содержащие минеральные соли в концентрации 1 нормы или ½ нормы без добавления фитогормонов и регуляторов роста или с добавлением 0.5 мг/л ИУК, НУК или ИМК. Экспериментально установлено, что минеральный и гормональный состав питательной среды оказывал существенное влияние на морфометрические показатели исследуемых сортов базилика (табл. 2).

Установлено, что наибольшая высота была у растений сортов Любимчик и Василиск, которые формировались на МС-среде с добавлением 0.5 мг/л НУК, тогда как у сорта Фиолетовый бархат достоверные различия между вариантами отсутствовали. В случае с сортом Любимчик данные по высоте растений, сформировавшихся на МС-среде с добавлением 0.5 мг/л ИУК не были получены из-за развившегося со 2-й недели культивирования некроза и последующей гибели растений. Культивирование сорта Василиск на ½ МС-средах с добавлением 0.5 мг/л ИМК, ИУК или НУК, а также МС-среде с 0.5 мг/л ИУК также приводило со 2-й недели культивирования к некрозам, что вызывало гибель растений. Эксперименты по клональному микроразмножению растений сорта Фиолетовый бархат на МС-средах с добавлением НУК не проводились, так как во время предварительного опыта было установлено, что НУК индуцировал у данного сорта базилика сильный каллусогенез без увеличения высоты побега и количества листьев.

Относительно количества образовавшихся настоящих листьев также были отмечены сортовые различия (табл. 2). У сорта Любимчик наибольшее количество листьев формировалось на МС-средах с 0.5 мг/л НУК и ½ МС с 0.5 мг/л ИУК; у сорта Василиск растения на МС-средах с 0.5 мг/л ИМК (НУК) превосходили контроль 2 (вариант с ½ нормы солей МС-среды), однако полноценные результаты не были получены из-за некрозов при культивировании на большинстве вариантов питательных сред.

Частота корнеобразования была высокой у всех изучаемых сортов на большинстве вариантов питательных сред (табл. 2). В 100% случаев растения сорта Фиолетовый бархат образовывали корни (за исключением вариантов ½ нормы солей МС-среды с 0.5 мг/л НУК, которые приводили к каллусогенезу, а также МС-среды с 0.5 мг/л ИМК, когда частота корнеобразования снижалась до 79%). У сорта Василиск наибольшую частоту корнеобразования отмечали на МС-среде с НУК, а у сорта Любимчик на половине вариантов частота корнеобразования превышала 90%.

Клональное микроразмножение видовых растений O. basilicum зарубежных ex situ популяций. Асептические видовые растения, полученные из 4 европейских ботанических садов (Польша, Бельгия, Италия, Германия), в возрасте 1 месяца разделяли на черенки и помещали на МС-среду без добавления фитогормонов (контроль) и с добавлением веществ ауксиновой природы – 1 мг/л ИУК или ИМК. На 42 сут. учитывали три морфологических показателя: высоту растений, количество листьев, частоту корнеобразования (табл. 3). Установлено, что по высоте растений существенных различий между вариантами сред и между образцами зафиксировано не было. Различия по количеству листьев между образцами в пределах одной питательной среды были несущественны. По количеству листьев в пределах каждого образца на разных питательных средах различия были несущественны, за исключением образца Poland, где достоверно большее количество листьев было отмечено на МС-среде с 1 мг/л ИУК. Наибольшая эффективность корнеобразования у всех образцов была отмечена на МС-среде с 1 мг/л ИМК.

Индукция каллусогенеза и органогенеза O. basilicum. Изучение влияния гормонального состава питательной среды на эффективность каллусогенеза и органогенеза проводили на различных типах экспланта (сегменты семядольных листьев, гипокотили, сегменты листовой пластинки, сегменты междоузлий, узлы) на МС-средах без добавления фитогормонов и регуляторов роста (контроль), а также с добавлением только ауксинов (0.5 мг/л ИУК, 2 мг/л 2,4-Д), только цитокининов (1 мг/л БАП) или сочетания ауксинового и цитокининового компонентов (3 мг/л БАП + + 0.3 мг/л ИУК).

Экспериментально установлено, что у зеленолистных сортов Любимчик и Василиск на питательных средах, содержащих БАП, не удалось получить каллусной ткани (табл. 4). На МС-среде с 0.5 мг/л ИУК каллус образовывался на всех типах экспланта, однако наибольшую частоту каллусогенеза отмечали на листовых эксплантах – 33 и 44% соответственно, а на МС-среде с 2 мг/л 2,4-Д – 88 и 100% соответственно. При измерении содержания сухого вещества в каллусе значения у обоих сортов находилось в диапазоне от 4.6 до 7.0%.

У фиолетоволистного сорта Фиолетовый бархат каллусную ткань удалось получить на всех типах экспланта на различных питательных средах (табл. 4). В частности, 100% частота каллусогенеза была отмечена на листовых эксплантах на МС-среде с добавлением 3 мг/л БАП и 0.3 мг/л ИУК, на сегментах междоузлий и узлах – на МС-среде с 2 мг/л 2,4-Д и МС-среде с 3 мг/л БАП и 0.3 мг/л ИУК, на семядольных листьях и гипокотилях – на МС-среде с 2 мг/л 2,4-Д. Содержание сухого вещества находилось в диапазоне от 3.8 до 4.6%.

Данные по корневому органогенезу представлены в табл. 5. Для сорта Любимчик удалось получить 100% корневой органогенез на узловых эксплантах при выращивании на МС-среде с 1 мг/л БАП, на гипокотильных эксплантах ‒ на МС-среде с 0.5 мг/л ИУК. Частота корневого органогенеза у сорта Василиск была значительно ниже ‒ максимальная частота была получена на листовых эксплантах на МС-среде с 0.5 мг/л ИУК, тогда как у сорта Фиолетовый бархат корневой органогенез проходил с достаточно высокой частотой (выше 70%) на всех типах экспланта.

Первичный фитохимический скрининг асептических растений. На растениях O. basilicum сортов Любимчик, Василиск (зеленолистные) и Фиолетовый бархат (фиолетоволистный) был проведен первичный фитохимический скрининг по стандартным методикам. Как следует из табл. 6, между двумя вариантами минерального состава питательной среды (МС, ½ МС), как и между сортами не наблюдалось различий по выявленным группам метаболитов.

Определение суммарного содержания фенольных соединений (ССФС) в микроклонах и каллусной культуре. Количественный анализ ССФС проводили на асептических растениях трех сортов базилика – Любимчик, Василиск и Фиолетовый бархат (табл. 7). Установлено, что минеральный состав питательной среды не оказывал достоверного влияния на ССФС в растениях, однако были выявлены различия между сортами. Так, в зеленолистных сортах Любимчик и Василиск ССФС было достоверно меньше, по сравнению с фиолетоволистным сортом Фиолетовый бархат.

В следующей серии экспериментов представляло интерес определить фенольные соединения в хорошо пролиферирующей каллусной ткани, культивируемой на МС-среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 1, 2 и 3 мг/л, а также на МС-среде с 3 мг/л БАП и 0.3 мг/л ИУК. Для этого были выбраны сорта Любимчик (зеленолистный) и Фиолетовый бархат (фиолетоволистный), для которых была получена хорошо пролиферирующая каллусная ткань. В табл. 8 представлено ССФС в каллусе O. basilicum, культивируемом на MС-среде с различным гормональным составом. Для изучаемых сортов были установлены некоторые закономерности по ССФС в каллусной ткани, полученной из стеблевых и листовых эксплантов: наибольшее количество ССФС отмечено в каллусной ткани, полученной из листовых эксплантов; концентрация 2,4-Д не оказывает существенного влияния на ССФС; накопление фенольных соединений у фиолетоволистного сорта Фиолетовый бархат было в 2 раза выше, чем у зеленолистного сорта Любимчик; при использовании МС-среды, содержащей БАП (3 мг/л) и ИУК (0.3 мг/л) ССФС у сорта Фиолетовый бархат превышало показали на МС-средах с добавлением 2,4-Д.

В табл. 9 приведены результаты по содержанию флавоноидов в каллусных культурах O. basilicum, культивируемых на MС-среде с различным гормональным составом. Установленные закономерности по содержанию флавоноидов были аналогичны закономерностям по ССФС.

Таким образом, ССФС в каллусной ткани снизилось по сравнению с микроклонами у обоих сортов, однако тенденция к превышению данного показателя у фиолетоволистного сорта Фиолетовый бархат над сортом Любимчик сохранилась. При этом культивирование каллуса на МС-среде с добавлением БАП и ИУК приводило к повышенным показателям ССФС и суммарного содержания флавоноидов по сравнению с МС-средами с добавлением 2,4-Д.

Влияние наночастиц (НЧ) феррата цинка на накопление вторичных метаболитов в каллусной культуре. Исследования проводили на каллусной культуре, полученной из стеблевых эксплантов сорта Фиолетовый бархат на МС-среде с добавлением БАП (3 мг/л) и ИУК (0.3 мг/л), а также различных концентраций НЧ феррата цинка (12.5, 25 и 50 мкг/л). Контролем служила МС-среда без добавления НЧ. Для характеристики каллусной ткани использовали такой показатель, как индекс роста, рассчитанный по биомассе каллусной ткани в начале и конце цикла выращивания. Первоначальный вес каллусной ткани во всех вариантах составлял 0.35 г. Полученные данные представлены в табл. 10. В результате проведенных исследований установлено, что добавление в МС-среду 25 мкг/л НЧ приводило к существенному увеличению сырой биомассы каллусной ткани, по сравнению с концентрациями 12.5 и 50 мкг/л. В варианте с 25 мкг/л НЧ индекс роста каллусной ткани был наибольшим и составил 3.55. При увеличении концентрации НЧ до 50 мкг/л отмечено снижение индекса роста, что свидетельствует об ингибирующем действии НЧ на пролиферативную активность дедифференцированных клеток.

Визуальные наблюдения, а также изучение каллусной ткани на временных препаратах показали, что наличие в составе питательной среды НЧ приводило к формированию каллусной ткани разной плотности и имеющей фиолетовый цвет, при этом оттенок зависел от концентрации НЧ (рис. 1). В контрольном варианте каллусная ткань была средней плотности, имела темно-фиолетовый цвет, состояла из гетерогенных по форме и размеру паренхимоподобных клеток, как правило, вытянутой формы с крупной вакуолью. В опытных вариантах, с увеличением концентрации НЧ феррата цинка в МС-среде, плотность каллусной ткани возрастала, а цвет изменялся от темно-фиолетового до светло-фиолетового (рис. 1). В этих вариантах каллусная ткань состояла из гетерогенных по форме и размеру паренхимоподобных клеток с крупной вакуолью. Каллусные клетки на МС-средах, дополненных НЧ феррата цинка, имели больший размер по сравнению с контрольным вариантом.

Изучение влияния НЧ феррата цинка на накопление фенольных соединений в каллусных клетках базилика (сорт Фиолетовый бархат) выявило зависимость накопления ССФС и флавоноидов от концентрации НЧ в МС-среде. Установлено, что увеличение концентрации НЧ приводило к снижению величины этих показателей (табл. 11). Однако достоверных различий не было обнаружено.

ОБСУЖДЕНИЕ

История культуры тканей и клеток лекарственных растений насчитывает не одно десятилетие [14–19]. Эксперименты в этой области имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. К фундаментальному значению можно отнести изучение биологии и физиологии изолированных тканей и клеток растений как модельных систем. Возможность строго контролировать все аспекты проведения экспериментов in vitro в отличие от полевых условий (in vivo), произрастания природных популяций в естественных (in situ) или новых (в ботанических садах, ex situ) условиях позволяет, варьируя определенные параметры, устанавливать четкие зависимости между изменениями внешних факторов и ответной реакцией тканей, клеток или микрорастений, определять механизмы регуляции физиологических процессов на уровне организма, ткани или клетки. К прикладному значению клеточной инженерии можно отнести сохранение редких и исчезающих видов растений, получение и размножение ценных генотипов (получение гаплоидов и диплоидов, преодоление про- и постгамной несовместимости, клональное микроразмножение, соматическая гибридизация, криосохранение), проведение клеточной селекции на устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды абиотической или биотической природы, получение ценных вторичных метаболитов, среди которых особое внимание заслуживают БАВ, в том числе активные фармацевтические ингредиенты. Изучение морфогенеза для понимания процессов химической регуляции роста и дифференциации растительных клеток раскрывает механизмы основных процессов, опираясь на теоретические положения цитологии, генетики, физиологии растений, биохимии, молекулярной биологии, морфологии, анатомии, эмбриологии и др., обогащая их, в свою очередь, новыми сведениями [20].

Представители рода Ocimum L. неоднократно становились объектами биотехнологии, прежде всего, это касается двух видов – базилик священный (O. tenuiflorum) и базилик душистый (O. basilicum). Нами были рассмотрены отечественные сорта базилика душистого – Любимчик, Василиск, Фиолетовый бархат.

В исследованиях по клональному микроразмножению O. basilicum ранее уже использовали варьирование минерального (МС или ½ МС) и гормонального (прежде всего, содержания ауксинов – ИУК, НУК, ИМК) состава питательной среды [21–23]. В соответствии с полученными нами данными по трем отечественным сортам можно дать следующие рекомендации: сорта Любимчик и Василиск (оба зеленолистные) предпочтительно выращивать на МС-среде с 0.5 мг/л НУК, поскольку в этом варианте обеспечивается наибольшая высота растения и количество листьев, наблюдается высокая укореняемость (более 95%). Для фиолетоволистного сорта Фиолетовый бархат можно рекомендовать питательные среды, включающие ½ нормы солей МС-среды с/без добавления 0.5 мг/л ИМК. Среды такого состава обеспечивают наибольшее количество листьев при 100% укореняемости и формирование относительно высоких побегов. А для образцов O. basilicum из ботанических садов Польши и Италии предпочтительной являлась МС-среда с 1 мг/л ИУК, для образца из Бельгии – МС-среда без добавления фитогормонов и регуляторов роста, а для образца из Германии – МС-среда с 1 мг/л ИМК. Для индукции каллусогенеза часто используют добавление в состав питательной среды цитокининового и ауксинового компонента, например, БАП и ИУК [24–27]. В наших исследованиях этот вариант гормонального состава МС-среды был оптимальным для фиолетоволистного сорта Фиолетовый бархат. Для зеленолистных сортов Любимчик и Василиск оптимальным было добавление в МС-среду 2,4-Д. Листовые экспланты продемонстрировали больший потенциал к формированию каллуса, чем стеблевые, что также подтверждает результаты других авторов [26]. Добавление в МС-среду ИУК способствовало корневому органогенезу как в наших исследованиях, так и в исследованиях других ученых [28]. Отсутствие единых рекомендаций по режимам индукции каллусогенеза и органогенеза Ocimum spp. отражено и в специализированной литературе [21, 25, 26, 28].

Накопление фенольных соединений видо- и тканеспецифично, что подтверждается более ранними исследованиями [29]. Показано, что в культуре in vitro, используя косвенную регуляцию с помощью варьирования минерального и гормонального состава питательной среды, можно добиться значительного повышения ССФС и индивидуальных фенольных соединений по сравнению с растениями, выращенными в полевых условиях [30]. Наши ранние данные подтверждают результаты других исследований по положительному влиянию добавления в МС-среду БАП и ИУК на накопление фенольных соединений, в частности, флавоноидов [31].

Содержание той или иной группы первичных и вторичных метаболитов варьирует как in vivo и in vitro, так и между популяциями in situ. Так, Sanni с соавт. (2008) отмечают, что накопление сапонинов и алкалоидов в листьях растений базилика, собранных в ботаническом саду, высокое, тогда как флавоноидов, терпенов, стероидов среднее, а танины и сахара присутствуют в следовых количествах [32]. Во время первичного фитохимического скрининга во всех опытных вариантах нами было доказано присутствие всех искомых групп веществ (танинов, флавоноидов, сапонинов, гликозидов, алкалоидов, полифенолов), что подтверждает данные других авторов [33–40].

В нашей работе впервые было изучено влияние НЧ феррата цинка на рост биомассы каллуса различных сортов O. basilicum. Основываясь на полученных данных, для увеличения сырой биомассы и получения наибольшего индекса роста можно рекомендовать добавление в МС-среду 25 мкг/л НЧ феррата цинка. При этом увеличение концентрации НЧ приводило к снижению основных морфометрических показателей каллусной культуры. Механизм подобного действия НЧ феррата цинка еще нуждается в дополнительном изучении.

Результаты исследования подтверждают выдвинутую разными авторами гипотезу о способности микрорастений и каллусных клеток базилика накапливать основные первичные и вторичные метаболиты, а также возможность управления этим процессом с помощью биологических (минеральный и гормональный состав питательной среды) и физических (наночастицы) элиситоров.

Работа выполнена в рамках тематического плана-задания на выполнение научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования “Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева” по заказу Минсельхоза России за счет средств федерального бюджета в 2023 г., а также при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в соответствии с соглашением № 075-15- 2022-746 от 13 мая 2022 г. (внутренний номер MK-3084.2022.1.4) о предоставлении гранта в виде субсидии из федерального бюджета Российской Федерации в рамках гранта Президента Российской Федерации на государственную поддержку молодых российских ученых ‒ кандидатов наук, докторов наук и ведущих научных школ Российской Федерации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Настоящая работа не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.