Физиология растений, 2023, T. 70, № 7, стр. 790-800

ВВЕДЕНИЕ

Растения рода чернушка (Nigella L.) характеризуются синтезом разнообразных биологически активных соединений, относящихся к различным химическим классам: летучие соединения терпеновой природы, сапонины, алкалоиды, жирные кислоты, фенольные кислоты и флавоноиды. Род чернушка насчитывает более 20 видов, но наибольшее внимание привлекают чернушка дамасская (Nigella damascena L.), чернушка посевная (N. sativa L.) и чернушка восточная (N. orientalis L.).

Семена N. sativa известны в мире под названием черный тмин. Они обладают перечным вкусом и мускатным запахом благодаря наличию эфирных масел и тимохинона, и широко используются в народной медицине [1].

N. damascena родом из Северной Африки. В настоящее время ее выращивают в Европе, Малой Азии и Индии как декоративное и пряно-ароматическое растение [2, 3]. Семена чернушки дамасской отличаются сильным ароматом с оттенком земляники и широко применяются в Юго-Восточной Азии в качестве пряности [4], надземная биомасса (верхушки генеративных побегов, листья, цветки и семена) являются сырьем для пищевой и фармацевтической промышленности [5].

N. orientalis произрастает в Малой Азии и на Кавказе, встречаясь там в посевах и по горным склонам [6]. Используется как декоративное растение в мавританских газонах, цветниках, для срезки в букеты и как флористический материал для летне-осенних и зимних композиций [7‒9].

Фитохимический состав семян N. sativa довольно разнообразен и широко изучен [10‒13], в то время как другая надземная часть растения исследуется не так часто. Учеными биотехнологического центра Туниса был установлен качественный состав фенольных соединений чернушки посевной, который включал фенольные кислоты (галловую, п-гидроксибензойную, хлорогеновую и др.) и флавоноиды (эпикатехин, кверцетин, апигенин и др.) [5].

У N. damascena подробно определен качественный и количественный состав полифенолов семян и проведено его сравнение с таковым семян чернушки посевной [4]. Отмечена схожесть качественного состава соединений фенольной природы у двух видов чернушки: основными соединениями являются гидроксибензойная и кофейная кислоты. Также обнаружены ванилиновая, сиреневая, галловая, п-кумаровая кислоты, катехин и отмечены незначительные количества коричной кислоты и кверцетина. Несмотря на идентичность качественного состава фенольных соединений семян чернушки посевной и дамасской авторы указали на количественные различия в биосинтезе отдельных соединений.

У N. orientalis достаточно хорошо изучены эфирные масла семян [7‒9], в то время как экстракты листьев ‒ недостаточно.

Учитывая литературные данные и результаты наших исследований по содержанию фенольных соединений в семенах растений рода Nigella, был проведен скрининг общего пула фенольных соединений в листьях и траве [14]. Было установлено, что листья разных видов чернушки содержали от 1.16 до 1.77 г/100 г сухого веса фенольных соединений, в то время как семена ‒ от 0.55 до 1.26 г/100 г сухого веса. Относительно высокое содержание фенольных соединений в листьях позволяет предложить их использование в качестве источника биологически активных веществ. В связи с этим, актуально было проведение сравнительного анализа качественного и количественного состава фенольных соединений в листьях разных видов чернушки, и установление взаимосвязи между характером их ростовых процессов и накоплением флавоноидных гликозидов.

Целью данной работы было изучение группы флавоноидных гликозидов в листьях растений рода Nigella, выращенных в условиях Центральной Беларуси. Мы полагаем, что определение качественного и количественного состава флавоноидных гликозидов и установление наличия видоспецифических зависимостей накопления этих веществ позволит установить взаимосвязь между содержанием отдельных флавоноидных гликозидов и особенностями ростовых процессов у разных видов чернушки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили растения трех видов: чернушка дамасская (Nigella damascena L.), чернушка восточная (N. orientalis L.) и чернушка посевная (N. sativa L.), выращенные на экспериментальном участке лаборатории прикладной биохимии Центрального ботанического сада Национальной академии наук Беларуси. Для количественного и качественного определения состава флавоноидных гликозидов использовали листья, собранные в фазу цветения, и высушенные до воздушно-сухого состояния. Растения выращивали в условиях мелкоделяночного полевого опыта рядовым способом, в одинаковых условиях по увлажнению, составу почвы и агротехническим мероприятиям. Экспериментальная выборка состояла из 100 растений, с каждого растения были взяты по 2 листа, высушены и гомогенизированы, полученный порошок использован для экстракции.

Получение экстрактов для анализа. Для экстракции использовали воздушно-сухое измельченное сырье, масса навески 2 г (точная навеска). Соотношение образца и экстрагента (г/мл) составляло 1 : 80. Экстракцию образцов проводили двумя способами. Первый способ включал двухступенчатую (по 40 мин) экстракцию 70% этанолом на водяной бане при 80°С, тогда как второй ‒ экстракцию 2М HCl и 96% этанолом (соотношение 1 : 1) на водяной бане при 80°С в течение 120 мин.

По первому способу ‒ полученные экстракты фильтровали через бумажный фильтр. Аликвоты (1 мл) экстрактов без гидролиза фильтровали через шприцевой мембранный фильтр в хроматографические виалы и использовали для ВЭЖХ-МС анализа.

По второму способу ‒ экстракты после кислотного гидролиза дополнительно гидролизовали при следующих условиях: 800 мкл образцов с HCl + 200 мкл конц. HCl (конечная концентрация в растворе около 3 М), затем инкубировали 2 ч в плотно закрытой хроматографической виале при температуре 98°С.

Описание ВЭЖХ-МС метода анализа. Для идентификации и количественного анализа фенольных соединений использовали метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим и УФ-детектором. Разделение компонентов проб проводили на колонке Agilent Zorbax XDB C18 (4.6 × 150 мм, 5.0 мкм) при температуре 40°С на жидкостном хроматографе Agilent 1200 (Agilent Technologies Inc., USA). Подвижная фаза состояла из двух растворителей: А – 0.1% муравьиная кислота (об/об) в воде и В – 0.1% муравьиная кислота (об/об) в ацетонитриле. Для анализа негидролизованных образцов использовали следующий градиент режима элюирования: процент растворителя В в подвижной фазе увеличивался от 5 до 25% за 20 мин, затем за следующие 10 мин – до 40%, а в 35 мин составлял 90%. Для гидролизованных образцов процентный состав растворителей в подвижной фазе изменялся за первые 10 мин от 5 до 25% растворителя В, увеличивался до 40% за 5 мин и оставался таким же в следующие 3 мин, в 25 мин составил 90%. Скорость потока элюента – 0.5 мл/мин. Детекция велась при длине волны 270 нм. Объем инжекции – 10 мкл (для количественного анализа) и 20 мкл (для качественного анализа). Температура в автосамплере 15°С. Хроматограф был онлайн сопряжен с тандемным масс-спектрометром Agilent 6410 Triple Quad (тройной квадруполь) (Agilent Technologies Inc., USA). В качестве интерфейса ионизации электрораспылением использовался Agilent G1948B API-ES (Agilent Technologies Inc., USA) в режиме отрицательных и положительных ионов. Для идентификации использовали режимы общего сканирования ионов в диапазоне масс от 100 до 1500 Д (MS2 Scan) и получения дочерних ионов (Product ion) из ионов с m/z, соответствующим [M + H]⁺ для молекулярных масс соединений в изучаемых экстрактах. Энергия в ячейке соударений при получении дочерних ионов варьировала от 15 до 45 В. Параметры работы масс-детектора: температура осушающего газа 350°C, скорость потока осушающего газа 7 л/мин, давление на распылителе 40 psi, напряжение на капилляре 4000 В, напряжение на фрагменторе 135 В (положительные ионы) и 200, 220 В (отрицательные ионы). Обработку хроматограмм с УФ- и масс-детекторов проводили с использованием компьютерного обеспечения Agilent MassHunter Workstation Software version B.01.03 и Agilent ChemStation (Agilent Technologies Inc., USA).

Растворы стандартов кемпферола (≥97%, Sigma), кверцетин дигидрат (≥99% HPLC, Extrasynthese) готовили в концентрациях 0.3–0.4 мг/мл в метаноле. Растворы для калибровочной кривой был в диапазоне концентраций от 7.5 до 150 мкг/мл. Для количественного анализа агликонов в образцах после гидролиза и фенольных соединений в негридролизованных образцах использовали хроматограммы с УФ-детектора. Содержание кемпферола и кверцетина рассчитывали по калибровочной кривой для соответствующих стандартов, флавоноидные гликозиды – по калибровочной кривой для кверцетина.

Математическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel. Проверка гипотезы о равенстве двух средних проводилась с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты представлены в виде средних значений 3 биологических повторностей и их стандартных ошибок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фенольные соединения у растений рода Nigella представлены различными группами флавоноидов, галлокатехинами, производными коричной и кофейной кислот. При этом для N. sativa и N. glandulifera было отмечено присутствие разнообразных по составу и строению гликозидов кверцетина и кемпферола в экстрактах семян и надземных частей растения [5, 11, 15–18]. ВЭЖХ-МС анализ метанольных экстрактов листьев чернушки трех изучаемых видов позволил предварительно идентифицировать гликозиды кверцетина и кемпферола. Для подтверждения наличия в составе гликозидов именно этих агликонов был проведен кислотный гидролиз и последующий ВЭЖХ-МС анализ. Кемпферол и кверцетин в гидролизованных образцах были идентифицированы путем сравнения со стандартами этих веществ (времена выхода и масс-спектры), их количественная оценка в экстрактах представлена в табл. 1.

На рис. 1 представлена хроматограмма с УФ-детектора при λ = 270 нм для негидролизованного экстракта чернушки посевной (проинтегрированы пики основных флавоноидных гликозидов). Анализ масс-спектров в пиках на хроматограммах общего ионного тока в режиме генерации отрицательных и положительных ионов позволил предположить возможные молекулярные массы (мол. м.) и фрагменты основных соединений (табл. 2, 3).

Рис. 1.

УФ-хроматограмма экстракта листьев Nigella sativa L.

Пики, приведенные в табл. 2, с временами удерживания (RT – retention times) 14.8, 15.3, 16.3, 16.7, 20.2 и 20.6 мин характеризуются одинаковой мол. м. 950 Д. В режиме генерации отрицательных ионов в масс-спектрах этих пиков были найдены ионы с m/z 949 = [M–H]^–, в режиме положительных ионов –m/z 973 = [M + Na]⁺, m/z 789 = [M + Н-162]⁺, m/z 303 = [M + Н-162-162-162-162]⁺ (табл. 3). Потеря фрагмента 162 Д характерна при отщеплении дегидратированной гексозы. Масс-спектр дочерних ионов при положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 627 = [M + Н-162-162]⁺, m/z 465 = [M + Н-162-162-162]⁺, m/z 303 = [M + + Н-162-162-162-162]⁺. Фрагмент с величиной m/z 303 соответствовал остатку агликона кверцетина, что было дополнительно подтверждено обнаружением кверцетина в гидролизованных образцах. Присутствующие в масс-спектрах ионы с m/z 325 = [162 + 162 + H]⁺ и m/z 163 = [162 + H]⁺ представляли собой появляющиеся при ионизации комбинации сахаров, входящих в состав гликозида. Таким образом, эти соединения являются гликозидами кверцетина и 4 гексоз.

Пики с временами удерживания 17.3, 17.8 и 18.1 мин соответствовали веществам с одинаковой мол. м. 788 Д. В масс-спектрах этих соединений, полученных при отрицательной ионизации, присутствовали ионы с m/z 787 = [M–H]^–, m/z 625 = = [M–Н-162]^–, в режиме положительных ионов ‒ m/z 811 = [M + Na]⁺, m/z 789 = [M + Н]⁺, m/z 303 = = [M + Н-162-162-162]⁺. Масс-спектр дочерних ионов при положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 627 = [M + Н-162]⁺, m/z 465 = = [M + Н-162-162]⁺, m/z 303 = [M + Н-162-162-162]⁺ (рис. 2a). Учитывая характерную фрагментацию с отщеплением фрагмента с мол. м. 162 Д и наличие иона агликона (мол. м. 303 Д), можно предположить, что эти соединения представляют собой гликозиды кверцетина и трех гексоз.

Рис. 2.

Масс-спектры в режиме получения дочерних ионов: а ‒ из m/z 789 для Nigella sativa; б ‒ из m/z 995 для Nigella sativa; в ‒ из m/z 935 для N. damascene; г ‒ из m/z 611 для N. orientalis.

Пик с RT 18.5 мин содержал вещество с мол. м. 772 Д, что подтверждается наблюдаемыми в масс-спектрах ионами с m/z 771 = [M–H]^– (отрицательная ионизация) и m/z 795 = [M + Na]⁺ (положительная ионизация). Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 449 = [M + Н-162-162]⁺, m/z 287 = [M + + Н-162-162-162]⁺. Фрагмент с величиной m/z 287 соответствовал остатку агликона кемпферола, что было дополнительно подтверждено его обнаружением в гидролизованных образцах. Таким образом, это соединение – гликозид кемпферола и трех гексоз (табл. 2).

Пики с временами удерживания 21.9, 22.3 и 22.6 мин соответствовали соединениям с одинаковой мол. м. 934 Д. В режиме отрицательных ионов были получены ионы с m/z 933 = [M–H]^–, в режиме положительных ионов ‒ m/z 957 = [M + Na]⁺, m/z 303 = [M + Н-162-162-162-146]⁺. Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 465 = [M + Н-162-162-146]⁺ и m/z 303 = [M + Н-162-162-162-146]⁺. Потеря фрагмента 162 Д характерна при отщеплении дегидратированной гексозы. Фрагмент молекулы с нейтральной потерей 146 Д может образовываться при отщеплении рамнозы (-H₂O). Ионы с m/z 309 = [146 + 162 + H]⁺, m/z 325 = [162 + + 162 + H]⁺, m/z 163 = [162 + H]⁺, m/z 147 = [146 + H]⁺ представляют собой появляющиеся при ионизации комбинации сахаров, входящих в состав гликозида (табл. 3). Учитывая характерную фрагментацию с отщеплением фрагмента с мол. м. 162 Д и 146 Д и наличие иона агликона (303 Д), можно предположить, что эти соединения представляют собой гликозиды кверцетина, трех гексоз и одной рамнозы.

Надо отметить, что пики с временами удерживания 22.3 и 22.6 мин являются смесью не разделившихся веществ, поэтому, помимо соединений с мол. м. 934 Д в этих же пиках присутствуют вещества с мол. м. 964 Д, которые есть и в пике с RT 22.9 мин. В режиме отрицательных ионов в масс-спектрах этих соединений обнаружены ионы с m/z 963 = [M–H]^–, в режиме положительных ионов ‒ m/z 987 = [M + Na]⁺, m/z 303 = [M + Н-162-162-162-176]⁺. Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 465 = [M + Н-162-162-176]⁺ и m/z 303 = [M + Н-162-162-162-176]⁺. Потеря фрагмента 176 Д может происходить при отщеплении либо остатка феруловой (–H₂O), либо остатка глюкуроновой кислоты (–H₂O). Агликон соответствует кверцетину (m/z 303). Ионы с m/z 339 = [176 + 162 + H]⁺, m/z 501 = [162 + 162 + 176 + H]⁺; m/z 177 = [176 + H]⁺ представляют собой появляющиеся при ионизации комбинации остатков сахаров и кислот, входящих в состав гликозида. Поэтому можно предположить, что эти соединения – гликозиды кверцетина, трех гексоз и одной молекулы феруловой или глюкуроновой кислоты. Также в пиках с временами удерживания 22.3 и 22.6 мин присутствовали вещества с мол. м. 994 Д, что подтверждается наличием ионов с m/z 993 = [M–H]^– (отрицательная ионизация) и m/z 303 = [M + Н-162-162-162-206]⁺ (положительная ионизация). Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 465 = [M + Н-162-162-206]⁺, m/z 303 = [M + Н-162-162-162-206]⁺ (рис. 2б). Агликон соответствует кверцетину (m/z 303). Ионы с m/z 369 = [162 + 206 + H]⁺, m/z 531 = [162 + 162 + 206 + H]⁺, m/z 207 = [206 + H]⁺ представляют собой появляющиеся при ионизации комбинации сахаров, входящих в состав гликозида (табл. 3). Полученные результаты согласуются с работой исследователей Технического университета в Лиссабоне [19]. Потеря фрагмента с m/z 206 соответствует ацильной группе, представленной синаповой кислотой. Таким образом, это соединение представляет собой ацилированный синаповой кислотой гликозид кверцетина и трех гексоз. Наши данные согласуются с литературными, так в экстрактах чернушки различных видов исследователями из Туниса, Италии, Боснии и Герцеговины, а также Чехии отмечено присутствие феруловой и синаповой кислот [5, 11, 15].

Для экстракта N. damascena на рис. 3 представлена хроматограмма с УФ-детектора при λ = 270 нм, на которой проинтегрированы пики основных флавоноидных гликозидов. Анализ масс-спектров пиков в режиме генерации отрицательных и положительных ионного тока позволил определить молекулярные массы и фрагменты основных соединений (табл. 2‒4).

Рис. 3.

УФ-хроматограмма экстракта листьев Nigella damascena L.

Пик с RT 16.1 мин соответствовал соединению с мол. м. 950 Д, с фрагментацией, аналогичной описанной для гликозидов кверцетина и четырех молекул гексоз в N. sativa. Вещества с временами удерживания 17.3, 22.5 и 22.9 мин имеют одинаковую мол. м. 934 Д и фрагментацию как гликозиды кверцетина, трех гексоз и одной рамнозы (рис. 2в). Для вещества с временем удерживания 18.4 мин и мол. м. 788 Д характерна фрагментация как для гликозидов кверцетина и трех гексоз в N. sativa. Соединения с временами удерживания 22.9 и 23.2 мин и мол. м. 964 Д имели масс-спектры аналогичные гликозиду кверцетина, трех гексоз и одной молекулы феруловой или глюкуроновой кислоты, как в экстракте N. sativa.

Пики с временами удерживания 17.3 и 17.7 мин (табл. 4) содержали вещества с одинаковой мол. м. 772 Д, и были предположительно идентифицированы как гликозиды кверцетина, двух гексоз и одной рамнозы, т. к. в режиме отрицательной ионизации были зарегистрированы ионы с m/z 771 = = [M–H]^–, а в режиме положительной ‒ m/z 795 = = [M + Na]⁺, m/z 773 = [M + H]⁺, m/z 303 = [M + + H-162-162-146]⁺. Агликон соответствовал кверцетину (m/z 303).

Соединения с временами удерживания 184 и 18.9 мин имели мол. м. 626 Д. В режиме отрицательных ионов были зарегистрированы ионы с m/z 625 = [M–H]^–, в режиме положительных ионов ‒ m/z 649 = [M + Na]⁺, m/z 627 = [M + H]⁺, m/z 465 = [M + H-162]⁺, m/z 303 = [M + H-162-162]⁺. Агликон соответствовал кверцетину (m/z 303) и можно предположить, что эти соединения – гликозиды кверцетина и двух гексоз.

Вещества с временами удерживания 21.1; 21.5 и 21.8 мин характеризовались одинаковой мол. м. 1080 Д, что подтверждается полученными в режиме отрицательной ионизации ионами с m/z 1079 = = [M–H]^– и m/z 300 = [M-2H-162-162-162-146-146]^–; в режиме положительных ионизации ‒ m/z 1081 = = [M + H]⁺, m/z 465 = [M + H-162]⁺, m/z 303 = [M + + Н-162-162-162-146-146]⁺. Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 611 = [M + H-162-162-146]⁺, m/z 449 = [M + Н-162-162-162-146]⁺, m/z 465 = [M + + Н-162-162-146-146]⁺, m/z 303 = [M + Н-162-162-162-146-146]⁺. Ионы с m/z 309 = [146 + 162 + H]⁺ и m/z 147 = [146 + H]⁺ представляли собой появляющиеся при ионизации комбинации сахаров, входящих в состав гликозида. Агликон соответствует кверцетину. Предположительно эти вещества – гликозиды кверцетина, трех гексоз и двух рамноз.

Вещество с мол. м. 1096 Д имело время удерживания 20.7 мин. Присутствовали ионы с m/z 1095 = [M–H]^–, m/z 300 = [M-2H-162-162-162-162-146]^– в режиме отрицательной ионизации и m/z 1119 = [M + Na]⁺, m/z 1097 = [M + H]⁺, m/z 303 = = [M + H-162-162-162-162-146]⁺ в режиме положительной ионизации. Агликон соответствует кверцетину (m/z 303). Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 465 = [M + Н-162-162-162-146]⁺, m/z 303 = [M + Н-162-162-162-162-146]⁺. Ионы с m/z 309 = [146 + 162 + H]⁺, m/z 147 = [146 + H]⁺ представляют собой появляющиеся при ионизации комбинации сахаров, входящих в состав гликозида. Таким образом, это соединение представляет собой гликозид кверцетина, четырех гексоз и одной рамнозы.

В масс-спектре вещества с временем удерживания 21.1 мин в режиме отрицательных ионов присутствовали ионы с m/z 1125 = [M–H]^–, m/z 300 = [M-2H-162-162-162-162-176]^–, а в режиме положительных ионов ‒ m/z 1149 = [M + Na]⁺, m/z 1127 = [M + H]⁺, m/z 303 = [M + H-162-162-162-162-176]⁺, и соответственно, его молекулярная масса составляет 1126 Д. Агликоном является кверцетин. Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 664 = [M + Na-162-162-162]⁺, m/z 465 = = [M + Н-162-162-162-176]⁺, m/z 303 = [M +Н-162-162-162-162-176]⁺. Ионы с m/z 339 = [176 + 162 + + H]⁺, m/z 501 = [162 + 162 + 176 + H]⁺; m/z 177 = = [176 + H]⁺ представляют собой появляющиеся при ионизации комбинации сахаров, входящих в состав гликозида. Потеря фрагмента с m/z 176 соответствует либо глюкуроновой кислоте, либо ацильной группе, представленной феруловой кислотой. Поэтому данное соединение может являться гликозидом кверцетина, четырех гексоз и одной молекулы феруловой или глюкуроновой кислоты.

На рис. 4 представлена УФ-хроматограмма (λ = 270 нм) основных флавоноидных гликозидов для экстракта листьев N. orientalis. Анализ масс-спектров пиков в режиме генерации отрицательных и положительных ионов на хроматограммах общего ионного тока позволил определить молекулярные массы и фрагменты основных соединений (табл. 3, 5).

Рис. 4.

УФ-хроматограмма экстракта листьев Nigella orientalis L.

Вещества с временами удерживания 15.2, 16.1 и 16.5 мин имели мол. м. 788 Д и фрагментацию аналогичную для соединений с такой же массой, обнаруженных в N. sativa и N. damascene. Предположительно эти соединения – гликозиды кверцетина и трех молекул гексоз. Вещества с одинаковой мол. м. 626 Д и временами удерживания 18.4 и 18.9 мин являются гликозидами кверцетина и двух гексоз с масс-спектрами аналогичными для такого же вещества в N. damascene.

В пиках с временами удерживания 17.3 и 17.7 мин присутствовали вещества с одинаковой мол. м. 874 Д, что подтверждается обнаруженными ионами с m/z 873 = [M–H]^– (режим отрицательной ионизации) и m/z 875 = [M + H]⁺ (режим положительных ионов). Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 713 = [M + Н-162]⁺, m/z 551 = = [M + Н-162-162]⁺; m/z 465 = [M + Н-162-162-86]⁺; m/z 303 = [M + Н-162-162-162-86]⁺. Агликон (m/z 303) соответствует кверцетину. Потеря фрагмента с m/z 86 соответствует ацильной группе, представленной малоновой кислотой [19]. Таким образом, это соединение представляет собой гликозид кверцетина, трех гексоз и молекулы малоновой кислоты. Соединения с одинаковой мол. м. 712 Д имели времена удерживания 19.7 и 20.2 мин. В режиме положительной ионизации зарегистрированы ионы с m/z 713 = [M + H]⁺, m/z 735 = [M + Na]⁺, m/z 751 = [M + K]⁺. Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал ион агликона кверцетина: m/z 303 = = [M + Н-сахара]⁺. Это соединение представляет собой гликозид кверцетина.

В масс-спектре вещества с мол. м. 610 Д и временем удерживания 20.6 мин в режиме отрицательной ионизации присутствовали ионы с m/z 609 = [M–H]^–, в режиме положительной ионизации ‒ m/z 633 = [M + Na]⁺, m/z 611 = [M + H]⁺. Масс-спектр дочерних ионов в положительной ионизации содержал следующие ионы: m/z 449 = = [M + Н-162]⁺; m/z 287 = [M + Н-162-162]⁺ (рис. 2г). Агликон с m/z 287 соответствует кемпферолу. Соединение является гликозидом кемпферола и двух гексоз.

Суммарное количество флавоноидных гликозидов в экстрактах листьев N. sativa был в 4 раза выше, чем в экстрактах двух других видов чернушки (табл. 2, 4, 5). При этом следует отметить, что в листьях всех исследованных видов чернушки преобладали гликозиды кверцетина, что также подтверждается суммарным содержанием агликона кверцетина в гидролизованнных экстрактах. Несмотря на то, что содержание кемпферола в образцах после гидролиза всего в 1.40–1.97 раза меньше (табл. 1), чем кверцетина, нам удалось обнаружить на хроматограммах лишь два его гликозида. Учитывая наблюдаемое разнообразие состава гликозидов кверцетина, можно предположить, что растения рода чернушка также способны синтезировать и накапливать различные по составу и строению производные кемпферола. По-видимому, из-за возможного разнообразия соединений кемпферола, его более низкого содержания и анализа грубого экстракта без предварительных фракционирования, очистки и концентрирования, мы не смогли идентифицировать на хроматограммах и в масс-спектрах все гликозиды кемпферола.

Таким образом, установлено что листья N. sativa в условиях Центральной Беларуси имеют наиболее богатый состав флавоноидных гликозидов по отношению к другим изучаемым видам. По качественному составу флавоноидных гликозидов вид N. damascene наиболее близок к N. sativa, тогда как по общему содержанию этой группы соединений ‒ к N. orientalis. Стоит упомянуть, что виды N. sativa и N. damascene имеют наибольшее фенотипическое сходство и более устойчивы к условиям произрастания в Беларуси (на основании 9-летних полевых экспериментов на территории Центрального ботанического сада Национальной академии наук Беларуси). Отмечено, что вид N. orientalis отличается внешне и более требователен к условиям культивирования. Полевые испытания изучаемых видов чернушки показали, что N. sativa и N. damascene стабильно дают жизнеспособные семена, всхожесть которых колеблется в пределах 60–80%, в то время как семена N. orientalis имели всхожесть 20-45% и были отмечены 2 года, когда семена не успели вызреть. Также следует отметить различия в габитусе растений: виды N. sativa и N. damascene отличаются большей высотой и кустистостью с количество побегов первого порядка 5–9 шт., тогда как вид N. orientalis формировал 2–3 побега первого порядка. Было установлено, что в листьях N. orientalis разнообразие флавоноидных гликозидов меньше, при отсутствии высокомолекулярных и ацилированных форм. Известно [20], что гликозилирование и ацилирование позволяет улучшать растворимость, химическую стабильность флавоноидов, их участие в активном мембранном транспорте и защите от УФ-излучения, повышая способность к его поглощению и нейтрализации АФК. Возможно отсутствие ацилированных производных и меньшее разнообразие флавоноидных гликозидов сказывается на низкой устойчивости N. orientalis к абиотическим факторам и снижает его адаптационный потенциал. Опираясь на данные по мультилокусному ДНК-маркированию 3 видов рода Nigella [21] можно предположить генетическую обусловленность состава флавоноидных гликозидов у видов этого рода. Так, вид N. orientalis занимает отдельный кластер на дендрограмме, отражающей степень генетического сходства (на основе 235 маркеров (RAPD и ISSR)), в то время как виды N. sativa и N. damascene относятся к одному кластеру.

Работа выполнена при финансовой поддержке задания 06.02 Государственной программы научных исследований “Природные ресурсы и окружающая среда”, подпрограмма “Биоразнообразие, биоресурсы, экология” (2021–2025).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов.

Авторы В.Н Решетников, Е.В. Спиридович и С.Н. Шиш выдвинули и разработали схему эксперимента. Образцы для анализа были подготовлены С.Н. Шиш. Авторы П.С. Шабуня и С.А. Фатыхова провели ВЭЖХ-МС экстрактов на содержание флавоноидых гликозидов, а также расчеты содержания веществ с описанием их идентификации. Авторы С.Н. Шиш, П.С. Шабуня и Е.В. Спиридович участвовали в написании текста статьи. Все авторы участвовали в обсуждении и изложении результатов.