Физиология растений, 2023, T. 70, № 7, стр. 898-905

ВВЕДЕНИЕ

Каротиноиды – это широко распространенные группы изопреноидных пигментов, образующиеся в результате конденсации восьми изопреноидных единиц. По наличию заместителей их подразделяют на две группы: простые углеводородные соединения – каротины и их окисленные производные – ксантофиллы, содержащие окси-, эпокси- и кетогруппы. Они синтезируются во всех фотосинтезирующих организмах, а также в некоторых нефотосинтезирующих бактериях и грибах. Согласно немногим данным, папоротники и мхи содержат, в основном, те же самые каротиноиды, что и высшие растения [1].

Биологическая активность каротиноидов определяется их высокой антиоксидантной активностью [2]. Каротиноиды являются активными поглотителями синглетного кислорода в растениях, что обуславливает их важную биологическую функцию – защиту клеточных компонентов, таких как хлорофиллы, липиды, белки, ДНК и др., от окислительного повреждения. Каротиноиды синтезируются в тесной координации с хлорофиллами, и их состав консервативен у высших растений [3]. В зеленых тканях растений каротиноиды участвуют в механизмах фотозащиты и стабилизации фотосинтетического аппарата [4]. Известно, что ксантофилловый цикл, или виолаксантиновый цикл (ВКЦ), выполняет функцию защиты фотосинтетического аппарата от избытка энергии при повышенной инсоляции и повреждающего действия синглетного кислорода. Цикл включает в себя ферментативные взаимопревращения между виолаксантином (Вио) и зеаксантином (Зеа) (промежуточный продукт – антероксантин) [5, 6]. При этом главную фотопротекторную функцию выполняет Зеа, на который переносится энергия возбуждения хлорофилла и далее преобразуется в тепловую. Этот механизм известен как нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла (NPQ) [7]. У каротиноидов выделяют и другие биологические функции, их накопление во многих цветках и плодах обеспечивает привлечение опылителей, способствует рассеиванию семян птицами. Наконец, каротиноиды служат предшественниками для синтеза растительных гормонов – абсцизовой кислоты (AБК) и стриголактонов, а также других апокаротиноидов, которые участвуют во многих процессах развития и стрессовых реакциях [8, 9]. В связи с важностью каротиноидов для физиологии, развития, экологии и эволюции растений, изучение их метаболизма и функций представляет значительный интерес.

Путь биосинтеза каротиноидов широко изучен на высших растениях, и почти все вовлеченные гены выделены и охарактеризованы [10, 11]. У высших растений некоторые гены биосинтеза каротиноидов являются избыточными, что позволяет предположить, что эти гены были дублированы и функционально разошлись в ходе эволюции растений.

В отличие от высших сосудистых растений, в литературе имеется мало информации о составе каротиноидов и их роли в стрессовой устойчивости у мохообразных, которые считаются эволюционно ранними наземными несосудистыми растениями. Для понимания эволюции биосинтеза каротиноидов в растениях изучение данного процесса у мохообразных является весьма актуальной задачей. Анализ литературы выявил наличие лишь единичных работ по исследованию состава каротиноидов и идентификации генов их биосинтеза у мохообразных, в частности, Physcomitrium patens и Marchantia polymorpha [12, 13]. Как и высшие сосудистые растения, побеги мхов содержат в качестве основных каротиноидов лютеин (Лют) и β-каротин (β-кар) [12]. Ранее нами был проведен анализ антиоксидантной активности органических экстрактов нескольких видов мхов – Dicranum scoparium, Pleurozium schreberi, Hylocomium splendens, Sphagnum magellanicum. Было показано, что среди экстрактивных веществ именно каротиноиды обладают наибольшей антирадикальной активностью в отношении 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ). При этом самое высокое количество каротиноидов содержалось в экстракте мха H. splendens (неопубликованные данные). Несмотря на широкую распространенность H. splendens в лесах Северного полушария и горных местностях, информация о стрессовой устойчивости данного бриофита отсутствует. В частности, остаются практически неизученными изменения каротиноидного состава этого мха в стрессовых условиях. На основании вышесказанного, исследование изменения профиля каротиноидов и генов их биосинтеза малоизученного лесного мха H. splendens в условиях температурного стресса является актуальным и может дать недостающую информацию о роли каротиноидов в стрессовых ответах у мохообразных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В качестве объекта исследования был использован мох Hylocomium splendens Hedw., собранный в лесах Айшинского лесничества Республики Татарстан (55°53 21.3 с.ш 48°38 14.3 в.д) в мае 2022 г. После предварительной очистки сухие побеги мха хранились в контролируемых прохладных условиях в темноте. Основываясь на полученных ранее результатах по оценке фотосинтетической активности разных ярусов мха H. splendens на воздействие неблагоприятных температур [14], для анализа нами была использована верхняя часть побега (первые два яруса), в которой метаболические процессы идут интенсивнее, в т. ч. ответные реакции на стрессовые воздействия.

Стрессовая обработка. Побеги мха H. splendens гидратировали дистиллированной водой в течение 24 ч при температуре 10°C в условиях темноты. Далее гидратированные образцы мха инкубировали в течение 1 ч в климатической камере с контролируемой отрицательной (–20°С) и повышенной (30°С) температурами. Для оценки стрессового ответа мха материал отбирали сразу же после воздействия неблагоприятных температур, а также через 1, 3, 5, 24 ч выдерживания мха при комнатной температуре после стрессового воздействия. Оводненность образцов мха определяли в каждой временной точке высушиванием до постоянного веса на анализаторе влажности АВГ-60 (“Госметр”, Россия).

Анализ профиля каротиноидов. Исследование состава и содержания каротиноидов проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе LicArt 62 (“Лабконцепт”, Россия). Пробоподготовку и разделение пигментов осуществляли согласно [15] c небольшими модификациями. Образец мха растирали в жидком азоте, из полученного порошка отбирали навеску массой 0.1 г и переносили в эппендорф, добавляли 0.5 мл ацетона. Для интенсификации извлечения каротиноидов смесь в эппендорфе подвергали обработке 5 мин ультразвуком (ванна ультразвуковая “Сапфир”, Россия), далее центрифугировали 5 мин при 10 000 об/мин. Стадии экстрагирования повторяли до максимально полного извлечения пигментов из навески мха (5–6 стадий). Полученные экстракты объединяли и высушивали на роторном испарителе RV 8 (“IKA”, Германия). Для ВЭЖХ использовали: элюент А – ацетонитрил : метанол : вода (75 : 12 : 4), элюент В – метанол : этилацетат (68 : 32). Высушенные экстракты пигментов растворяли в 400 мкл элюента А, центрифугировали 5 мин при 10 000 об/мин, 20 мкл супернатанта отбирали и хроматографировали на колонке с обращенной фазой Inertsil ODS-3, 3 мкм, 4.6 × 100 мм (“GL Sciences”, Япония). Соединения хроматографировали при градиентном режиме со следующей последовательностью элюентов: 0 мин А – 100%; 0–15 мин А – 0% и В – 100%; 15–40 мин В – 100%. Скорость потока элюента 0.5 мл/мин. Температура хроматографирования составляла 25°С. Каротиноиды детектировали с помощью диодно-матричного детектора DAD-62 (“Лабконцепт”, Россия) при 440 нм. Управление работой хроматографа, прием и обработку полученных данных проводили с помощью специализированной компьютерной программы “LicArt WSV”.

Идентификацию каротиноидов в экстрактах мха осуществляли по электронным спектрам в области 300–700 нм [16, 17] и путем сопоставления с временами выхода стандартов каротиноидов – β-каротина и лютеина (“Sigma-Aldrich”, США, степень чистоты не менее 95%), хроматографируемых при аналогичных условиях.

Анализ относительного уровня экспрессии генов. Анализ экспрессии гена каротин ε-монооксигеназы (HsLUT1) осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Тотальную РНК H. splendens выделяли с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit (“Qiagen”, Германия), согласно инструкции производителя. Концентрацию и чистоту РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop® ND-1000 (“Thermo Scientific”, США), целостность проверяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Реакцию обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) проводили на термоциклере С1000 Touch™ (“Bio-Rad”, США) с набором MMLV RT (“Евроген”, Россия) в реакционном объеме 25 мкл по стандартному протоколу производителя. ПЦР-РВ проводили с использованием системы CFX Connect Real-Time PCR (“Bio-Rad”, США). Оценку уровня экспрессии гена HsLUT1 осуществляли относительно референсных генов: 18S рРНК (18S), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH2), α-тубулина 1 (TUB1), α-тубулина 2 (TUB2) [18].

Анализ фотосинтетических параметров. Модулированную флуоресценцию хлорофилла a измеряли на базе системы PAM (от англ. Pulsе Amplitude Modulation) при помощи флуориметра FMS1+ (“Hansatech Instruments”, Великобритания) со стандартной листовой клипсой с использованием красного светодиода. После периода темновой адаптации продолжительностью не менее 10 мин производили вспышку насыщающего света в 85 ед. продолжительностью 0.7 с (максимальная интенсивность до 13 000 мкмоль фотонов/м² с) и измеряли максимальную флуоресценцию (F_M). После снижения уровня флуоресценции до исходного темнового значения (F₀) включали непрерывный действующий свет с плотностью потока 105 мкмоль фотонов/м² с, и через 40 с включали второй насыщающий импульс для определения максимального выхода флуоресценции ($F_{{\text{M}}}^{'}$) в адаптированном к свету состоянии. По полученным значениям рассчитывали NPQ по формуле:

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 3–6 биологических повторностях и 3–14 аналитических повторностях. Полученные данные представлены в виде средних арифметических значений со стандартными ошибками (SE). Все экспериментальные данные имеют нормальное распределение признака. Для сравнения их средних арифметических значений использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с оценкой попарных различий с помощью критериев Тьюки, Бонферрони. Различия в экспрессии генов оценивали по нормализованной экспрессии (∆∆Cq) в Bio-Rad CFX Maestro, достоверность анализировали с использованием ANOVA и по тесту на нормальность по Шапиро–Уилку.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия гена биосинтеза лютеина HsLUT1 в побегах мха H. splendens в условиях температурного стресса

Ранее нами были клонированы и секвенированы десять генов биосинтеза каротиноидов мха H. splendens [18]. В настоящей работе мы проанализировали изменение относительного уровня транскриптов основного гена биосинтеза лютеина HsLUT1 при действии низкой отрицательной (–20°С) и положительной (30°С) температур (рис. 1). Так, достоверное 5-кратное увеличение относительного уровня транскриптов HsLUT1 наблюдалось при действии –20°С в течение 1 ч. При действии 30°С также происходило достоверное повышение относительного уровня транскриптов HsLUT1, но в меньшей степени, в 4 раза.

Рис. 1.

Уровень транскриптов гена HsLUT1 в H. splendens при действии низкой отрицательной и положительной температур. Уровень транскриптов контрольных вариантов принят за единицу. Три звездочки представляют значительную разницу при Р ≤ 0.001.

Изменения фотосинтетических параметров в побегах мха H. splendens в условиях температурного стресса

Было показано, что 1 ч воздействие неблагоприятных температур приводило к достоверному снижению NPQ, причем более сильные изменения наблюдались при воздействии отрицательной температуры (рис. 2). Разнонаправленные изменения NPQ наблюдались в постстрессовый период. Так, через 1 ч выдерживания мха при оптимальной температуре после воздействия отрицательной температуры уровень NPQ повышался в 8 раз, восстанавливаясь до контрольного уровня, а при воздействии повышенной температуры он практически не изменялся. В последующем через 24 ч постстрессового периода после воздействия обеих неблагоприятных температур значения NPQ существенно не изменялись (рис. 2).

Рис. 2.

Нефотохимическое тушение (NPQ) в побегах мха H. splendens при действии неблагоприятных температур: –20°С (сплошная линия) и 30°С (штриховая линия). 1 – контроль; 2 – стрессовое воздействие; 3 – 1 ч постстрессового периода после стрессового воздействия; 4 – 24 ч постстрессового периода после стрессового воздействия. На рисунке представлены средние арифметические значения и стандартные ошибки (SE) при n = 14. Достоверность различий определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) при Р < 0.05 (*); Р < 0.001 (***).

ОБСУЖДЕНИЕ

В течение своего жизненного цикла растения испытывают воздействие различных видов стрессовых воздействий, таких как засуха, засоление и высокая температура. Знание о механизмах чувствительности и/или устойчивости видов растений к изменяющимся условиям внешней среды является необходимым условием для обеспечения выживания растений, сохранения их генотипа и поддержания разнообразия флоры. Растения выработали различные механизмы устойчивости к стрессу, включая регуляцию фотосинтеза; детоксикацию активных форм кислорода (АФК) за счет усиления активации антиоксидантных ферментов и накопления низкомолекулярных антиоксидантов; а также накопления вторичных метаболитов, в частности, каротиноидов [19]. Согласно современным представлениям, основными биологическими функциями каротиноидов являются светособирающая, антиоксидантная, фотопротекторная и структурная функции [19, 20]. Многочисленными исследованиями доказано, что уровень каротиноидов в растениях может быть связан со стрессовой устойчивостью. Например, устойчивость к солевому стрессу у бобов тесно коррелирует с устойчивым уровнем каротиноидов, а сахарный тростник повышает свою солеустойчивость за счет снижения содержания хлорофилла и стабильного уровня каротиноидов [19]. При произрастании живучки ползучей в открытых местообитаниях, и соответственно, в условиях высокой инсоляции, адаптивными реакциями в растениях являлись уменьшение содержания хлорофиллов в листьях и светособирающих комплексов (ССК) фотосистем, активирование конверсии пигментов в ВКЦ с накоплением Зеа (деэпоксидации подвергалось до 80% пула Вио) [6]. В работе Arroniz-Crespo с соавт. идентифицирован состав каротиноидов мха H. splendens и показаны изменения в их содержании при воздействии УФ-Б облучения [21].К сожалению, в литературе имеется крайне ограниченная информация об изменениях пула каротиноидов в растениях при действии неблагоприятных температур. В связи с этим основной целью настоящей работы была оценка изменений профиля каротиноидов в побегах мха H. splendens при воздействии неблагоприятных температур. Состав каротиноидов мха H. splendens соответствует имеющимся литературным данным [21], за исключением Ант, не детектируемым в экстрактах мха. Можно полагать, что содержание этого ксантофилла во мхе очень мало. Основными каротиноидами являются Лют и β-кар. Дополнительно в составе каротиноидов мха показано наличие α-кар, на долю которого приходится в среднем 1%. Три каротиноида, обнаруженные в экстракте мха, точно идентифицировать не удалось, однако, основываясь на литературных данных [16, 17], каротиноиды (н.и. 2 и н.и. 3) могут быть отнесены к α-криптоксантину и β-криптоксантину, соответственно.Показано, что воздействие обеих неблагоприятных температур вызывает существенное снижение общего содержания каротиноидов. При этом анализ индивидуальных каротиноидов позволил установить, что именно содержание Вио резко падает при стрессовой обработке, и даже через 24 ч выдерживания мха при оптимальной температуре после воздействия его уровень не восстанавливается до контрольного уровня, а, напротив, становится еще меньше (табл. 1). Общим изменением в профиле каротиноидов мха H. splendens при воздействии обеих неблагоприятных температур является увеличение содержания Лют, Зеа и β-кар, наблюдаемое непосредственно после стрессовой обработки и в постстрессовом периоде (через 24 ч). На рис. 3 представлена схема пути биосинтеза каротиноидов у растений. Типичные каротиноиды (тетратерпены) синтезируются из первого каротиноидного фитоена, который образуется в результате конденсации двух молекул геранилгеранилдифосфата. Как видно из схемы биосинтеза каротиноидов, Лют образуется из α-кар. Содержание этого ксантофилла наибольшее в фотосинтетическом аппарате высших растений. Он выполняет такие важные функции, как стабилизация структуры антенных белков, светособирающая и фотопротекторная функции [6, 7]. Увеличение содержания Лют в побегах мха при действии неблагоприятных температур (табл. 1) коррелирует с данными [23], где показано, что при низких положительных температурах в связи с ростом вероятности образования АФК в ССК фотосинтетического аппарата наблюдается накопление Лют, выполняющего в этом случае функцию антиоксиданта. В связи с тем, что Лют является преобладающим каротиноидом мха H. splendens, представлялось целесообразным проанализировать изменения экспрессии гена его биосинтеза в ответ на действие неблагоприятных температур. Основным ферментом биосинтеза лютеина является каротин ε-монооксигеназа – CYP97C1 или LUT1 [24]. Это фермент, катализирующий стереоспецифическую реакцию, является представителем семейства 97 цитохрома Р450 – наиболее древних растительных Р450. Ранее сообщалось, что в стареющих листьях A. thaliana экспрессия AtCYP97C1 значительно снижалась, что сопровождалось снижением содержания каротиноидов α-каротиновой ветви пути биосинтеза [25]. В наших экспериментах показано, что экспрессия HsLUT1 при действии отрицательной и положительной температур увеличивается в 5 и 4 раза, соответственно (рис. 1), что согласуется с данными по стресс-индуцированному увеличению содержания каротиноидов α-каротиновой ветви пути биосинтеза (α-кар и Лют) (табл. 1). Таким образом, можно полагать, что HsLUT1 вовлечен в реакции мха H. splendens на температурный стресс. При гидроксилировании β-кар образуется Зеа, ключевой участник ВКЦ. Поскольку в общей сумме каротиноидов мха увеличивается содержание β-кар и Зеа, можно предположить, что в условиях температурного стресса активируется биосинтез непосредственно β-кар, тогда как прирост Зеа, по-видимому, обусловлен степенью деэпоксидации Вио. Действительно, его содержание резко падает, как при действии отрицательной, так и повышенной температур (табл.1). Повышение уровня β-кар в побегах мха, обладающего высокими антиоксидантными свойствами, может обеспечивать защиту мембран, ДНК и других клеточных структур от окислительного повреждения, вызванного воздействием неблагоприятных температур. Кроме того, β-кар, входящий в структуру реакционных центров фотосистемы I и II (ФСI и ФСII), может способствовать сохранению этих комплексов [20]. Не менее важным является повышение уровня Зеа в побегах мха (табл. 1). Известно, что он играет роль антиоксиданта и стабилизатора структуры мембран, участвуя в детоксикации АФК и подавляя перекисное окисление липидов [7]. Надо отметить, что Зеа играет ключевую роль в защите ФСII от фотоингибирования вследствие увеличения теплового рассеивания той части энергии, которая не используется для фотосинтетического электронного транспорта. Обычно увеличение пула Зеа при стрессовых воздействиях находится в прямой зависимости с показателем NPQ [7]. В наших экспериментах, несмотря на увеличение содержания Зеа, показатель NPQ существенно падает, причем более выраженно при воздействии отрицательной температуры. Далее, в постстрессовый период после воздействия отрицательной температуры, он восстанавливается до контрольного уровня, а после воздействии повышенной температуры уровень NPQ не изменяется (рис. 2). Объяснить наблюдаемый эффект сложно, можно только предположить, что повышение уровня каротиноидов в условиях температурного стресса, главным образом, обусловлено необходимостью “тушить” синглетный кислород. Известно, что Зеа играет важную роль в стрессовой устойчивости растений к холоду. Например, в работе Tang с соавт. было показано, что предварительная обработка Зеа повышает устойчивость проростков перца к холоду, снижает повреждение листьев от охлаждения, увеличивает биомассу растений и содержание фотосинтетических пигментов в условиях холодового стресса. Было также установлено, что экзогенный Зеа повышает устойчивость к холоду, индуцируя накопление эндогенного Зеа [26].Таким образом, было выявлено, что изменения экспрессии гена HsLUT1 при температурном стрессе сопровождаются изменениями содержания каротиноидов. Полученные приоритетные данные расширяют наше знание о механизмах устойчивости у мохообразных и будут способствовать пониманию эволюционных изменений стрессовой устойчивости высших растений. Авторы А.Г. Ренкова и В. Р. Хабибрахманова внесли одинаковый вклад в данную работу.Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (№ 22-24-00595).Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Рис. 3.

Схема пути биосинтеза каротиноидов у растений. Прямоугольником показаны метаболиты, которые количественно были определены в данном исследовании. Показан фермент LUT1 – каротин ε-монооксигеназа, анализ гена которого проводился в данном исследовании.