Генетика, 2019, T. 55, № 1, стр. 100-109
Роль генов сывороточного амилоидного белка А1, молекул адгезии, хемокинов и их рецепторов в развитии хронической обструктивной болезни легких
Г. Ф. Корытина 1, *, Л. З. Ахмадишина 1, О. В. Кочетова 1, Ю. Г. Азнабаева 2, Ш. З. Загидуллин 2, Т. В. Викторова 1, 2
1 Институт биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра
Российской академии наук
450054 Уфа, Россия
2 Башкирский государственный медицинский университет, кафедра биологии,
кафедра пропедевтики внутренних болезней
450000 Уфа, Россия
* E-mail: guly_kory@mail.ru
Поступила в редакцию 13.12.2017
После доработки 03.04.2018
Принята к публикации 14.03.2018
Аннотация
Хроническая обструктивная болезнь легких – многофакторное хроническое воспалительное заболевание респираторной системы. Воспаление является ключевой концепцией патогенеза заболевания. Цель настоящего исследования заключалась в выявлении ассоциации аллелей и генотипов генов хемокинов и хемокиновых рецепторов (CCL11, CX3CR1, CCR5, CCL5, CXCL12, CCL2, CCL17), молекул адгезии (PECAM1, ICAM1) и сывороточного амилоидного белка A1 (SAA1) с развитием хронической обструктивной болезни легких. Ассоциация с развитием заболевания была установлена для аллеля C (P = 0.0001, OR = 1.58) и генотипа TC (P = 0.00001, OR = 2.15) гена SAA1 (rs1136743C>T); полученная ассоциация подтверждена в группах, дифференцированных по статусу курения. Маркерами риска развития хронической обструктивной болезни легких являются генотипы CG гена PECAM1 (rs281865545G>C) (P = 0.028, OR = 1.36) и GG гена ICAM1 (rs5498A>G) (P = 0.005, OR = 1.66), которые статистически значимо ассоциированы с развитием заболевания только в группе курильщиков. Генотип AA гена CCL2 (rs1024611A>G) ассоциирован с развитием болезни у некурящих индивидов (P = 0.037, OR = 1.82). Генотипы GG гена PECAM1 (rs281865545G>C) и AA гена CX3CR1 (rs3732378A>G) связаны с более высокими показателями жизненной емкости легких (P = 0.014 и P = 0.04). У индивидов с генотипом GG гена ICAM1 (rs5498A>G) было отмечено снижение показателей объема форсированного выдоха за первую секунду и форсированной жизненной емкости легких (P = 0.025 и P = 0.029).
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является одним из наиболее распространенных заболеваний в мире, поздно диагностируемым, трудно поддающимся лечению и представляющим актуальную проблему здравоохранения [1]. Согласно современному определению ХОБЛ – многофакторное хроническое гетерогенное воспалительное заболевание респираторной системы с преимущественным поражением дистальных отделов дыхательных путей и легочной паренхимы [1]. Основным фактором риска развития ХОБЛ является табакокурение, однако симптомы обструкции дыхательных путей развиваются только у 10–20% постоянных курильщиков. С воздействием сигаретного дыма связывают появление патологических процессов в легких, развитие системных воспалительных реакций и дисфункцию эндотелия сосудов [1, 2].
Генетические механизмы формирования ХОБЛ в последние годы стали объектом широкомасштабных исследований во всем мире. При полногеномных исследованиях генетических ассоциаций (GWAS) выявлено несколько локусов, связанных с развитием ХОБЛ, на 4-й и 15-й хромосомах в области 15q25.1 – CHRNA3, CHRNA5, IREB2, PSMA4, 4q31.21 – HHIP, 4q22.1 – FAM13A, rs7937 на хромосоме 19q13 [3]. С другой стороны, механизмы прогрессирования ХОБЛ и развития высокого уровня воспаления в легких остаются малоизученными.
Воспаление является ключевой концепцией патогенеза ХОБЛ. У больных ХОБЛ, особенно в тяжелой стадии и во время обострений, повышается уровень маркеров системного воспаления: циркулирующих цитокинов и хемокинов, белков острой фазы и количество лейкоцитов [4]. Мы предполагаем, что аллельные варианты генов, кодирующих факторы, вовлеченные в развитие воспалительного ответа, могут быть ассоциированы с развитием ХОБЛ и прогрессированием заболевания. В данном исследовании мы сосредоточились на полиморфных вариантах генов белков острой фазы воспаления, молекул адгезии, хемокинов и их рецепторов.
Сывороточный амилоидный A1-белок (SAA1) – ключевой фактор острой фазы воспаления, способствует хемотаксису, миграции и адгезии воспалительных клеток, особенно моноцитов и макрофагов [5]. В ряде исследований показано, что SAA играет роль в повреждении легочной ткани при курении [6].
ICAM1 (intercellular adhesion molecule 1) – это одноцепочечный гликопротеин, интегральный мембранный белок, экспрессируется на различных типах эпителиальных клеток, фибробластах, тканевых макрофагах [7]. В многочисленных исследованиях доказана вовлеченность молекулы ICAM1 в патогенез воспалительных и аутоиммунных заболеваний [7–9]. PECAM1 (platelet and endothelial cell adhesion molecule 1) относится к классу молекул клеточной адгезии, принадлежит к семейству иммуноглобулинов, в основном экспрессируется сосудистыми клетками, выявляется на тромбоцитах, моноцитах, нейтрофилах. Исследования подтверждают участие PECAM1 в воспалительных реакциях и взаимодействии лейкоцитов с эндотелиальными клетками [10].
Хроническое системное воспаление при ХОБЛ связано с постоянной продукцией альвеолярными макрофагами и нейтрофилами и другими активированными клетками воспалительных факторов: провоспалительных цитокинов, фибриногена, С-реактивного белка, хемокинов [11]. Хемокины – полипептиды молекулярной массой 5–20 кДа, представляющие собой хемоаттрактантные цитокины, действующие через рецепторы [12, 13]. Выделяют четыре группы хемокинов, различающиеся спектром мишеней. Наиболее известны СС-хемокины, привлекающие моноциты и лимфоциты [12, 13].
Цель настоящего исследования заключалась в выявлении ассоциации аллельных вариантов генов хемокинов и хемокиновых рецепторов (CCL11, CX3CR1, CCR5, CCL5, CXCL12, CCL2, CCL17), молекул адгезии (PECAM1, ICAM1) и сывороточного амилоидного белка А1 (SAA1) с развитием хронической обструктивной болезни легких.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Дизайн исследования – кандидатное исследование по принципу случай–контроль. Использовали образцы ДНК неродственных индивидов, татар по этнической принадлежности, проживающих на территории Республики Башкортостан. Группа больных (случай) (N = 425), из них 369 мужчин (86.82%) и 56 женщин (13.18%) в возрасте 63.38 ± 11.81 лет. Диагноз ХОБЛ устанавливали по Международной классификации болезней 10-го пересмотра и с учетом рекомендаций рабочей группы по “Глобальной стратегии диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких” (пересмотр 2017 г.) [1, 14]. Обследованные больные не подвергались ранее действию комплекса вредных производственных факторов. Исключали кандидатов с симптомами аллергических заболеваний, бронхиальной астмой, онкологическими заболеваниями и специфическими инфекционными заболеваниями органов дыхания (туберкулез). Среди больных ХОБЛ курильщиков и бывших курильщиков – 331 человек (77.88%), некурящих 94 (22.12%). Подсчет индекса курения в условных единицах (“число пачек в год”, “пачки/лет”, pack/years, PY) проводили по общепринятой формуле [1]. Индекс курения у курильщиков и бывших курильщиков составил 44.58 ± 25.92 пачек/лет. У всех больных исследовали функцию внешнего дыхания методом спирометрии, оценивали жизненную емкость легких (ЖЕЛ), форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), соотношение объема форсированного выдоха в 1 с и жизненной емкости легких (ОФВ1/ЖЕЛ). В группе больных показатели (в % от нормы) составляли: ОФВ1 = 38.85 ± 16.62, ФЖЕЛ = 46.06 ± 16.32, ЖЕЛ = 49.02 ± 15.54, ОФВ1/ФЖЕЛ = 54.21 ± 11.40.
Группа контроля (N = 457) включала практически здоровых индивидов, без патологии дыхательной системы в анамнезе и без профессионального контакта с вредными химическими веществами, подобранных по возрасту (58.44 ± 14.79), полу (406 мужчин, 88.84%, и 51 женщина, 11.16%), статусу курения (курильщики и бывшие курильщики – 322 (70.46%) и некурящие – 135 (29.54%)), индекс курения у курильщиков составлял 37.71 ± ± 14.12 пачек/лет. В группе контроля показатели функции внешнего дыхания (в % от нормы) составили: ОФВ1 = 102.7 ± 52.1, ФЖЕЛ = 107.1 ± ± 32.05, ЖЕЛ = 105.3 ± 42.87, ОФВ1/ФЖЕЛ = = 87.94 ± 10.69.
Исследование одобрено комитетом по этике ИБГ УНЦ РАН. От всех участников исследования получено информированное добровольное согласие на использование биологического материала в планируемых исследованиях.
Генотипирование. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с использованием фенольно-хлороформной очистки. Полиморфные варианты генов CCL11 (c.-426C>T, rs16969415), SAA1 (c.209C>T, rs1136743), CX3CR1 (c.839G>A, rs3732378), PECAM1 (c.373G>C, rs281865545), ICAM1 (c.1405A>G, rs5498), CCR5 (del32), CCL5 (c.-471G>A, rs2107538), CXCL12 (c.*519G>A, rs1801157), CCL2 (g.2493A>G, rs1024611), CCL17 (c.-59-372T>C, rs223828) [15] анализировали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени коммерческими наборами с флуоресцентной детекцией (FLASH/RTAS) (http://testgen.ru, Тест-Ген, Россия) на приборе BioRad CFX96TM (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Флуоресценцию “по конечной точке” и дискриминацию генотипов определяли по протоколу BioRad CFX96TM, используя программу CFX ManagerTM Software.
Статистическую обработку результатов проводили, используя пакеты прикладных программ Statistica v. 6.0 (StatSoft Inc., USA) и PLINK v. 1.07 [16]. Рассчитывали частоты аллелей и генотипов, соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга (χ2 и PX-B-значение для теста); оценивали статистическую значимость различий между группами по распределению частот аллелей и генотипов (тест χ2 на гомогенность выборок и P-значение для теста); при попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали двусторонний тест Фишера. Логистическую регрессию использовали для выявления ассоциации полиморфных вариантов изученных генов с развитием ХОБЛ; экспоненту отдельного коэффициента регрессии (beta) интерпретировали как отношение шансов (OR) с расчетом 95%-ного доверительного интервала. Для минимизации статистической ошибки первого типа использовали процедуру False discovery rate (FDR) (Benjamini Hochberg), используя онлайн калькулятор http:// www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR, и получали новое значение РFDR-cor. Вклад аллельных вариантов изучаемых генов-кандидатов в вариабельность количественных признаков, характеризующих тяжесть течения заболевания (показателей функции внешнего дыхания – ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ОФВ1), определяли с помощью критерия Крускела–Уоллиса (в случае трех групп) или Манна–Уитни (в случае двух групп), расчеты поводили по программе Statistica v. 6.0 program (StatSoft Inc., USA) [17].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Прежде чем приступить к анализу ассоциации аллельных вариантов генов-кандидатов с развитием ХОБЛ, была проведена проверка соответствия распределения частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга. Для группы контроля были получены следующие результаты: CCL11 (rs16969415C>T) (PX-B = 0.99), SAA1 (rs1136743C>T) (PX-B = 0.52), CX3CR1 (rs3732378A>G) (PX-B = 0.11), PECAM1 (rs281865545G>C) (PX-B = 0.13), ICAM1 (rs5498A>G) (PX-B = 0.11), CCR5 (del32) (PX-B = = 0.99), CCL5 (rs2107538G>A) (PX-B = 0.33), CXCL12 (rs1801157A>G) (PX-B = 0.61), CCL2 (rs1024611A>G) (PX-B = 0.074), CCL17 (rs223828T>C) (PX-B = 0.22).
Анализ ассоциации аллельных вариантов генов-кандидатов с развитием ХОБЛ
Нами изучена ассоциация генотипов и аллелей генов CCL11 (rs16969415C>T), SAA1 (rs1136743C>T), CX3CR1 (rs3732378A>G), PECAM1 (rs281865545G>C), ICAM1 (rs5498A>G), CCR5 (del32), CCL5 (rs2107538G>A), CXCL12 (rs1801157A>G), CCL2 (rs1024611A>G), CCL17 (rs223828T>C) с развитием ХОБЛ (табл. 1).
Таблица 1.
Ген, полиморфный вариант |
Генотипы, аллели |
ХОБЛ абс. (%) (N = 425) |
Контроль абс. (%) (N = 457) |
P | Pcor-FDR | OR (95% CI) |
---|---|---|---|---|---|---|
CCL11 c.-426C>T rs16969415 |
CC CT TT |
379 (89.18) 43 (10.12) 3 (0.71) |
406 (88.84) 49 (10.72) 2 (0.44) |
0.959 0.855 0.935 |
– – – |
1.03 (0.67–1.58) 0.93 (0.61–1.44) 1.61 (0.27–1.71) |
С T |
801 (94.24) 49 (5.76) |
861 (94.20) 53 (5.80) |
0.945 | – | 1.0 (0.67–1.50) 0.99 (0.66–1.48) |
|
SAA1 c.209C>T p.Ala70Val rs1136743 |
TT TC CC |
57 (13.41) 287 (67.53) 81 (19.06) |
159 (34.79) 225 (49.23) 73 (15.97) |
0.00001 0.00001 0.45 |
0.00005 0.00005 – |
0.31 (0.22–0.43) 2.15 (1.54–2.84) 1.16 (0.81–1.65) |
T C |
401 (47.18) 449 (52.82) | 543 (59.41) 371 (40.59) |
0.0001 | 0.0003 | 0.63 (0.52–0.76) 1.58 (1.31–1.91) |
|
CX3CR1 c.839G>A p.Thr280Met rs3732378 |
GG GA AA |
266 (62.59) 141 (33.18) 18 (4.24) |
269 (58.86) 172 (37.64) 16 (3.50) |
0.288 0.189 0.696 |
– – – |
1.16 (0.89–1.53) 0.82 (0.62–1.08) 1.21 (0.61–2.42) |
G A |
673 (79.18) 177 (20.82) |
710 (77.68) 204 (22.32) |
0.481 | – | 1.09 (0.87–1.37) 0.91 (0.72–1.14) |
|
PECAM1 c.373G>C p.Val125Leu rs281865545 |
CC CG GG |
145 (34.12) 223 (52.47) 57 (13.41) |
161 (35.23) 205 (44.86) 91 (19.91) |
0.783 0.028 0.013 |
– 0.043 0.022 |
0.95 (0.72–1.26) 1.36 (1.04–1.77) 0.62 (0.43–0.89) |
C G |
513 (60.35) 337 (39.65) |
527 (57.66) 387 (42.34) |
0.271 | – | 1.12 (0.92–1.35) 0.89 (0.73–1.08) |
|
ICAM1 c.1405A>G p.Lys469Glu rs5498 |
AA AG GG |
117 (27.53) 216 (50.82) 92 (21.65) |
201 (43.98) 191 (41.79) 65 (14.22) |
0.00001 0.009 0.005 |
0.00005 0.021 0.014 |
0.48 (0.36–0.64) 1.44 (1.10–1.88) 1.66 (1.17–2.36) |
A G |
450 (52.94) 400 (47.06) |
593 (64.88) 321 (35.12) |
0.0001 | 0.0003 | 0.60 (0.50–0.73) 1.64 (1.35–1.98) |
|
CCR5 del32 |
NN ND DD |
332 (78.12) 89 (20.94) 4 (0.94) |
380 (83.15) 73 (15.97) 4 (0.88) |
0.071 0.069 0.801 |
– – – |
0.72 (0.51–1.01) 1.39 (0.98–1.96) 1.07 (0.26–4.32) |
N D |
753 (88.59) 97 (11.41) |
833 (91.14) 81 (8.86) |
0.09 | – | 0.75 (0.55–1.03) 1.32 (0.97–1.8) |
|
CCL5 c.-471G>A rs2107538G>A |
GG GA AA |
259 (60.94) 147 (34.59) 19 (4.47) |
290 (63.46) 153 (33.48) 14 (3.06) |
0.483 0.782 0.084 |
– – – |
0.89 (0.68–1.17) 1.05 (0.79–1.38) 1.96 (0.97–3.97) |
G A |
665 (78.24) 185 (21.76) |
733 (80.20) 181 (19.80) |
0.339 | – | 0.88 (0.71–1.11) 1.12 (0.89–1.41) |
|
CXCL12 c.*519G>A rs1801157A>G |
GG GA AA |
220 (51.76) 170 (40.00) 35 (8.24) |
243 (53.17) 177 (38.73) 37 (8.10) |
0.726 0.752 0.962 |
– – – |
3.23 (2.54–4.11) 1.05 (0.80–1.38) 1.01 (0.62–1.65) |
G A |
610 (71.76) 240 (28.24) |
663 (72.54) 251 (27.46) |
0.757 | – | 0.96 (0.78–1.18) 1.03 (0.84–1.27) |
|
CCL2 g.2493A>G rs1024611A>G |
AA AG GG |
204 (48.00) 178 (41.88) 43 (10.12) |
193 (42.23) 191 (41.79) 73 (15.97) |
0.313 0.967 0.013 |
– – 0.022 |
0.86 (0.67–1.12) 1.00 (0.77–1.31) 0.52 (0.39–0.88) |
A G |
586 (68.94) 264 (31.06) |
577 (63.13) 337 (36.87) |
0.012 | 0.022 | 1.30 (1.06–1.58) 0.77 (0.63–0.94) |
|
CCL17 c.-59-372T>C rs223828T>C |
CC CT TT |
320 (75.29) 94 (22.12) 11 (2.59) |
339 (74.18) 111 (24.29) 7 (1.53) |
0.762 0.495 0.384 |
– – – |
1.06 (0.78–1.43) 0.88 (0.64–1.21) 1.71 (0.65–4.44) |
C T |
734 (86.35) 116 (13.65) |
789 (86.32) 125 (13.68) |
0.959 | – | 0.99 (0.76–1.31) 0.99 (0.76–1.30) |
Между группами больных и здоровых индивидов выявлены статистически значимые различия в распределении частот генотипов генов SAA1 (rs1136743C>T) (χ2 = 50.89, P = 0.00001), PECAM1 (rs281865545G>C) (χ2 = 8.254, P = 0.016), ICAM1 (rs5498A>G) (χ2 = 27.242, P = 0.00001) и CCL2 (rs1024611A>G) (χ2 = 7.37, P = 0.025).
Ассоциация с развитием ХОБЛ была установлена для аллеля C (P = 0.0001, Pcor-FDR = 0.0003, OR = 1.58 95% CI 1.31–1.91) генотипа TC (P = = 0.00001, Pcor-FDR = 0.00005, OR = 2.15 95% CI 1.54–2.84) гена SAA1 (rs1136743C>T).
Частота генотипа CG гена PECAM1 (rs281865545G>C) была значимо выше в группе больных ХОБЛ (52.47% против 44.86% в контроле, P = 0.028, Pcor-FDR = 0.043, OR = 1.36 95% CI 1.04–1.77).
Аллель G и генотип GG гена ICAM1 (rs5498A>G) ассоциированы с развитием ХОБЛ (P = 0.0001, Pcor-FDR = 0.0003, OR = 1.64 95% CI 1.35–1.98 и P = 0.005, Pcor-FDR = 0.014, OR = 1.66 95% CI 1.17–2.36).
Риск развития ХОБЛ связан с аллелем А гена CCL2 (rs1024611A>G) (P = 0.012, Pcor-FDR = 0.022, OR = 1.30 95% CI 1.06–1.58).
Сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей между группами больных ХОБЛ и контроля по полиморфным вариантам генов CCL11 (rs16969415C>T), CX3CR1 (rs3732378A>G), CCR5 (del32), CCL5 (rs2107538G>A), CXCL12 (rs1801157A>G), CCL17 (rs223828T>C) статистически значимых различий не дал (табл. 1).
Анализ взаимодействий средовых и генетических факторов при формировании ХОБЛ
Анализ взаимодействий средовых и генетических факторов проводился путем сопоставления величин отношения шансов, рассчитанных для аллельных вариантов генов-кандидатов в группах, сформированных по критерию наличия или отсутствия влияния фактора среды (статус курения). В табл. 2 приведены статистически значимые результаты анализа ассоциации изученных генов-кандидатов с развитием ХОБЛ в группах, дифференцированных по статусу курения.
Таблица 2.
Ген, полиморфный вариант |
Генотипы, аллели |
ХОБЛ абс. (%) |
Контроль абс. (%) |
P | Pcor-FDR | OR (95% CI) |
---|---|---|---|---|---|---|
Курильщики | ||||||
(N = 331) | (N = 322) | |||||
PECAM1 c.373G>C p.Val125Leu rs281865545 |
CC CG GG |
112 (33.84) 172 (51.96) 47 (14.20) |
117 (36.33) 139 (43.16) 66 (20.51) |
0.557 0.03 0.043 |
– 0.037 0.046 |
0.89 (0.64–1.24) 1.42 (1.01–2.00) 0.64 (0.42–0.60) |
C G |
396 (59.82) 266 (40.18) |
373 (57.92) 271 (42.08) |
0.411 | – | 1.08 (0.86–1.34) 0.92 (0.74–1.15) |
|
ICAM1 c.1405A>G rs5498 | AA AG GG |
100 (30.21) 164 (49.55) 67 (20.24) |
143 (44.41) 138 (42.86) 41 (12.73) |
0.0007 0.102 0.013 |
0.0015 – 0.022 |
0.54 (0.39–0.74) 1.31 (0.96–1.78) 1.75 (1.09–2.81) |
A G |
364 (54.98) 298 (45.02) |
424 (65.84) 220 (34.16) |
0.0001 | 0.0003 | 0.63 (0.51–0.79) 1.58 (1.26–1.97) |
|
SAA1 c.209C>T p.Ala70Val rs1136743 |
TT TC CC |
47 (14.20) 229 (69.18) 55 (16.62) |
117 (36.34) 151 (46.89) 54 (16.77) |
0.0001 0.0001 0.625 |
0.0003 0.0003 – |
0.28 (0.19–0.42) 2.55 (1.80–3.60) 0.88 (0.58–1.33) |
T C |
323 (48.79) 339 (51.21) |
385 (59.78) 259 (40.22) |
0.00001 | 0.00007 | 0.64 (0.51–0.79) 1.56 (1.25–1.94) |
|
Некурящие | ||||||
(N = 94) | (N = 135) | |||||
SAA1 c.209C>T p.Ala70Val rs1136743 |
TT TC CC |
10 (10.64) 58 (61.70) 26 (27.66) |
42 (31.11) 74 (54.81) 19 (14.07) |
0.0001 0.367 0.017 |
0.0003 – 0.026 |
0.26 (0.12–0.55) 1.32 (0.77–2.27) 2.33 (1.20–4.53) |
T C |
78 (41.49) 110 (58.51) |
158 (58.52) 112 (41.48) |
0.00001 | 0.00007 | 0.50 (0.34–0.73) 1.99 (1.36–2.90) |
|
CCL2 g.2493A>G rs1024611 | AA AG GG |
53 (56.38) 36 (38.30) 5 (5.32) |
56 (41.48) 57 (42.22) 22 (16.30) |
0.037 0.647 0.02 |
0.042 – 0.027 |
1.82 (1.07–3.10) 0.84 (0.49–1.45) 0.28 (0.10–0.70) |
A G |
142 (75.53) 46 (24.47) |
169 (62.59) 101 (37.41) |
0.005 | 0.009 | 1.84 (1.22–2.79) 0.54 (0.36–0.82) |
Маркером риска развития ХОБЛ в группе курильщиков является генотип CG гена PECAM1 (rs281865545G>C) (P = 0.03, Pcor-FDR = 0.037, OR = = 1.42 95% CI 1.01–2.00). Частота аллеля G гена ICAM1 (rs5498A>G) достигала 45.02% в группе курильщиков, больных ХОБЛ, тогда как у здоровых курильщиков его частота составила 34.16% (P = = 0.0001, Pcor-FDR = 0.0002, OR = 1.58 95% CI 1.26–1.97). Риск развития ХОБЛ в группе курильщиков был связан с генотипом GG гена ICAM1 (rs5498A>G) (P = 0.013, Pcor-FDR = 0.022, OR = 1.75 95% CI 1.09–2.81). Частота аллеля C гена SAA1 (rs1136743C>T) в группе курильщиков, больных ХОБЛ, составила 51.21% против 40.22% в контрольной группе (P = = 0.00001, Pcor-FDR = 0.00007, OR = 1.56 95% CI 1.25–1.94). Риск развития заболевания у курильщиков связан с генотипом TC (P = 0.0001, Pcor-FDR = 0.0003, OR = 2.55 95% CI 1.80–3.60).
В группе некурящих индивидов риск развития заболевания связан с генотипом CC гена SAA1 (rs1136743C>T) (P = 0.017, Pcor-FDR = 0.026, OR = = 2.33 95% CI 1.20–4.53). Значимые ассоциации с развитием ХОБЛ только среди некурящих индивидов были получены для аллеля A (P = 0.005, Pcor-FDR = 0.009, OR = 1.84 95% CI 1.22–2.79) и генотипа AA (P = 0.037, Pcor-FDR = 0.042, OR = 1.82 95% CI 1.07–3.10) гена CCL2 (rs1024611A>G).
Анализ вклада аллельных вариантов генов-кандидатов в вариабельность количественных показателей функции внешнего дыхания
Проведен анализ количественных показателей функции внешнего дыхания: жизненной емкости легких (ЖЕЛ), форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ) и объема форсированного выдоха в 1 с (ОФВ1), отражающих прогрессирование заболевания, в зависимости от аллельных вариантов изученных генов-кандидатов. Генотип GG гена PECAM1 (rs281865545G>C) и генотип AA гена CX3CR1 (rs3732378A>G) ассоциированы с более высокими показателями ЖЕЛ (P = 0.014 и P = 0.04) (см. табл. 3). У индивидов с генотипом GG гена ICAM1 (rs5498A>G) было отмечено снижение показателей ОФВ1 и ФЖЕЛ (P = 0.025 и P = 0.029). Тогда как для индивидов с гетерозиготным генотипом гена ICAM1 (rs5498A>G) были отмечены более высокие показатели ОФВ1 и ФЖЕЛ (P = 0.0013 и P = 0.0012).
Таблица 3.
Ген, полиморфный вариант |
Генотип | N | M ± S.E. | P |
---|---|---|---|---|
ЖЕЛ (жизненная емкость легких) (N = 425) | ||||
PECAM1
c.373G>C p.Val125Leu rs281865545 |
CC CG GG |
136 238 51 |
51.79 (2.09) 50.36 (1.41) 59.17 (3.01) |
0.041 |
(CC+CG) GG |
374 51 |
50.88 (1.17) 59.17 (3.01) |
0.014 | |
CX3CR1 c.839G>A p.Thr280Met rs3732378 |
(GG+GA) AA |
412 13 |
51.74 (1.03) 62.69 (5.13) |
0.04 |
ОФВ1 (объем форсированного выдоха в 1 с) (N = 425) | ||||
ICAM1 c.1405A>G rs5498 | AA AG GG |
102 221 102 |
37.5 (2.06) 43.47 (1.5) 36.1 (1.91) |
0.005 |
(AA+AG) GG |
23 102 |
41.55 (1.23) 36.1 (1.91) |
0.025 | |
(AA+GG) AG |
204 221 |
36.8 (1.4) 43.47 (1.5) |
0.0013 | |
ФЖЕЛ (форсированная жизненная емкость легких) (N = 425) | ||||
ICAM1 c.1405A>G rs5498 | AA AG GG |
110 221 94 |
47.25 (2.53) 54.66 (1.77) 45.42 (2.45) |
0.0045 |
(AA+AG) GG |
331 94 |
52.18 (1.47) 45.42 (2.45) |
0.029 | |
(AA+GG) AG |
204 221 |
46.42 (1.77) 54.66 (1.77) |
0.0012 |
ОБСУЖДЕНИЕ
Проведен анализ ассоциации аллельных вариантов генов хемокинов и хемокиновых рецепторов: CCL11 (rs16969415C>T), CX3CR1 (rs3732378A>G), CCR5 (del32), CCL5 (rs2107538G>A), CXCL12 (rs1801157A>G), CCL2 (rs1024611A>G), CCL17 (rs223828T>C); молекул адгезии: PECAM1 (rs281865545G>C), ICAM1 (rs5498A>G) и сывороточного амилоидного белка SAA1 (rs1136743C>T) с развитием ХОБЛ в популяции татар.
Наиболее значимые ассоциации с развитием заболевания в целом и в группах, дифференцированных по статусу курения, были установлены для аллельных вариантов гена SAA1 (rs1136743), кодирующего сывороточный амилоидный A1-белок [5]. У человека имеется четыре гена SAA (SAA1, SAA2, SAA3 и SAA4), локализованных на хромосоме 11p15.1. Среди них SAA1 и SAA2 кодируют белок острой фазы воспаления – сывороточный амилоидный A-белок. SAA4 – конститутивно экспрессирующийся родственный белок SAA, который не реагирует на воспалительные стимулы, а SSA3 является псевдогеном. Ген SAA1 содержит четыре экзона, кодирующая последовательность охватывает второй, третий и часть четвертого экзона. Полиморфный вариант rs1136743, 209C>T гена SAA1 находится в 3-м экзоне, приводит к замене аланина на валин в молекуле белка (p.Ala70Val) [5, 15]. Нами установлено, что аллель С и генотип TC полиморфного варианта rs1136743C>T гена SAA1 являются маркерами риска развития ХОБЛ, данная ассоциация сохраняла свою значимость после коррекции на множественность сравнений и была подтверждена в группах, дифференцированных по статусу курения. Ранее ассоциативных исследований полиморфных локусов гена SAA1 с ХОБЛ не проводилось, но в работе [18] было установлено, что продукция С-реактивного белка и SAA увеличена в паренхиме легких и бронхах у больных ХОБЛ [18]. В исследовании [19] было показано, что SAA активно продуцируется в эндотелиальных клетках и макрофагах нормальной легочной ткани. Доказано, что сосудистая система легких является основным местом продукции белков SAA и C-реактивного белка и источником системного воспаления при ХОБЛ [18].
В результате проведенного исследования нами установлена ассоциация аллельных вариантов генов молекул адгезии ICAM1 и PECAM1 с развитием ХОБЛ и показателями, характеризующими функцию внешнего дыхания и прогрессирование заболевания. Риск развития ХОБЛ был связан с аллелем G и генотипом GG гена ICAM1 (rs5498A>G). Кроме того, нами была показана зависимость показателей функции внешнего дыхания от генотипов данного гена. Так, у гомозигот GG гена ICAM1 (rs5498A>G) установлены более низкие показатели объема форсированного выдоха в 1 с (ОФВ1) и форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ), что согласуется с результатами анализа ассоциации с развитием заболевания в целом. Ген ICAM1 (rs5498A>G) локализован на участке 19p13.2 [15], кодирует мембранный белок, содержащий пять Ig-подобных внеклеточных доменов. ICAM1 индуцируется медиаторами воспаления, такими как IL-1, TNFα и IFNγ [9]. Полиморфный вариант rs5498A>G в экзоне 6 приводит к замене в аминокислотной последовательности белкового продукта (p.Lys469Glu) [7]. Ассоциация с развитием ХОБЛ была выявлена для полиморфного варианта rs281865545 (c.373G>C) гена PECAM1. Гетерозиготный генотип был связан с развитием заболевания в общей группе и у курильщиков. У носителей генотипа GG также отмечены более высокие показатели жизненной емкости легких (ЖЕЛ) и снижен риск развития ХОБЛ. Ген PECAM1, локализованный на хромосоме 17q23.3, кодирует молекулу межклеточной адгезии PECAM1 [15]. С участием PECAM1 осуществляется миграция лейкоцитов через межклеточное пространство эндотелиальных клеток сосудов [10]. Однонуклеотидная замена rs281865545 (c.373G>C) в 3-м экзоне гена PECAM1 приводит к изменению в полипептидной последовательности валина на лейцин в 125-м кодоне (p.Val125Leu), что отражается на функции PECAM1 [15]. Вклад аллельных вариантов генов молекул адгезии в развитие ХОБЛ ранее не изучался. Переход местного воспаления в легочной ткани при ХОБЛ в хроническое системное воспаление может быть связан с высокой проницаемостью сосудов легких у больных, что приводит к выбросу провоспалительных факторов в системный кровоток [2, 11]. Все полученные ранее данные и результаты нашего исследования подтверждают, что аллельные варианты генов молекул адгезии ICAM1 и PECAM1 могут быть важным фактором риска возникновения и прогрессирования заболеваний, связанных хроническим системным воспалением, в частности ХОБЛ.
Макрофаги являются одним из основных факторов развития воспаления при ХОБЛ вследствие способности продуцировать провоспалительные цитокины и хемокины [11–13]. Макрофаги секретируют CCL2, что, в свою очередь, приводит к рекрутингу моноцитов в легкие, которые впоследствии дифференцируются в макрофаги. Среди провоспалительных СС-хемокинов ключевая роль в инициации и развитии воспалительных процессов, обусловленных преимущественной активностью моноцитов, принадлежит хемокинам CCL2 и СCL5 [13]. В нашем исследовании установлено, что аллель A гена CCL2 (rs1024611A>G) статистически значимо ассоциирован с развитием ХОБЛ. Более детальный анализ подтвердил ассоциацию генотипа AA с развитием ХОБЛ только в группе некурящих индивидов. Ген CCL2 локализован на 17q11.2-q12 хромосоме [15]. CCL2 – хемотаксический фактор моноцитов 1 (monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1)), продуцируется моноцитами, макрофагами и дендритными клетками после их активации. CCL2 играет ключевую роль в привлечении макрофагов, базофилов, T-лимфоцитов к очагу воспаления, участвует в активации матриксных металлопротеаз, играющих ключевую роль в процессах ремоделирования легочной ткани при ХОБЛ [13, 20]. Полиморфный вариант rs1024611A>G (–2518A>G) находится в регуляторном участке гена CCL2 [20]. Показано, что аллель G связан с увеличением уровня CCL2 в сыворотке и плазме [20]. Ассоциация генотипа GG гена CCL2 (rs1024611A>G) с развитием ХОБЛ ранее была показана в популяции Китая [21]. С другой стороны, в исследованиях [22] и [23] ассоциации аллельных вариантов гена CCL2 (rs1024611A>G) с развитием ХОБЛ в популяциях Тайваня и Франции выявлено не было.
Была установлена зависимость количественного показателя, характеризующего жизненную емкость легких (ЖЕЛ) от аллельных вариантов гена CX3CR1 (rs3732378G>A). Индивиды с генотипом AA имели значимо более высокие показатели ЖЕЛ. CX3CR1 – хемокиновый рецептор, представленный на моноцитах, активированных T-клетках, натуральных киллерах, дендритных клетках [13]. Кодируется геном CX3CR1 (3p22.2), является специфическим рецептором для хемокина CX3CL1 (fractalkine), который действует как хемоаттрактант, приводя к адгезии, миграции и пролиферации активированных воспалительных клеток [15]. Однонуклеотидная замена rs3732378G>A в последовательности гена CX3CR1 приводит к аминокислотной замене p.Thr280Met [15]. В работе [24] было продемонстрировано, что аллель A, или метионин в аминокислотной последовательности рецептора, ассоциирует с низким уровнем клеточной адгезии и хемотаксисом лейкоцитов. Моноциты/макрофаги, несущие рецептор CX3CR1, активно мигрируют через эндотелий сосудов легких, накапливаются в стенках сосудов легких и паренхиме [13, 24]. Инфильтрация иммунных клеток приводит к высвобождению медиаторов воспаления и ремоделированию легочной ткани, стимулируя пролиферацию воспалительных клеток [2].
Полученные результаты представляют интерес для понимания молекулярных механизмов развития ХОБЛ. Установлено, что аллельные варианты гена CCL2, молекул адгезии (PECAM1, ICAM1) и сывороточного амилоидного белка (SAA1) являются маркерами риска развития ХОБЛ в популяции татар. Установлено, что генотипы генов PECAM1, ICAM1 и CX3CR1 ассоциированы с показателями функции внешнего дыхания, отражающими прогрессирование ХОБЛ.
Исследование частично поддержано Российским фондом фундаментальных исследований (№ 18-015-00050); биологический материал (ДНК) для исследования взят из коллекции “Коллекция биологических материалов человека ИБГ УНЦ РАН” ИБГ УНЦ РАН, поддержанной программой биоресурсных коллекций ФАНО России (соглашение № 007-030164/2). Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП “Биомика” и УНУ “КОДИНК” (ИБГ УФИЦ РАН).
Список литературы
From the Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of COPD, Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) 2017. Available from: http://goldcopd.org.
Barnes P.J. Cellular and molecular mechanisms of asthma and COPD // Clin. Sci. (Lond.). 2017. V. 131. № 13. P. 1541–1558. doi 10.1042/CS20160487
Busch R., Cho M.H., Silverman E.K. Progress in disease progression genetics: dissecting the genetic origins of lung function decline in COPD // Thorax. 2017. V. 72. № 5. P. 389–390. doi 10.1136/thoraxjnl-2016-209666
Calero C., Arellano E., Lopez-Villalobos J.L. et al. Differential expression of C-reactive protein and serum amyloid A in different cell types in the lung tissue of chronic obstructive pulmonary disease patients // BMC Pulm. Med. 2014. V. 14. P.95. doi 10.1186/1471-2466-14-95
Sun L., Ye R.D. Serum amyloid A1: Structure, function and gene polymorphism // Gene. 2016. V. 583. № 1. P. 48–57. doi 10.1016/j.gene.2016.02.044
De Buck M., Gouwy M., Wang J.M. et al. Structure and expression of different serum amyloid A (SAA) variants and their concentration-dependent functions during host insults // Curr. Med. Chem. 2016. V. 23. № 17. P. 1725–1755. doi 10.2174/0929867323666160418114600
Buraczynska M., Zaluska W., Baranowicz-Gaszczyk I. et al. The intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) gene polymorphism K469E in end-stage renal disease patients with cardiovascular disease // Hum. Immunol. 2012. V. 73. № 8. P. 824–828. doi 10.1016/j.humimm.2012.05.007
Zhou X., Zhu L., Lizarraga R., Chen Y. Human airway epithelial cells direct significant rhinovirus replication in monocytic cells by enhancing ICAM1 expression // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2017. V. 57. № 2. P. 216–225. doi 10.1165/rcmb.2016-0271OC
Holder A.L., Wolf S., Walshe C. et al. Expression of endothelial intercellular adhesion molecule-1 is determined by genotype: effects on efficiency of leukocyte adhesion to human endothelial cells // Hum. Immunol. 2008. V. 69. № 2. P. 71–78. doi 10.1016/j.humimm.2007.12.004
Privratsky J.R., Newman P.J. Pecam-1: regulator of endothelial junctional integrity // Cell Tissue Res. 2014. V. 355. P. 607–619. doi 10.1007/s00441-013-1779-3
Hackett T.L., Holloway R., Holgate S.T., Warner J.A. Dynamics of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine release during acute inflammation in chronic obstructive pulmonary disease: an ex vivo study // Respir. Res. 2008. V. 29. № 9. P. 47. doi 10.1186/1465-9921-9-47
Sokol C.L., Luster A.D. The chemokine system in innate immunity // Cold Spring Harb. Perspect Biol. 2015. V. 7. № 5. pii: a016303. doi 10.1101/cshperspect.a016303
Ярилин А.А. Иммунология: Учебник. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 752 с.
International statistical classification of diseases and related health problems, tenth revision (ICD-10 http://www.who.int/classifications/icd/en/).
Open database of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and multiple small-scale variations that include insertions/deletions, microsatellites, and non-polymorphic variants. Bethesda (MD): The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information (US). Available from: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/.
Purcell S., Neale B., Todd-Brown K. et al. PLINK: a toolset for whole-genome association and population-based linkage analysis // Am. J. Hum. Genet. 2007. V. 81. P. 559–575. doi 10.1086/519795
Statistica v. 6.0 program (StatSoft Inc., USA) (http://www.statistica.com).
López-Campos J.L., Calero C., Rojano B. et al. C-reactive protein and serum amyloid a overexpression in lung tissues of chronic obstructive pulmonary disease patients: a case-control study // Int. J. Med. Sci. 2013. V. 10. № 8. P. 938–947. doi 10.7150/ijms.6152
Urieli-Shoval S., Cohen P., Eisenberg S., Matzner Y. Widespread expression of serum amyloid A in histologically normal human tissues. Predominant localization to the epithelium // J. Histochem. Cytochem.: Official J. Histochem. Soc. 1998. V. 46. P. 1377–1384.
Pham M.H., Bonello G.B., Castiblanco J. et al. The rs1024611 regulatory region polymorphism is associated with CCL2 allelic expression imbalance // PLoS One. 2012. V. 7. P. e49498. doi 10.1371/journal.pone.0049498
Bai J., Song H., Cai C. et al. The association of monocyte chemotactic protein-1 and CC chemokine receptor 2 gene variants with chronic obstructive pulmonary disease // DNA Cell Biol. 2012. V. 31. № 6. P. 1058–1063. doi 10.1089/dna.2011.1520
Liu S.F., Wang C.C., Fang W.F. MCP1-2518 polymorphism and chronic obstructive pulmonary disease in Taiwanese men // Exptl Lung. Res. 2010. V. 36. № 5. P. 277–283. doi 10.3109/01902140903575989
Chaouat A., Savale L., Chouaid C. et al. Role for interleukin-6 in COPD-related pulmonary hypertension // Chest. 2009. V. 136. № 3. P. 678–687. doi 10.1378/ chest.08-2420
McComb J.G., Ranganathan M., Liu X.H. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema // Am. J. Pathol. 2008. V. 173. № 4. P. 949–961. doi 10.2353/ajpath.2008.071034
Дополнительные материалы отсутствуют.