Генетика, 2019, T. 55, № 10, стр. 1122-1136

ЧАСТОТА ХРОМОСОМНЫХ МУТАЦИЙ В ИПСК

Основной вопрос – является ли свойственная для ИПСК частота мутаций результатом внутренней генетической нестабильности репрограммированных клеток? После того, как Яманака с коллегами открыли способ репрограммирования терминально дифференцированных клеток человека в плюрипотентные стволовые клетки, стали накапливаться данные о генетических аберрациях в ИПСК [1–3]. Для оценки степени хромосомной изменчивости были предприняты широкомасштабные международные исследования по созданию каталога мутаций, обнаруживаемых в ИПСК. Международная инициатива по стволовым клеткам (International Stem Cell Initiative, ISCI) осуществила скрининг кариотипов 120 линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и 11 линий ИПСК из 38 лабораторий на ранних и поздних пассажах [4], а Taapken с соавторами провели цитогенетический анализ 40 линий ЭСК и 219 линий ИПСК из 29 лабораторий [5]. Один из первых выводов, полученных в этих масштабных работах, заключается в том, что ИПСК человека обычно эуплоидны вскоре после получения и могут сохранять нормальный кариотип в течение нескольких десятков и даже сотен пассажей. С другой стороны, заметная часть обследованных клеточных линий демонстрировала аномалии хромосомного набора – 42/125 (34%) линий ЭСК и 3/11 (27%) линий ИПСК в исследовании ISCI и 150/1163 (12.9%) клонов в исследовании Taapken с соавторами [5]. Метаанализ восьми исследований глобальной генной экспрессии суммарно 66 линий ИПСК человека выявил 13 аномальных линий (20%), 6 (9%) из которых несли по меньшей мере одну полную трисомию [6]. Менее масштабные исследования также обнаруживали аномалии кариотипа [7, 8], и в среднем по оценкам тех лет 10–25% линий ИПСК содержат крупные хромосомные аберрации.

Однако в недавних крупномасштабных проектах по созданию стандартизовано полученных и охарактеризованных панелей линий ИПСК частота аномалий заметно ниже. Так, в панели из 222 линий ИПСК ресурса iPSCORE (iPSC Collection for Omic Research) аномалии цитогенетического уровня обнаружены в двух линиях (<1%), а в 90% линий CNV либо не выявлены (101/222 линий), либо имеют размер менее 2 Mb (102/222 линий) [9]. Из 711 линий ИПСК, полученных Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative (HipSci), трисомии обнаружены в 4% линий и 41% линий содержали один или несколько CNV со средней длиной 7.15 Mb [10]. Таким образом, частота возникновения хромосомных аномалий (числовых и структурных) может быть снижена при использовании стандартизованных подходов.

РЕКУРРЕНТНЫЕ ХРОМОСОМНЫЕ АБЕРРАЦИИ

Быстрая пролиферация ИПСК и возникающий репликационный стресс, а также ослабление контрольных точек клеточного цикла и другие особенности ИПСК, рассмотренные в [11], создают благоприятные условия для появления анеуплоидий. Хромосомные аберрации в ИПСК возникают, по-видимому, случайным образом, что приводит к появлению кариотипически гетерогенных культур. Так, специальный анализ обнаружил хромосомный мозаицизм в 18–35% клеток линий ПСКч с нормальным кариотипом [12]. Наличие фенотипически различающихся клеток создает основу для клеточной селекции in vitro, в результате чего клетки с большей скоростью роста начинают преобладать над нормальными, т.е. происходит так называемая “культурная адаптация” [13].

Результаты большинства работ, в том числе широкомасштабных исследований, обнаруживают существование неслучайных изменений кариотипа ИПСК: около 60% аномалий повторяются в различных по происхождению линиях (рекуррентные аномалии). Преобладающими по частоте аномалиями в ИПСК человека являются трисомии хромосомы 20 (или изохромосомы 20q) с амплификацией региона 20q11.21, трисомия хромосомы 12 или частичная трисомия ее длинного плеча (вследствие дупликации 12p или формирования изохромосомы 12p). Часто отмечаются случаи трисомии по хромосоме 1 или частичные дупликации длинного плеча этой хромосомы, причем частота выявления таких аберраций возрастает в последние годы. Далее по частоте встречаемости следуют трисомия хромосомы 8, делеция участка 18q, дополнительная Х-хромосома и трисомия 17. В целом, при адаптации ИПСК человека в культуре, амплификация хромосомного материала происходит заметно чаще, чем потеря, хотя субхромосомные делеции регионов хромосом 10, 18 и 22 отмечались неоднократно [4–6, 8, 10, 14, 15].

Интересно, что в большом массиве данных о кариотипах ИПСК практически не выявляются рекуррентные хромосомные транслокации в отличие от картины, наблюдаемой во многих опухолях, хотя встречаются единичные сообщения о пролиферативном преимуществе клеток с перестройками [16].

Аномалии хромосомного уровня изменяют дозу сотен и тысяч генов, что затрудняет установление драйверных генов, лежащих в основе преимущественного роста клеток с аберрациями. Регион 20q11.21, чаще всего дуплицирующийся в ПСКч, содержит по меньшей мере 25 генов, кодирующих белки и микроРНК [17], четыре из которых (ID1, HM13, TPX2 и особенно BCL2L) повышают жизнеспособность ЭСКч и их онкогенный потенциал [18, 19]. Кроме этого, в данном регионе находится miR-1825, которая имеет около 400 предсказанных мишеней (TargetScan) и может действовать как супрессор генов – ингибиторов роста. Частая трисомия хромосомы 12 обусловлена, вероятно, локализацией на ней гена плюрипотентности NANOG (регион 12p13), который усиливает способность к самообновлению и предотвращает дифференцировку. В этом же регионе находятся другие кандидатные гены, ассоциированные с плюрипотентным статусом – DPPA3 и GDF3, и регулятор клеточного цикла CCND2. Второй кандидатный регион этой хромосомы (12p11.2-p12) содержит онкоген KRAS, а также ген SOX5, вовлеченный в детерминирование судьбы клеток [13]. Трисомия хромосомы 17, скорее всего, связана с наличием в регионе 17q25 гена BIRC5 (Survivin) – антиапоптотического гена, важного для выживания и способности ПСКч к образованию тератом. Было показано, что ЭСК с трисомией 17 генерируют более агрессивные тератомы, чем диплоидные клоны [20], а ортологичный ген Birc5 у мыши находится в синтенной области 11qE2, часто участвующей в рекуррентных трисомиях мышиных плюрипотентных стволовых клетках (ПСК), и экспрессия Birc5 значительно повышена в аберрантных клетках [21]. Другие кандидатные гены на хромосоме 17 – EIF4A3, NOL11, UTP6 и SUZ12 в регионе 17q [10]. Мутации в гене р53, обнаруженные при экзомном секвенировании 117 линий ИПСК [22], также, по-видимому, обеспечивают защиту от апоптоза, давая селективное преимущество клеткам in vitro [23].

Вызывает настороженность тот факт, что большинство рекуррентных хромосомных аберраций, выявляемых в ПСКч, обнаруживаются также в эмбриональных карциномах. Эти злокачественные клетки демонстрируют избыток материала тех же хромосом 1, 12, 17 и X, которые накапливаются при культивировании ПСКч [24]. Другая частая аномалия – амплификация 20q11.2 – обнаруживается в карциномах желточного мешка и герминальных опухолях [25].

Тенденция к приобретению рекуррентных хромосомных аберраций, по-видимому, общая и не зависит от методов репрограммирования или клеточного происхождения линий ИПСК [5, 6, 8, 21]. Кроме того, частоты выявления таких аберраций сходны для ЭСК и ИПСК, что указывает на общность механизмов преимущественного роста в различных типах плюрипотентных стволовых клеток и подтверждает их функциональное сходство [26].

В отличие от эффекта анеуплоидий в соматических клетках, которые часто приводят к метаболическим отклонениям и нарушению пролиферации клеток, ИПСК с рекуррентными анеуплоидиями быстрее растут [13, 27, 28] и проводят относительно больше времени в S-фазе клеточного цикла [29], чем их эуплоидные аналоги. Характерной чертой ПСКч является влияние анеуплоидии на конденсацию хромосом, опосредованное репликационным стрессом [28], а неполная конденсация, в свою очередь, приводит к таким ошибкам сегрегации, как анафазные мосты и хромосомные отставания [30, 31]. Показано, что эти типы нарушения расхождения хромосом значительно чаще встречались в анеуплоидных линиях ПСКч, чем в эуплоидных. Вследствие этого можно ожидать, что клетки с аномалиями кариотипа будут более склонны к появлению новых анеуплоидий. Действительно, кариотипирование шести эуплоидных линий ПСКч выявило хромосомные аберрации в 2.9% метафаз, тогда как в трех анеуплоидных по хромосомам 12 и 17 линиях дополнительные аберрации присутствовали в 34% метафаз [28]. В других исследованиях также отмечалось, что ПСКч с трисомиями хромосом 12 и 17 часто несут дополнительные аберрации и становятся более анеуплоидными с течением времени [4, 13].

Хромосомные аберрации оказывают влияние также на способность ПСК к дифференцировке [32]. Так, ЭСК с амплификацией материала хромосомы 17 демонстрируют измененный, по сравнению с кариотипически нормальными аналогами, спектр спонтанной дифференцировки in vitro, отличаясь снижением экспрессии альфафетопротеина и пониженной способностью к формированию внезародышевой энтодермы [33]. Избыток хромосомы 12 приводит к общему уменьшению способности к дифференцировке [29] и повышенной способности к образованию опухолей [27]. В то же время встречается и обратная ситуация, когда хромосомные аномалии появляются в процессе дифференцировки. Описан интересный случай возникновения мозаичной тетраплоидии 92,XXYY/46,XY в 24–43% клеток из различных клонов в нейрональных предшественниках, дифференцированных из цитогенетически нормальных ИПСК пациента с болезнью Паркинсона после проведения CRISPR/Cas9-коррекции мутации в гене LRRK2 [34].

ПРОИСХОЖДЕНИЕ АБЕРРАЦИЙ В ИПСК

В зависимости от времени возникновения аберрации, обнаруживаемые в ИПСК, можно условно разделить на три категории:

1) аномалии соматического происхождения. Так как дифференцированные клетки – родоначальники линий ИПСК имеют собственную историю и прошли через значительное количество клеточных циклов, то их геном уже накопил некоторое число аберраций;

2) аномалии, возникающие при репрограммировании вследствие репликационного и метаболического стресса или вследствие интеграции репрограммирующих вирусных трансгенов. Информацию о частоте этого типа аберраций может дать сравнение различных методов получения ИПСК, а также сравнение ИПСК и ЭСК, которые не проходят этап репрограммирования, или линий, полученных методом переноса ядра соматической клетки (SCNT);

3) аномалии, приобретаемые в процессе длительного культивирования, при котором в клеточных популяциях могут происходить процессы клональной селекции, культурной адаптации и т.д.

Хромосомные мутации соматического происхождения

Обычно предполагается, что все здоровые клетки, полученные из одной зиготы, имеют идентичное геномное содержание, с известными исключениями в клетках иммунной системы, половой линии, печени и т.п. Однако растет число доказательств существования соматической геномной вариабельности между дифференцированными тканями и клетками в составе одной ткани. Примерно 30% фибробластов имеют соматические CNV в своих геномах, что говорит о высокой распространенности явления соматического мозаицизма [35]. Mkrtchyan с соавторами предположили, что митотические изменения в регионах CNV могут происходить во время раннего эмбрионального развития, после чего поддерживается относительно стабильное соотношение мозаичных клонов [36].

Специальный анализ показал, что хотя кариотипирование, FISH, q-ПЦР и даже цифровая ПЦР эффективны как методы мониторинга генетических аберраций, ни один из этих методов не может достоверно определить варианты, если они присутствуют менее чем в 5–10% клеток в культуре [37]. Таким образом, если варианты редки в исходной популяции клеток, они могут не выявляться при использовании обычных методов и будут зарегистрированы в ИПСК как мутации de novo. Так, с помощью цифровой ПЦР было показано, что 50% предположительно de novo CNV присутствовали с низкой частотой в родительских фибробластах и проявились в ИПСК вследствие их клонального происхождения [35]. Глубокое секвенирование позволило установить, что 90% вариантов, обнаруженных в клонах ИПСК как мутации de novo, присутствовали в родительской клеточной популяции с очень низкой частотой [38].

Редкие и/или локализованные варианты, присутствовавшие в геноме донорского эмбриона (для ЭСК) или клетках-родоначальниках ИПСК, обнаруживаются и в других исследованиях. По меньшей мере половина точковых мутаций, обнаруженных при полноэкзомном секвенировании 22 линий ИПСК человека, с низкой частотой существовала в фибробластах [39], а анализ CNV в 470 линиях ИПСК показал, что большинство вариантов уже существовало в фибробластах доноров [40]. Таким образом, постзиготический полиморфизм низкого уровня, существовавший в клетках – родоначальниках ИПСК, может стать источником выявления генетических вариантов в плюрипотентных стволовых клетках [41]. Вряд ли обнаруживаемые варианты обеспечивают селективное преимущество клеткам до репрограммирования (иначе они встречались бы с большей частотой) или существенны для процесса репрограммирования, скорее всего они являются следствием клональной селекции. Но если они дают пролиферативные и анти-апоптотические преимущества несущим их клеткам, то они могут быть отобраны в процессе репрограммирования.

Хромосомные мутации, возникшие в процессе репрограммирования

Репрограммирование соматических клеток в плюрипотентное состояние – это процесс, при котором клетки претерпевают многочисленные ускоренные клеточные деления в стрессорных условиях, подвергаясь массовым изменениям профилей генной экспрессии и структуры хроматина. Ключевым является вопрос, насколько процесс репрограммирования дестабилизирует геном клеток и способствует появлению мутаций? Разработано и применяется множество методов получения ИПСК человека с различными параметрами, включающими тип исходных клеток, тип вектора (или способ трансфекции) и набор репрограммирующих факторов. Векторы можно разделить на интегрирующиеся (ретровирусы, лентивирусы, транспозоны, бактериофаги, нуклеазы цинковых пальцев) и неинтегрирующиеся (мРНК, эписомы, протеины, аденовирусы, вирус Сендай, кольцевые мини-ДНК). Кроме четырех стандартных транскрипционных факторов – так называемого “коктейля Яманаки” (генов OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC) и альтернативной комбинации, содержащей SOX2, OCT4, LIN28 и NANOG, используются и другие транскрипционные факторы, малые молекулы, микроРНК и другие компоненты, улучшающие эффективность репрограммирования и качество ИПСК [42, 43].

Сравнение частоты и характера мутаций в ИПСК и ЭСК представляет собой удобную систему для вычленения влияния процесса репрограммирования на стабильность генома. Цитогенетический анализ не выявляет значимых различий между ними по частоте хромосомных аберраций: 27% в ИПСК и 34% в ЭСК [4]; 12.5% в ИПСК и 12.9% в ЭСК [5]. Это позволило предположить, что собственно процесс репрограммирования не вносит существенного вклада в возникновение хромосомных аберраций, тем более что не было выявлено зависимости частоты и типов аномалий кариотипа от метода репрограммирования ИПСК [5]. Сравнение частоты вариантов в генетически родственных линиях ИПСК, SCNT-СК и ЭСК с помощью полногеномного анализа обнаружило 1.8, 0.8 и 0.5 CNV на клеточную линию соответственно, при этом отличия были статистически незначимы. Тот факт, что SCNT-СК и ИПСК, полученные из одних и тех же соматических клеток, содержали сравнимые количества CNV, означает, что мутационное и селективное давление значимо не отличается при этих двух способах репрограммирования [44].

В другой работе при сравнении частоты вариантов в субклонированных фибробластах и клонах ИПСК, полученных из одного источника, оказалось, что ИПСК содержат не больше аберраций, чем субклоны фибробластов, т.е. сам по себе процесс репрограммирования не вызывает мутагенного воздействия [38]. В двух работах на ИПСК мыши и одной на ИПСК человека, полученных с помощью эписомного вектора, было показано отсутствие повышенной частоты CNV в ИПСК, однако обнаружена увеличенная частота однонуклеотидных вариантов, причем эти варианты были случайно рассеяны по геному [45–47]. Есть и другие свидетельства мутагенного эффекта процесса репрограммирования: груз CNV на ранних пассажах ИПСК человека оказался повышен по сравнению с ЭСК, причем возникновение микроструктурных перестроек явилось следствием репликационного стресса [48].

Таким образом, процесс репрограммирования не оказывает радикального влияния на частоту возникновения хромосомных аномалий, а данные об эффекте на уровне микроструктурных перестроек и однонуклеотидных замен противоречивы. Возможно, воздействие репрограммирования на генетическую целостность по-разному проявляется на разных уровнях организации генома. Кроме того, на результаты таких исследований влияет чувствительность методов анализа генома ИПСК и исходных клеток. Так, в большинстве исследований с использованием MPS не обнаруживается повышенной частоты субхромосомных и однонуклеотидных мутаций, индуцированных репрограммированием.

В ряде исследований было показано увеличение частоты генетических аберраций при репрограммировании вследствие интеграции вирусных трансгенов. На ранних пассажах в линиях ИПСК человека, репрограммированных лентивирусом, хромосомные перестройки обнаружены в 44% (7/16) линий, а в линиях, репрограммированных вирусом Сендай – только в 6% (1/16) [49]. В сравнительном исследовании геномных аберраций шести “интегративных” и шести “неинтегративных” линий ИПСК, шести линий ЭСК и двух родительских линий оказалось, что максимальные размеры CNV в геномах “интегративных” ИПСК были в 20 раз больше, чем в геномах “неинтегративных” ИПСК. Более того, медиана числа CNV в “интегративных” ИПСК (33.8) была намного больше, чем в “неинтегративных” линиях ИПСК (5.7), линиях ЭСК (3.2) или соматических клетках (6.0). По сравнению с генотипами родительских клеточных линий “интегративные” ИПСК несли больше однонуклеотидных замен, и частота мозаичных вариантов в них была выше, чем в “неинтегративных” [50]. Однако систематическая оценка широко применяемых способов трансфекции, проведенная на 470 клонах, полученных разными методами из 12 различных образцов донорских фибробластов, не продемонстрировала такой зависимости. Хотя наименее стабильными были кариотипы при ретровирусной трансфекции (13.5%), а наиболее стабильными – при использовании мРНК (2.3%), низкие частоты анеуплоидии отмечены также при лентивирусном репрограммировании (4.5%) и использовании вируса Сендай (4.6%), тогда как эписомный метод дал 11.5% анеуплоидных клонов [40]. В другой работе анализ 66 клонов ИПСК не выявил повышенной частоты анеуплоидии в “интегративных” линиях по сравнению с “неинтегративными”, тем более что многие мутации были представлены анеуплоидями по целым хромосомам, что мало вероятно при мутационных процессах, опосредованных вирусной интеграцией [6].

Интересно, что на стабильность генома ИПСК оказывает влияние тканевая принадлежность исходных клеток. Частота CNV, обнаруживаемых на первом пассаже в линиях ИПСК, полученных из разных тканей одного организма, варьировала в зависимости от типа клеток: 4.3% в нейральных ИПСК, 29% в B-клеточных ИПСК, 10% в ИПСК из фибробластов и в 1.3% нейросфер, т.е. генетически идентичные клетки разных тканей демонстрировали разную степень геномной нестабильности в ходе репрограммирования [51]. Вероятно, определенные типы клеток более восприимчивы к повреждению ДНК в процессе репрограммирования, возможно, в результате исходных различий в уровне экспрессии молекул, участвующих в поддержании целостности генома.

Важным фактором, модифицирующим стабильность генома ИПСК, является возраст донора клеток, и это необходимо иметь в виду, так как аутологичная трансплантация особенно перспективна для пожилых пациентов [52]. Например, все четыре линии ИПСК, полученные из фибробластов с нормальным кариотипом от 84-летнего донора, несли различные хромосомные аномалии [53]. Повышенная геномная нестабильность ИПСК от пожилых доноров была обнаруженаи в работе Skamagki с соавторами, и причиной ее оказалась избыточная активность опосредованного глутатионом поглощения активных форм кислорода, которая блокирует ответ на повреждение ДНК и апоптоз и позволяет выживать клеткам с геномной нестабильностью. Обнаружено, что добавление ZSCAN10 к стандартным репрограммирующим факторам восстанавливает окислительный гомеостаз и ответ на повреждение ДНК и повышает генетическую стабильность получаемых линий [54]. Более “старые” клетки и клетки, подвергающиеся воздействию факторов окружающей среды, таких как УФ излучение, еще до репрограммирования несут больше аберраций, чем, например, клетки пуповинной крови, и выбор типа исходных соматических клеток влияет на мутационный груз ИПСК [55].

Кроме того, существует межиндивидуальная вариабельность по степени генетической нестабильности получаемых ИПСК: некоторые доноры давали линии ИПСК с более высокой частотой de novo CNV, чем другие [56].

В процессе репрограммирования только незначительная часть клеток превращается в стволовые, а остальные прекращают делиться. Yu с соавторами сравнили хромосомные микроделеции и микродупликации в остановившихся и успешно репрограммированных клетках от трех доноров. Оказалось, что ранее существующая мутация увеличивает риск геномной нестабильности и снижает возможность перехода к плюрипотентному состоянию [57]. В то же время ИПСК были успешно получены из соматических клеток с моносомией Х, трисомиями хромосом 8, 13, 18, 21 и частичной трисомией 11:22 (синдром Эмануэль). Оказалось, что наличие хромосомной аномалии, хотя и оказывает значительное влияние на весь транскриптом [58], но собственно анеуплоидия не обязательно служит барьером для репрограммирования, и в большинстве случаев полученные линии кариотипически стабильны [59–62].

Хромосомные аномалии, приобретаемые при культивировании ИПСК

Наблюдаемые в культурах ИПСК аберрации могут быть как следствием временной геномной нестабильности в процессе репрограммирования, так и накапливаться при дальнейшем культивировании.

Зависимость от пассажа. Отмечается, что с увеличением пассажа возрастает частота анеуплоидии, однако эта зависимость не является жесткой и однозначной. Так, хромосомные аномалии в ИПСК выявлялись с 4-го по 128-й пассаж, а нормальные кариотипы – с 3-го по 118-й пассаж, в ЭСК аномалии регистрировали уже на 3-м пассаже после получения, а нормальные кариотипы – на 151-, 168-, 228- и 240-м пассажах культивирования [5]. Тем не менее линии ИПСК вдвое чаще несли аномалии кариотипа на поздних пассажах, чем на ранних: 33% против 14% в работе [4] и 13.3% против 8.7% в работе [8]. Все семь ИПСК линий от жировых клеток 50-летней пациентки имели нормальный кариотип до 13-го пассажа, однако за 24 пассажа в четырех из семи линий появились мозаичные хромосомные аномалии, и только три линии сохранили нормальный кариотип [63]. С помощью FISH было показано, что на поздних пассажах происходит повышение частоты мозаичных аномалий кариотипа, которое коррелирует с номером пассажа [64].

В другой работе все 11 обнаруженных микроделеций были зарегистрированы уже на самых ранних пассажах, т.е. скорее всего возникли в процессе репрограммирования, а пять из шести выявленных дупликаций появились при длительном культивировании [15]. Интересно, что при долговременном культивировании некоторые делеции исчезли из клеточной популяции, что свидетельствует об их отрицательной селекции при последующем пассировании [8, 15]. Однако в другой работе описано стабильное сохранение возникших CNV при дальнейшем культивировании [56] и обнаружена положительная корреляция количества CNV с номером пассажа [65]. По данным, полученным на мышах, основным фактором геномной нестабильности оказалось число пассажей, а не процесс репрограммирования сам по себе [51].

Таким образом, в процессе культивирования ИПСК в них происходит накопление генетических аберраций, но скорость этого процесса может значительно варьировать между различными линиями и культурами. Следует отметить, что не существует “безопасного”, т.е. гарантированно генетически стабильного номера пассажа, что осложняет практическое использование ИПСК.

Влияние условий культивирования. Основными факторами, влияющими на поддержание целостности генома ИПСК при культивировании, являются методы пассирования клеток (механическое или ферментативное), источник сыворотки – животный или искусственный, и использование подложки (фидера) либо бесфидерное культивирование.

Так как для клинического применения ИПСК необходима полная стандартизация условий культивирования, а фидерные клетки (например, инактивированные митомицином эмбриональные фибробласты мыши) содержат ксенобиотики, предпочтительно использовать бесфидерные условия. Анализ взаимодействия между ЭСК и субстратом культивирования и его влияния на число центросом показал, что улучшение прикрепления клеток снижает долю мультицентромерных митозов [66]. Обнаружено, однако, что при бесфидерном культивировании ЭСК мыши происходит укорочение теломер, слияние хромосом и рост анеуплоидии с числом пассажей по сравнению с аналогами, растущими на фидере [67].

По данным ряда работ на ИПСК человека также показано, что бесфидерное культивирование и ферментативное пассирование (ФП) ассоциированы с повышенной генетической нестабильностью. Так, вдвое больше линий, имевших нормальный кариотип на ранних пассажах и аномальный – на поздних, пересевалось с применением ФП [4]. В сравнительном исследовании на протяжении более 100 пассажей ФП и бесфидерное культивирование были ассоциированы с генетической нестабильностью, а использование фидера в сочетании с механическим пассированием (МП) оказалось наиболее благоприятно для генетической и эпигенетической стабильности [65]. Мониторинг хромосомных аномалий на протяжении 45 пассажей в линиях ЭСК человека, культивируемых параллельно с использованием ФП и МП, показал, что ФП негативно влияет на целостность генома (трисомия 12 за 30 пассажей, мозаичная трисомия 20 после 10 пассажей, изохромосома 7 i(7)(q10) в 38% клеток всего за пять пассажей). При МП линии ЭСК сохраняли стабильность кариотипа. Помимо хромосомных аномалий, ФП приводило также к быстрому накоплению субхромосомных изменений: 2,4 новых CNV за один пассаж, причем увеличение количества CNV и их длины коррелировало с номером пассажа, тогда как при при МП такой зависимости обнаружено не было [68].

Однако в других работах на линиях ЭСК не было обнаружено влияния методов пассирования на хромосомную стабильность [69] или на число, размер или генный состав вариаций ДНК [70].

Один из центральных вопросов, касающихся генетических аномалий при ФП, – существовали ли они ранее и метод пассирования просто благоприятствовал их селекции, или ФП способствовало их возникновению. Bai с соавторами создали математическую модель, позволяющую установить время появления мутантного клона. Оказалось, что все выявленные хромосомные аномалии не существовали ранее, а появились после начала ферментативного одноклеточного пассирования и были индуцированы им [68].

Другой важный фактор – концентрация клеток при ФП, так как низкая плотность клеток (использование ~200 000 клеток/35 мм³ лунку) связана с их высокой смертностью и 100%-ной клональностью. В то же время высокая клеточная концентрация (>1 000 000 клеток/35 мм³ лунку) может уменьшить стресс в диссоциированых ПСКч, что, вероятно, объясняет отсутствие генетических аномалий в некоторых исследованиях ЭСК человека с применением ФП [71]. Кроме того, бóльшая генетическая стабильность при МП может быть следствием большего размера клеточной популяции, а не внутренне присущим свойством, снижающим частоту мутаций [72]. Показано даже, что МП может благоприятствовать появлению определенных цитогенетических аномалий, например, амплификации сегмента 20q11.21. Скорее всего, применение МП вызывает селективный уклон, основанный на субъективной оценке и выборе колоний по их морфологии, если определенные варианты приводят к акцентуации черт, связанных с плюрипотентностью, таких как снижение спонтанной дифференцировки и более активной экспансии колоний [73].

Так как в условиях высокой плотности культуры дефицит нутриентов и/или вредные концентрации продуктов обмена особенно значимы, субоптимальные условия культивирования увеличивают повреждение ДНК. Например, использование среды с недостатком bFGF негативно влияет на генетическую стабильность ПСКч [28, 74]. В другой работе показано что ИПСК, выращиваемые на культуральной среде для опухолевых клеток, формируют онкогенные колонии и генерируют опухоли у иммунодефицитных мышей [75].

Все это подчеркивает важность использования оптимальных условий культивирования ИПСК для сохранения их генетической целостности, особенно поддержание определенного и неизменного состава культуральной среды. Необходима тщательная оценка влияния новых типов сред, субстратов и методов пассирования на генетическую стабильность клеточных культур [76]. Исходя из результатов исследований генетической стабильности ПСКч и предполагаемых механизмов, задействованных в ее поддержании, предложены возможные способы снижения геномной изменчивости ИПСК: использование культур ИПСК на ранних пассажах; применение “мягких” способов пассирования; использование полноценных, богатых сред и частая смена среды, чтобы предотвратить нехватку нутриентов и избыток продуктов обмена; снижение концентрации кислорода для уменьшения окислительного стресса; добавление нуклеозидов в процессе репрограммирования для снижения репликационного стресса [77, 78].

КОРРЕКЦИЯ КРУПНОМАСШТАБНЫХ ХРОМОСОМНЫХ ДЕФЕКТОВ В ИПСК

Прогресс, достигнутый в последние годы в технологиях редактирования генома, в сочетании с использованием ИПСК позволяет успешно развивать новые подходы к генной терапии наследственных заболеваний. Однако существующие в настоящее время способы редактирования генома неприменимы для крупных хромосомных аномалий, таких как трисомии или протяженные делеции/дупликации, которые изменяют дозу и экспрессию десятков, сотен и даже тысяч генов. Поэтому такой пристальный интерес вызывает возможность применения технологии репрограммирования соматических клеток в плюрипотентные для коррекции крупномасштабных хромосомных дефектов.

Культуры ИПСК от пациентов с хромосомными аномалиями были получены из лимфоцитов, амниотических или эпителиальных клеток с анеуплоидиями по половым хромосомам, трисомиями хромосом 8, 13, 18, 21, и в большинстве случаев они кариотипически стабильны [59–62, 79]. Однако в некоторых исследованиях было зарегистрировано явление нормализации кариотипа ИПСК в части клонов. Так, спонтанная потеря сверхчисленной хромосомы произошла в одном из четырех клонов ИПСК с трисомией хромосомы 21 [80] и во всех трех клонах с трисомией хромосомы 18 [81]. Коррекция кариотипа наблюдалась и в обратной ситуации, когда исходная клеточная линия была моносомной по половым хромосомам: при получении ИПСК от четырех линий фибробластов из ворсин хориона с кариотипом 45,Х было обнаружено, что одна линия восстановила нормальный кариотип 46,ХХ путем возникновения однородительской дисомии (ОРД) по целой хромосоме Х. Клетки с двумя Х-хромосомами подвергались корректной Х-инактивации, т.е. репрограммирование в ИПСК позволило скорректировать кариотип как на геномном, так и на эпигеномном уровне. Морфология колоний дисомных клеток была лучше, а скорость пролиферации выше, чем в ИПСК без коррекции кариотипа. Интересно, что коррекция кариотипа воспроизводилась в данной клеточной линии как при ретровирусном, так и при эписомном репрограммировании, т.е. не зависела от интеграции вектора [82]. Репрограммирование фибробластов со сверхчисленной маркерной хромосомой привело, наряду с получением линий с мозаичными кариотипами, к появлению изогенных линий ИПСК без маркера [83].

Самопроизвольная коррекция кариотипа зафиксирована в ИПСК, полученных от пациентов с кольцевыми хромосомами 17 и 13. Bershteyn с соавторами [84] репрограммировали в ИПСК фибробласты от пациента с синдромом Миллера–Дикера, вызванного кольцевой хромосомой 17, и обнаружили, что четыре из шести ИПСК-клонов имели численно и структурно нормальный кариотип и демонстрировали активную пролиферацию, в то время как остальные клоны с кольцевой хромосомой 17 прекратили рост. SNP-анализ показал, что кольцевая хромосома была потеряна и заменена дополнительной копией ее нормального гомолога, что привело к однородительской дисомии (ОРД17). Примечательно, что r(17) не было найдено ни в одной из 120 проанализированных метафазных пластинок в ИПСК. Авторы предположили, что в плюрипотентном статусе такие клетки могут быть терминальными и неделящимися, а репрограммирование в ИПСК может служить эффективной системой избавления от кольцевой хромосомы [84]. В ИПСК от двух других пациентов с кольцевыми хромосомами 13 также произошла коррекция кариотипа суммарно в семи из девяти клонов [84]. Нормализация кариотипа через репрограммирование в ИПСК была предложена в качестве инструмента для “хромосомной терапии” в клетках с крупномасштабными аберрациями [85]. Однако экспериментальных результатов с использованием этого механизма до сих пор не опубликовано.

К настоящему времени другой исследовательской группе, используя систему CRISPR/Cas9, удалось получить экстрахромосомные кольцевые молекулы ДНК и кольцевые хромосомы в фибробластах человека и клетках эмбриональной почки 293T. С помощью этого подхода оказалось возможно замкнуть в кольцо ДНК длиной от нескольких сот пар оснований до 47.4-мегабазной хромосомы 18 [86]. Кроме того, что эти эксперименты осуществлены на ином, нежели ИПСК, типе клеток, открытым остается вопрос о частоте события нормализации кариотипа, несущего кольцевую хромосому, так как для этого клетка должна: а) потерять кольцо и б) редуплицировать линейный гомолог.

В нашей лаборатории были получены стабильные линии ИПСК из фибробластов пациентов с r(13) и r(22) (четыре и две линии соответственно) [87, 88]. Интересно, что кольцевая хромосома 22 стабильно с высокой частотой сохранялась в плюрипотентных клетках, тогда как кольцевая хромосома 13 оказалась менее стабильна при репрограммировании и/или на ранних пассажах в ИПСК. Вследствие явления “динамического мозаицизма”, присущего клеточным популяциям с кольцевыми хромосомами, в разных клонах с различной частотой происходила как потеря кольцевой хромосомы, так и ее фрагментация, однако спонтанной коррекции кариотипов к нормальному не зарегистрировано ни в одной из полученных линий ИПСК.

Другим примером сохранения кольцевой хромосомы является сублиния ЭСК hESM01r18 с кариотипом 46,ХХ,r(18)(::p11.31→q21.2::q21.2→p11.31::). Вследствие присущей кольцевым структурам митотической нестабильности до 15% клеток сублинии в каждом пассаже имели кариотип, отличный от модального, однако клетки с кариотипом 46,ХХ,r(18) сохранялись в сублинии hESM01r18 в качестве модального класса в течение многих пассажей, что говорит о том, что данная перестройка имеет некоторое селективное преимущество [89]. Таким образом, самопроизвольная коррекция кариотипов с кольцевыми хромосомами в ИПСК не является универсальным феноменом. Возможно, причина этого в том, что разные кольцевые хромосомы имеют разную степень стабильности в зависимости от размера и генного состава [90]. То, что в работе Берштейн с соавт. [84] не было найдено r(17) в ИПСК, может быть связано с локализацией в регионе 17q25 антиапоптотического гена BIRC5, обеспечивающего пролиферативное преимущество, в результате чего r(17) может сильнее компрометировать способность плюрипотентных стволовых клеток к делению, чем кольцевая 13, 18 или 22.

Возникает вопрос, почему самопроизвольная коррекция кариотипа при репрограммировании происходит не во всех клеточных линиях с одинаковыми аномалиями? Так, коррекция наблюдалась в 1/4 линий с трисомиями 21 [80], 1/4 линий с моносомиями Х [82], 4/6 клонов с r(17) и 6/9 клонов с r(13) [84]. Одно из возможных объяснений – существование в исходной клеточной популяции мозаицизма низкого уровня, который невозможно обнаружить обычными методами. В рассматриваемых исследованиях использование чистых линий было подтверждено стандартным цитогенетическим анализом и FISH, что не позволяет исключить низкоуровневый (<1%) мозаицизм по ОРД в “родительских” линиях. В таком случае репрограммирование к плюрипотентности оказывает селективное давление, в результате которого существовавшие в исходной линии клетки с ОРД получают преимущество в росте.

Второе возможное объяснение – репрограммирование стимулирует нарушения сегрегации хромосом с последующим возникновением ОРД благодаря присущим конкретным клеточным линиям особенностям функционирования аппарата клеточного цикла. Luo с соавт. [82] исследовали профиль глобальной генной экспрессии и провели сравнительный анализ транскриптомов между линиями фибробластов с нормальным кариотипом, с корректируемым в направлении 45,Х→46,ХХ кариотипом и с некорректируемым кариотипом 45,Х. Было обнаружено 312 дифференциально экспрессирующихся генов, относящихся к процессам митотического клеточного цикла, сегрегации хромосом, репликации и компактизации ДНК. Экспрессия этих генов была в 2–8 раз выше в линиях с некорректируемым кариотипом, чем в фибробластах корректируемой линии и контрольной группы. Подобные отличия уровней экспрессии генов клеточного цикла также обнаруживались и в соответствующих линиях ИПСК. Список дифференциально экспрессирующихся генов включал гены контрольной точки прикрепления к веретену деления и контрольной точки разъединения хромосом, что указывает на фундаментальные отличия в контрольных точках клеточного цикла между линиями клеток с коррекцией и без коррекции кариотипа [82].

Зарегистрирован случай возникновения сегментной изодисомии в протяженном регионе длинного плеча хромосомы 1 при репрограммировании фибробластов с нормальным кариотипом с помощью модифицированной мРНК, т.е. возникновение ОРД может происходить и в некомпенсаторном контексте [91]. Если самопроизвольная коррекция кариотипа происходит с формированием ОРД, следует иметь в виду и вероятные негативные последствия ОРД, так как она сама может быть причиной патологии либо при гомозиготизации рецессивных мутаций, либо через аномальную экспрессию импринтированных генов [92]. Дополнительную проблему может представлять категория моноаллельно экспрессирующихся генов, доля которых в геноме человека, согласно последним оценкам, может варьировать в диапазоне от 10 до 25% [93].

Разрабатываются также специальные методы функциональной коррекции трисомного кариотипа в ИПСК. Такой подход был предложен для корректировки трисомии 21 Jiang с соавт. [94] и был назван “хромосомным сайленсингом”. В ИПСК от пациента с синдромом Дауна в одну из трех копий хромосомы 21 вводилась последовательность гена XIST, формирующего центр Х-инактивации и обеспечивающего “выключение” несущей его хромосомы. В ИПСК с инактивированной сверхчисленной хромосомой произошло быстрое улучшение пролиферативной активности и способности к нейрональной дифференцировке [94]. Недостаток этого подхода, во-первых, в том, что некоторая часть генов может избегать инактивации, а во-вторых, пространственные и конформационные проблемы, вызванные избытком генетического материала в ядре, не могут быть решены при помощи функционального “выключения” хромосомы.

Способ физической коррекции трисомии 21 в ИПСК от пациентов с синдромом Дауна был предложен Li с соавт. [81]: введение плазмиды, несущей ген тимидинкиназы (трансген TK-NEO), в одну из копий хромосомы 21 с последующим отбором путем обработки культур ганцикловиром. Потеря лишней хромосомы происходила с частотой 10^–4, а полученные дисомные клетки имели более высокую скорость пролиферации и улучшенный потенциал к дифференцировке в эндотелиальные клетки по сравнению с трисомными аналогами [95].

Другая исследовательская группа для целевой элиминации хромосомы использовала метод внесения множества разрывов при помощи системы CRISPR/Cas9. В ИПСК от пациента с синдромом Дауна разрывы индуцировали двумя гайд-РНК, имеющими множество сайтов-мишеней на хромосоме 21, после чего в 15% клеток произошла потеря сверхчисленной копии хромосомы 21. С помощью этого подхода оказалось также возможно селективно удалить половые хромосомы из культивируемых клеток и эмбрионов мыши. Недостаток этого метода – возможность генерации частичных делеций в таргетной хромосоме и оффтаргетные эффекты [96]. Это первые примеры “хромосомной терапии” с применением ИПСК, которые дают потенциальные механизмы потери или выключения целой хромосомы в случае числовых аберраций.

Hirota с соавт. [97] показали, что при репрограммировании в ИПСК фибробластов от стерильных мышей с набором половых хромосом XXY и XYY с высокой частотой происходит потеря лишней половой хромосомы (явление, названное авторами “обусловленная трисомией потеря хромосомы” (trisomy-biased chromosome loss (TCL)). Полученные эуплоидные XY-ИПСК были успешно дифференцированы в клетки мужской половой линии и функциональную сперму и дали при оплодотворении фертильное потомство. Этот механизм работал также, хотя и с меньшей частотой, на клетках человека при получении ИПСК из фибробластов пациентов с синдромом Кляйнфельтера (получены как 46,XY-, так и 46,XX-ИПСК) и синдромом Дауна. Точные механизмы, вызывающие TCL, пока неизвестны, но потеря сверхчисленного гомолога происходила именно во время репрограммирования, а не при дальнейшем культивировании [97].

Предложен еще один возможный способ коррекции протяженных аномалий – хромосомная трансплантация, при которой осуществляется точное замещение эндогенной хромосомы экзогенным гомологом, но пока этот способ апробирован только на модельных объектах. Первый случай успешной хромосомной трансплантации путем замещения эндогенной X-хромосомы, несущей мутацию гена Hprt, нормальным гомологом в ЭСК мыши опубликован в 2015 г. [98]. С помощью микроклеточного метода переноса хромосом (microcell mediated chromosome transfer, MMCT) удалось осуществить перенос нормальной Х-хромосомы в реципиентную клетку с последующей элиминацией мутантного гомолога.

Этот же метод микроклеточного переноса хромосом был использован в обратной ситуации – для получения из кариотипически нормальных ЭСК человека клеточных линий с трисомиями. Панель трисомных клеточных линий с таким же генетическим фоном, как исходная линия, может оказаться полезной для изучения молекулярных и эпигенетических механизмов хромосомного дисбаланса. Получены ЭСК с трисомиями по хромосомам 8, 13, 18 и 21, в которых гены сверхчисленных хромосом демонстрировали глобальную сверхэкспрессию, однако все эти линии сохранили способность к дифференцировке в три зародышевых листка [99].

Исследуются способы коррекции генома, основанные на использовании специфичного для млекопитающих гена Zscan4 (zinc finger and SCAN domain containing 4). Экспрессия этого гена обнаруживается на 2-клеточной стадии преимплантационных эмбрионов мыши. Его продукт необходим для поддержания стабильности генома и сохранения нормального кариотипа в ЭСК мыши [100]. Zsсan4 повышает не только эффективность репрограммирования, но и геномную стабильность ИПСК мыши [101]. Показано, что обработка культур первичных неиммортализованных фибробластов человека синтетической мРНК ортологичного гена ZSCAN4 повышает частоту клеток с нормальным кариотипом в культурах с трисомиями хромосом 21 и 18 [102]. Однако генетический механизм индуцированного исправления трисомии с помощью ZSCAN4 пока неясен, кроме того, нет данных об использовании этого подхода для стволовых клеток, без которых невозможна наработка терапевтически значимого количества клеток. Тем не менее данный подход выглядит многообещающим, так как не требует встройки в геном клеток-мишеней дополнительных конструкций.

Хотя исследования ИПСК направлены на получение и поддержание стволовых клеток с нормальным кариотипом, в некоторых случаях представляют интерес именно анеуплоидные линии. Обычно несбалансированный кариотип ассоциирован с патологией, однако некоторые типы соматических клеток, например гепатоциты, могут быть анеуплоидны и в норме. Возможно, изменения в хромосомном составе важны для поддержания генетического разнообразия в популяции гепатоцитов, что облегчает адаптивный ответ печени на различные повреждения. Noto с соавт. [103] использовали линию ИПСК человека с выраженной анеуплоидностью: большинство клеток имело околотетраплоидный статус (79 ~ 87 хромосом), при этом линия включала потери и добавления отдельных хромосом и хромосомные перестройки (кариотип, полученный при анализе 19 клеток, был представлен следующей формулой: XXYY,-3[19],-6[18],-7[5],-8[18],-11[16],+12[19],-13[3], -14[4],-15[19],-16[12],-17[5] dup(17)(q11.2q25)ins(17) (q25;q25q11.2) [19],-1[12],-19[19],-22[11]). Несмотря на кариотип, клетки формировали колонии с характерной морфологией и иммуногистохимическими показателями плюрипотентных стволовых клеток человека, а сама линия продемонстрировала способность к дифференцировке в гепатоцитоподобные клетки [103]. Эти данные подтверждают, что существует значительная гибкость в хромосомном содержании, совместимая с дифференцировкой в клетки печени.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Длительное культивирование ИПСК в некоторых случаях индуцирует возникновение мутаций, которые могут компрометировать как надежность фундаментальных исследований с использованием ИПСК, так и быть небезопасны для клинического применения. Особенно негативно на качество ИПСК влияют рекуррентные хромосомные аберрации, обеспечивающие пролиферативное преимущество клеток и вызывающие настороженность в связи с возможностью злокачественной трансформации. Полностью предотвратить изменения в генотипе ИПСК практически невозможно, однако их частота может быть снижена при использовании стандартизованных подходов.

Однако, хотя в целом хромосомная нестабильность негативно влияет на возможность использования ИПСК, появилась новая многообещающая область применения ИПСК для коррекции крупных хромосомных аномалий. Пока неясно, способствует ли репрограммирование и плюрипотентный статус клеток нерасхождению хромосом с последующим отбором кариотипически нормальных и функционально более полноценных вариантов, либо выявляет существовавший в исходной клеточной линии низкоуровневый мозаицизм. Работы в данном направлении начаты совсем недавно, однако они вызывают большой интерес как с точки зрения практического использования, так и в качестве экспериментальных моделей для исследования механизмов контроля числа хромосом в клетках человека.

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда № 16-15-10231.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.