Генетика, 2019, T. 55, № 11, стр. 1369-1376

Кукуруза (Zea mays L.) является основной зерновой культурой в мире, ежегодное производство которой составляет более 1.1 млрд т (FAOSTAT, 2017). В сухом зерне кукурузы содержится более 70% крахмала и около 10% белков, поэтому кукуруза является важным источником пищи для человека и животных, а также сырьем для получения этанола и биотоплива [1]. Также кукуруза является модельным организмом для молекулярно-генетических исследований, в том числе связанных с углеводным метаболизмом [2, 3].

К настоящему времени у кукурузы идентифицированы и описаны гены метаболизма крахмала и сахарозы [2–5], а также различные транскрипционные факторы, регулирующие данные процессы [6–8]. Одними из важнейших ферментов углеводного метаболизма растений являются инвертазы (INV, EC 3.2.1.26), которые катализируют необратимый гидролиз сахарозы в глюкозу и фруктозу [5]. Сахароза по флоэме транспортируется в апопласт, цитоплазму и вакуоль, в каждом из этих компартментов функционируют определенные инвертазы [9]. В геноме кукурузы идентифицирован 21 ген, кодирующий инвертазы различной клеточной локализации [5], которые играют важную роль во время раннего развития зерна кукурузы, превращая сахарозу, транспортируемую из листьев, в гексозы для поддержки клеточного деления в эндосперме и эмбрионе [10].

Активность инвертаз регулируется посттрансляционно ингибиторами инвертаз за счет формирования этими белками нековалентного комплекса (1 : 1), в результате чего контролируется гидролиз сахарозы [11]. Белки INVINH являются членами суперсемейства ингибиторов пектинметилэстераз (PMEI; EC 3.1.1.11) и содержат сигнальный пептид и домен PMEI [10]. Роль ингибиторов в регуляции активности инвертаз была показана с помощью оверэкспрессии или замалчивания экспрессии кодирующих их генов в модельных растениях [11]. Кроме того было показано влияние транскрипционной активности ингибиторов инвертаз на некоторые физиологические процессы, такие как развитие семян и плодов, старение листьев и ответной реакции на биотические и абиотические стрессы [12–14].

У кукурузы идентифицирован и охарактеризован только один ген ингибитора инвертаз – INVINH1, для которого показана специфичная экспрессия на ранних стадиях развития зерна и предположено его участие в регуляции синтеза и накопления крахмала в клетках эндосперма путем ингибирования апопластных инвертаз [10]. Ген ZmINVINH1 локализован на хромосоме 2 и не содержит интронов. У сахарного тростника, который, как и кукуруза, относится к трибе Andropogoneae, идентифицировано два гена ингибиторов инвертаз, один из которых, ShINH1, гомологичен INVINH1 Z. mays [11]. Несмотря на то, что к настоящему времени определены полные геномы девяти генотипов кукурузы Z. mays subsp. mays и подвида Z. mays subsp. mexicana (который считается одним из предков современной кукурузы), данные о полиморфизме гена INVINH1 отсутствуют.

Целью данного исследования стала идентификация и анализ последовательностей гена INVINH1 у сортов и линий кукурузы из коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР, г. Санкт-Петербург, Россия).

Для работы были использованы 71 образец кукурузы из коллекции ВИР, включая тетраплоидные линии и образцы дикорастущих популяций из Перу, а также один образец подвида Z. mays subsp. parviglumis (табл. 1). ДНК выделяли из четырехдневных проростков согласно [15]. На основе доступных в NCBI геномных последовательностей гена INVINH1 девяти известных генотипов Z. mays subsp. mays (B73, CML247, DK105, EP1, F7, Mo17, PE0075, PH207, W22) и подвида Z. mays subsp. mexicana были разработаны праймеры INH1-F (5'-ACCAGCCACAATCCATTTATTAG-3') и INH1-R (5'-CTTAATAAGCCCGAGATCATCA-3') для амплификации данного гена у анализируемых образцов кукурузы. Амплификацию последовательностей проводили с использованием реактивов для ПЦР (ООО “Диалат Лтд”) в следующих условиях: исходная денатурация (5 мин, 95°C); 35 циклов денатурации (30 с, 95°C), отжига (30 с, 56°C) и синтеза (1 мин 30 с, 72°C); завершающий синтез (3 мин, 72°C). Полученные ампликоны секвенировали с помощью праймеров INH1-F и INH1-R с использованием системы BigDye и Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (ЦКП Биоинженерия, ФИЦ Биотехнологии РАН). Анализ и выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы MEGA 7.0 (https://www.megasoftware.net/). Присутствие сигнального пептида и PMEI-домена в последовательности белков определяли с помощью программ SignalP4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.0/) и NCBI-CDD (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) соответственно. Радикальные и нейтральные аминокислотные замещения были предсказаны в программе PROVEAN (http://provean.jcvi.org/seq_submit.php). Аллельный полиморфизм анализируемых последовательностей генов ингибиторов инвертаз определяли путем их сравнения с последовательностью INVINH1 генотипа инбредной линии B73, который используется в геномных исследованиях Z. mays subsp. mays в качестве референса [16].

С помощью разработанных праймеров у 71 образца кукурузы из коллекции ВИР были амплифицированы и секвенированы последовательности гена INVINH1. Размер кодирующей части гена INVINH1 у всех анализируемых образцов был одинаков и составил 531 пн. При сравнении с референсной последовательностью INVINH1 образца B73 в исследуемых генах было найдено 37 нуклеотидных замен (6.97% от общей длины). Анализ распределения этих замен у анализируемых образцов кукурузы и генотипов из NCBI позволил выявить 35 аллельных вариантов гена INVINH1 (табл. 2). Аллельные варианты INVINH1 отличались от последовательности INVINH1 B73 SNPs. В подавляющем большинстве они представляли собой различные комбинации определенного набора SNPs (табл. 2), чем и объясняется большое количество выявленных аллельных вариантов. Пять аллельных вариантов были представлены единичными заменами.

Наиболее частым вариантом оказалась последовательность гена референсного образца B73 (аллель А1), выявленным у 12 (16.2%) исследуемых образцов кукурузы коллекции ВИР, а также у генотипов DK105, F7, PH207 из базы данных NCBI. Также были выявлены редкие аллели А16–A35, которые встречались только у одного из анализируемых образцов (табл. 2).

Прародителем современной кукурузы считается подвид Z. mays subsp. parviglumis [17]. Анализ полногеномных последовательностей современных линий кукурузы и гибридов с теосинте (Z. mays subsp. mexicana) показал, что около 10% генома кукурузы происходит от subsp. mexicana [16]. Последовательность INVINH1 у анализируемых образцов Z. mays subsp. mexicana и Z. mays subsp. parviglumis отличается от референса B73 двумя (аллель A4) и тремя (аллель А13) нуклеотидными заменами соответственно. Аллельный вариант А4 (G214T; T234C), характерный для subsp. mexicana, был выявлен у трех образцов (С-224, С-561 и 1149-1), а аллельный вариант А13 (C19G; T389C; A531G) subsp. parviglumis – у образца С-450. Интересно, что у исследуемого 71-го образца кукурузы замены G214T (mexicana), T389C и A531G (parviglumis) были одновременно выявлены в составе нескольких аллелей, в то время как замены T234С (mexicana) и C19G (parviglumis) оказались редкими и не встречались вместе, а также в комбинации с заменами T389C и A531G (parviglumis) и G214T (mexicana) соответственно.

Полученные ампликоны содержали, помимо кодирующей части, 5'-нетранслируемый участок, размер которого варьировал (400–600 пн). В положении –95 от старт-кодона у 21-го образца кукурузы была выявлена вставка: 143 пн (шесть образцов), 190 пн (три образца), 192 пн (девять образцов) и 210 пн (три образца) (табл. 1). Подобная вставка присутствовала также у четырех генотипов кукурузы (B73 (190 пн), DK105 (192 пн), EP1 (192 пн), PE0075 (143 пн)) из базы NCBI. Три анализируемые образца кукурузы (1/99-3-3-7, С-751 и С-430) были гетерозиготны по наличию/отсутствию описанной выше вставки (табл. 1).

Полученные кодирующие последовательности INVINH1 71-го образца кукурузы были транслированы. Мы показали, что 35 выявленных аллелей соответствовали 27 вариантам аминокислотной последовательности INVINH1 (рис. 1).

Рис. 1.

Варианты последовательности белка INVINH1, выявленные у анализируемых образцов кукурузы. Сигнальный пептид и PMEI-домен подчеркнуты сверху. Сайты замещения аминокислот показаны желтым фоном, радикальные выделены красным шрифтом со звездочкой сверху. Рамкой отмечены консервативные остатки цистеина (Cys28, Cys43, Cys95 и Cys142).

В аминокислотных последовательностях INVINH1 у всех анализируемых образцов был идентифицирован сигнальный пептид (1–23 а.о.) и домен PMEI (28–175 а.о.). В последовательности домена PMEI были выявлены четыре консервативных остатка цистеина (Cys28, Cys43, Cys95 и Cys142), которые, как было показано ранее, значимы для функции белка, поскольку образуют две дисульфидные связи и дополнительно фиксируют четырех-шпилечную структуру домена [18].

Всего в последовательностях белков INVINH1 было выявлено 21 замещение аминокислотных остатков, шесть из которых, согласно предсказанию программы PROVEAN, являются потенциально радикальными. Одно нейтральное замещение (L7V) находится в сигнальном пептиде, ответственном за транспортировку ингибитора в апопласт [10]. Остальные замещения локализованы в домене PMEI, в том числе шесть радикальных (A49V, A49G, A65P, S97I, C99R, D108Y) (рис. 1). Наличие радикальных замен в функциональном домене может влиять на пространственную структуру белка и, как следствие, его способность связываться с инвертазами, либо возможность принимать конформацию, необходимую для инактивации инвертаз [18].

Таким образом, была идентифицирована и проанализирована последовательность гена ингибитора апопластных инвертаз INVINH1 у 71-го образца кукурузы из коллекции ВИР. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей INVINH1 анализируемых образцов кукурузы с референсной последовательностью Z. mays subsp. mays B73 позволил идентифицировать 35 аллельных вариантов, что подтверждает высокий уровень внутривидового геномного полиморфизма современной кукурузы, как было показано ранее [1, 16]. Более глубокое изучение функций ингибитора апопластных инвертаз INVINH1 и его связей с углеводным метаболизмом кукурузы может быть использовано для получения линий с измененным содержанием крахмала и сахаров в зерне.

Работа выполнена с использованием экспериментальной установки искусственного климата – ЭУИК (Институт биоинженерии ФИЦ Биотехнологии РАН), при поддержке РФФИ (№ 18-29-07007) и Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объектов животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объектов людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.