Генетика, 2019, T. 55, № 12, стр. 1461-1465

Митохондриальный геном животных является хорошим объектом для филогенетических исследований ввиду его гаплоидного наследования, отсутствия интронов и ограниченной рекомбинации [1]. Митохондриальный ген 12S рРНК часто используется для реконструкции молекулярной филогении, видовой идентификации и филогеографии (например, [2–4]). Длина его маркерного фрагмента варьирует в пределах 350–450 пар нуклеотидов ввиду большого количества делеций и инсерций, и он применялся для изучения событий дивергенции средней и большой давности [5]. В то же время скорость эволюции гена 12S оценивается как высокая, что может привести к насыщению в третьей позиции и искажению результатов исследования филогении таксонов высшего ранга [1]. Данный маркер уже был успешно использован для видового разграничения при исследовании европейских плоских пиявок [6].

На сегодняшний день систематика кольчатых червей остается актуальной и претерпевает множество изменений. Положение различных таксонов данного типа не определено однозначно и оценивается рядом авторов по-разному [7–9]. Acanthobdella peledina, обитающая в северной части Евразии [10] и, по некоторым данным, в Северной Америке [11, 12], является редким реликтовым пиявкоподобным паразитом, мозаично сочетающим в себе примитивные черты предков из подкласса малощетинковых червей с признаками, присущими современным пиявкам [10, 13]. Согласно современным представлениям о филогении и классификации, A. peledina вместе с сестринским видом A. livanowi занимает промежуточное эволюционное положение между подклассами Oligochaeta и Hirudinea. Впервые вывод об уникальном филогенетическом положении акантобделл был сделан Н.А. Ливановым в 1905 г. на основании исключительно морфологических характеристик [13]. Однако существовала и альтернативная точка зрения о принадлежности акантобделл к подклассу Oligochaeta и независимой конвергенции “пиявочных” черт [14]. Ввиду этого классификация пиявок и пиявкоподобных паразитов многократно менялась [10, 15, 16].

Первые работы по молекулярной филогении акантобделл начали проводиться на рубеже XX и XXI вв. на основе анализа ядерного гена 18S рРНК и митохондриального гена малой единицы цитохромоксидазы COI [7, 17]. В данных работах последовательности генов A. peledina уверенно кластеризовались в отдельные независимые ветви, занимающие промежуточное положение между подклассами Oligochaeta и Hirudinea, что согласуется с результатами морфологического анализа, проведенного Ливановым и подтвержденного современными морфологическими методами [18]. Однако несмотря на то что для A. peledina была получена последовательность гена 12S рРНК, она использовалась в филогенетическом анализе только как группа сравнения для укоренения дерева Hirudinea в целом [19]. Работ по установлению филогенетического положения представителей рода Acanthobdella по маркеру 12S проведено не было.

Для настоящей работы мы получили нуклеотидные последовательности образцов, собранных с хариуса и ленка на р. Верхняя Рассоха (приток р. Чечуй, бассейн р. Лена) в Киренском районе Иркутской области. Фрагмент гена 12S рРНК был амплифицирован с использованием пары универсальных праймеров [20]. В анализ была включена последовательность 12S рРНК A. peledina, полученная в 1999 г. [19]. В качестве группы сравнения для филогенетического анализа из международной базы генетических данных GenBank были загружены последовательности 55 представителей Polychaeta, Oligochaeta и Hirudinea. Реконструкцию деревьев по методу максимального правдоподобия (ML) проводили c использованием модели GTR+G+I, рекомендованной ModelTest, с помощью пакета программ MEGA7 [21]. Для байесовского анализа филогении (BI) мы использовали пакет программного обеспечения BEAST v. 2.5.1 [22] с моделью замен GTR+G и начальными параметрами, рекомендованными jModelTest v. 0.1 [23]. Сходимость ESS статистики байесовского анализа проверяли по программе Tracer v. 1.7.1.

При применении двух методов филогенетического анализа кластеризация различных последовательностей как на уровне видов, так и на уровне высших таксонов в целом совпала. При анализе таксонов высокого ранга выявлено отличие двух филогенетических схем, выраженное в разделении последовательностей на ML-дереве (рис. 1,а) на три массивные клады с четко выраженным расхождением олигохет и пиявок с многощетинковыми червями, выбранными нами в качестве внешней группы, тогда как при BI-анализе (рис. 1,б) последовательности разделились на две крупные клады, объединяющие представителей Oligochaeta и Hirudinea. При этом в ходе BI-анализа последовательности Polychaeta были отнесены в одну кладу с представителями Oligochaeta, что противоречит современной классификации [24].

Рис. 1.

ML-дерево (Log L= –4876.76) со значениями бутстреп-поддержек на 1000 репликах (а); BI-дерево со значениями байесовских апостериорных поддержек (б). Шкалы снизу соответствуют генетическим дистанциям.

Рис. 1.

Окончание.

Последовательности вида A. peledina заняли разное положение при реконструкции филогении этими двумя методами. На ML-дереве последовательности акантобделлид расположились вместе с представителями подкласса Hirudinea. По характеру ветвления данного дерева можно сделать вывод, что род Acanthobdella является типичным представителем современных пиявок, что противоречит результатам морфологического анализа и ранних работ по молекулярной филогении. Байесовская реконструкция сгруппировала последовательности акантобделл в отдельную ветвь, более близкую к подклассу Oligochaeta.

Расположение филогенетической линии олигохеты Limnodriloides appendiculatus нестабильно и зависит от метода реконструкции.

Высокие статистические поддержки на уровне родов и видов подтверждают пригодность 12S в качестве маркерного фрагмента для анализа филогении на этом уровне, а также для видовой идентификации. В обоих деревьях наблюдается снижение значений статистической достоверности узлов по мере удаления от листьев к корню, что свидетельствует о большом количестве равновероятных сценариев эволюции и неспособности данного маркерного участка давать разрешенные узлы на высоких таксономических уровнях.

Известно, что бутстреп-поддержки оказываются зачастую ниже, чем байесовские апостериорные поддержки, поскольку при построении бутстреп-реплик каждый раз используется частичный набор данных из матрицы [25]. Несколько низких поддержек на уровне видов, наблюдаемых в байесовском дереве, вероятно, связаны с недостаточным таксономическим разнообразием в наборе данных.

Низкие статистические поддержки узлов у корневой части деревьев свидетельствуют о недостатке филогенетической информации в маркерном участке гена 12S рРНК для реконструкции древней эволюционной истории. Однако применение разных алгоритмов филогенетической реконструкции позволило успешно объединить последовательности в группы видового и родового уровней и одновременно выявило невозможность составить однозначную картину более ранней эволюции. Таким образом, несмотря на непригодность маркерного участка гена 12S рРНК для разрешения филогенетических отношений таксонов высокого порядка (семейств, отрядов и классов), этот фрагмент может быть с успехом использован для анализа филогении на видовом и родовом уровнях вследствие его высокой специфичности.

Авторы выражают благодарность Виктору Тараканову за помощь в сборе образцов.

Сбор образцов проводили в рамках Государственного задания 0345-2019-0002 (АААА-А16-116122110066-1) “Молекулярная экология и эволюция живых систем Центральной Азии в условиях глобальных экологических изменений”. Анализ образцов проводили в рамках гранта РФФИ № 17-29-05097.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.