Генетика, 2019, T. 55, № 2, стр. 165-173

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования были взяты сорта сливы домашней из коллекций Майкопской опытной станции (МОС) и Крымской опытно-селекционной станции (КОСС) Всероссийского института растениеводства им. Н.И. Вавалова (ВИР). В выбороку из 60 сортов вошли два сорта из группы мирабелей, семь ренклодов, девять тернослив, десять стародавних сортов, 32 сорта из группы венгерок (табл. 1).

Экстракцию ДНК проводили из молодых листьев с использованием метода ЦТАБ с модификациями [20].

Для генотипирования были отобраны восемь SSR-маркеров: для шести микросателлитных локусов характерны длинные нуклеотидные мотивы повторов RPPG1-017, RPPG1-032, RPPG3-026, RPPG4-059, RPPG2-011, RPPG1-037 [21]; остальные два локуса BPPCT007 [11] и CPSCT004 [22] обладают динуклеотидными мотивами повторов. Все восемь SSR ранее были апробированы на четырех генотипах сливы домашней [23].

ПЦР проводили с выполнением предварительной оптимизации ряда параметров, таких как температура отжига праймеров, длительность циклов отжига праймеров и элонгации, общее число циклов, концентрация дезоксинуклеотидтрифосфатов, праймеров.

В состав ПЦР смеси общим объемом 25 мкл входили 50 нг ДНК, 0.25 мМ dNTPs, 0.2 мкМ каждого праймера, 2.5 мкл 10-кратного реакционного буфера (ООО “Сибэнзим”), 1 ед. Taq-полимеразы. ПЦР-программу проводили по следующей схеме: 3 мин при 94°С – начальная денатурация; следующие 35 циклов: 45 с денатурации при 94°С, 45 с отжига праймеров при 58°С, 45 с синтеза при 72°С; последний цикл синтеза 4 мин 30 с при 72°С.

Анализ размеров амплифицированных фрагментов проводили на автоматическом генетическом анализаторе ABI prism 3130. Обработку данных осуществляли в программе Gene Mapper 4.1. Для статистической обработки результатов SSR-генотипирования и анализа генетических взаимосвязей изученного генофонда использовали пакеты программ PAST version 2.17c. Для оценки генетической структуры выборки использовалась программа Structure 2.3.4. В расчете были использованы различные значения гипотетических популяций от K = 2 до K = 8 (burn-in period = 200 000; 500 000 iterations). Оптимальные значения K были установлены с помощью онлайн программы Structure Harvester (http://taylor0.biology.ucla.edu/ structureHarvester/), основанной на принципе Evanno method.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для использованных в работе SSR-маркеров на выборке из 60 генотипов сливы домашней число установленных аллелей на локус варьировало в значениях от 6 до 39. Наиболее высокополиморфными маркерами оказались RPPG3-026 (39 аллелей) и RPPG2-011 (34 аллеля). SSR-локус CPSCT004 обладал наименьшим в наборе маркеров полиморфизмом (6 аллелей). В среднем у отобранных для работы микросателлитных маркеров было обнаружено 19.13 аллелей на локус, что сопоставимо с данными, полученными при изучении балканской (17.15 аллелей на локус) и скандинавской (18.7 аллелей на локус) генплазмы [16, 17]. В табл. 2 указана характеристика маркеров, полученная в ходе генотипирования 60 сортов: диапазон размеров аллелей маркеров и число аллелей, выявленных в изученной выборке сортов. Таким образом, совокупно по всем использованным в работе маркерам было получено 153 полиморфных аллеля. По маркерам BPPCT007 и RPPG2-011 уникальным аллельным набором обладали 59 генотипов из исследованной выборки. В свою очередь по маркеру CPSCT004 было установлено лишь девять сортов, обладающих уникальным набором аллелей. Для остальных SSR-маркеров были характерны промежуточные значения. В целом с использованием восьми маркеров получены уникальные наборы аллелей по всем сортам. Общее число аллелей по всем маркерам достаточно для проведения генетической оценки коллекции из 60 генотипов сливы домашней.

Байесовский анализ был проведен на 60 генотипах сливы домашней с использованием восьми SSR-маркеров. Применение Evanno method позволило выявить оптимальное значение K, равное 4 (рис. 1). Первая реконструированная панмиктическая популяция присутствует в соотношении от 50–100% у семи генотипов, пять из которых являются терносливами, а два – традиционными русскими сортами. У подавляющего большинства сортов вклад данной популяции не выявлен. Вторая реконструированная панмиктическая популяция широко представлена у венгерок отечественной и зарубежной селекции, а также тернослив (Керасий кислая, Астрахань 2). Третья популяция преобладает у представленных в выборке ренклодов (за исключением Ренклода Браги и Персиковой), а также встречается у ряда сортов венгерок и сортов народной селекции. Четвертая популяция выявлена у всех групп сортов включая венгерки, ренклоды и терносливы (рис. 1). Также следует отметить, что если 2-я и 4-я популяции представлены у всех подвидов, то первая популяция характерна для терносливов и двух сортов народной селекции. Значительный для большинства ренклодов вклад популяции 3 отсутствует у терносливов. Таким образом, можно судить о наличии в генетической структуре тернослив редкого генетического компонента, отсутствующего у большинства слив за исключением нескольких сортов народной селекции. В наиболее обширных исследованиях, посвященных SSR-генотипированию генофонда сливы домашней, терносливы сформированы отдельной предковой популяцией [13, 16]. Использованные в работе два генотипа мирабели происходят от двух различных гипотетических популяций, что согласуется с данными хорватских и скандинавских исследователей [16, 17] и контрастирует с результатами Horvath et al., по которым мирабели были сформированы одной популяцией [13].

Рис. 1.

Bar plot результатов Байесовского анализа (K = 4) по 60 генотипам сливы домашней.

Также можно отметить тенденцию различных генотипов тернослив к образованию внешних относительно основной выборки сортов кластеров при проведении PCoA (метода главных координат) с применением программы Past. Результаты анализа отображены на рис. 2.

Рис. 2.

Результаты PCoА на выборке из 60 генотипов сливы домашней.

Для исследуемых генотипов сливы домашней был проведен кластерный анализ на основе полученных с помощью SSR-генотипирования данных. Кластеризацию проводили методом UPGMA c применением коэффициента Dice. Дендрограмма, построенная по результатам кластеризации отобранных для исследования генотипов, отображена на рис. 3.

Рис. 3.

Кластеризация сортов сливы домашней методом UPGMA с использованием коэффициента Dice.

Наиболее обособленные от общей выборки генотипы были представлены терносливами: Тернослива донецкая, Тернослив Соляновский, Тернослив Цареградский, Гонгоша. При этом Тернослива донецкая является самым отдаленным генотипом. Однако несколько тернослив не выделяются из общего для большинства слив кластера.

Следует отметить, что зарубежные и отечественные сорта не формируют отдельных друг от друга групп, а представлены в работе единым цельным кластером, обособленным только от большей части терносливов, это свидетельствует об общности происхождения российских и европейских сортов сливы домашней.

Примечательно, что отобранные в работе ренклоды входят в различные кластеры, в которых превалирует сортотип венгерки. Отдельных групп не образуют и крымские автохтонные сорта Изюм Эрика, Крымзы Эрика и Изюм Эрика крупноплодный. Сорт, представляющий в выборке сортотип мирабели, Мирабель крупная, отнесен к кластеру генотипов различного происхождения, из чего следует предположение о генетической близости сортов, относящихся к разным подвидам/сортотипам. Данную генетическую близость, отраженную методом кластеризации, можно объяснить распространенной практикой скрещивания сортотипов между собой.

Данные кластеризации свидетельствуют о генетической удаленности большинства терносливов от основной массы сортов. В связи с этим можно предположить, что терносливы в виду своих морфологических особенностей (размер плода, терпкий вкус и наличие колючек на ветвях) не участвовали в создании большей части сортимента востребованных сортов сливы домашней. Так как обособление генотипов терносливы неполное, не затрагивающее часть образцов, нельзя исключать генетическую связь локальных форм терносливы с возделываемыми культурными сортами сливы домашней.

Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований – проект № 16-44-230260 р_а и Госзадания (тема № 0689-2018-0003).