Генетика, 2019, T. 55, № 2, стр. 223-228

При всем многообразии морфологии цветок покрытосеменных растений имеет консервативную структуру, в том числе строение репродуктивных органов, функция которых – производство семени, несущего зародыш нового растения. Семя развивается из семязачатка, основные части которого – нуцеллус, окруженный одним или двумя интегументами (покровами), и семяножка [1]. Считается, что сходство организации семязачатка является результатом консервативного механизма регуляции пространственно-временной экспрессии гомологичных генов. Так, на развитие нуцеллуса существенное влияние оказывают факторы транскрипции семейств MADS-box и KNOX, а онтогенез внешнего интегумента невозможен без активности фактора транскрипции INNER NO OUTER (INO) семейства YABBY [2, 3].

Семейство генов YABBY, специфичное для растений, появилось в результате эволюционной дупликации гена-предшественника с последующей диверсификацией гомологичных генов, основная роль которых – контроль полярного развития латеральных органов. Эволюция этих генов считается одной из причин возникновения плоского листа и, позднее, цветковых органов. Наиболее полно гены YABBY изучены у модельного растения Arabidopsis thaliana [4–6]. В семействе YABBY различают “вегетативные” гены YABBY1, YABBY2, YABBY3 и YABBY5, определяющие абаксиально-адаксиальную асимметрию всех надземных листоподобных органов, и два “генеративных” гена INO и CRABS-CLAW (CRC), которые в процессе эволюции приобрели узкую специализацию. Так, INO определяет идентичность абаксиального (наружного) слоя клеток внешнего покрова семязачатка [1, 7, 8], а CRC участвует в регуляции развития завязи и нектарников [4, 9, 10].

Данные о полиморфизме генов-гомологов INO могут быть информативны в свете изучения формирования и развития семян, поскольку внешний интегумент необходим для определения положения микропиле и для последующего образования семенной кожуры, что непосредственно влияет на жизнеспособность семян. Также стоит отметить, что сам интегумент как эволюционное образование появился с возникновением семян и, соответственно, свойствен только семенным растениям. Как правило, растительный геном содержит одну копию гена INO, у некоторых видов выявлено несколько изоформ INO, что является следствием альтернативного сплайсинга [11, 12]. Как и растительные факторы транскрипции других семейств у двудольных растений, белки YABBY обладают высокой структурно-функциональной гомологией. Белок INO, как и другие члены семейства YABBY, содержит на С-конце сходный с HMG-боксом YABBY-домен, а на N-конце – домен цинкового пальца Cys2Cys2-типа [4].

Определено, что асимметричный рост интегумента семязачатка A. thaliana опосредован взаимодействием INO с SUPERMAN [5, 13], а также с ко-активатором ADA2b/PRZ1 и ко-репрессорами LEUNIG и SEUSS [3]. Мутации в гене или промоторе INO вызывают аномалии развития семязачатка вплоть до его отсутствия [5, 8]. Учитывая степень участия INO в развитии семязачатка, можно предположить связь полиморфизма генов/белков INO с числом интегументов.

Известно, что унитегмальный семязачаток как более недавний эволюционный признак характерен для всех представителей Asterids, к которому принадлежит семейство Solanaceae, включающее важные овощные культуры перец (род Capsicum), картофель (секция Petota род Solanum) и томат (секция Lycopersicon род Solanum). Секция Lycopersicon включает в себя культивируемый вид томат овощной Solanum lycopersicum и 12 дикорастущих видов [14, 15]. К настоящему времени ген INO охарактеризован только у S. lycopersicum [16, 17] и S. pimpinellifolium [18].

В настоящей работе были идентифицированы и охарактеризованы полногеномные последовательности INO 12 образцов 11 видов томата (табл. 1). ДНК выделяли из свежих листьев согласно [19]. На основе последовательности INO S. lycopersicum cv. Heinz 1706 (GeneID:101244955) были разработаны специфичные праймеры для амплификации полных последовательностей генов-гомологов INO у исследуемых видов томата – INOF (5'-AYTCTAGATYCCTCTCTCAC-3') и INOR (5'-TTGACAATRGCATCTTYAACAC-3'). Также для секвенирования были разработаны внутренние праймеры, специфичные к последовательностям четвертого (INOex4F; 5'-AGAGAGCTCCWTCKGCTTA-3') и пятого (INOex5R; 5'-AAGCTTGCTTGTGAGTCATG-3') экзонов. ПЦР-фрагменты клонировали в pGEMT-easy (Promega, Madison, CША) и секвенировали (по 4 клона) на платформе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (ЦКП “Биоинженерия”). Структурно-филогенетический анализ проводили в программе MEGA 7.0. В качестве референсной использовали последовательность SlINO S. lycopersicum cv. Heinz 1706. Консервативные домены определяли с помощью программы NCBI-CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi) и литературных данных [16]. Влияние аминокислотных замен на структуру и функции белков предсказывали с помощью программы PROVEAN (http://provean.jcvi.org).

Полные последовательности гена INO были амплифицированы, клонированы и секвенированы у всех 12 анализируемых образцов томата. Общая длина гена, включающего семь экзонов, варьировала от 1775 пн у S. chilense до 1827 пн у S. peruvianum var. dentatum (табл. 1), в основном за счет коротких инделей в интронах. Определенные генетические расстояния между исследуемыми видами томата были невелики и составляли от 0.00 (S. lycopersicum cv. Silvestre recordo – S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium) до 0.05 (S. peruvianum var. dentatum – S. cheesmaniae, S. galapagense, S. chmielewskii). Однако они были больше генетических расстояний между последовательностями гена INO (0.00–0.03) у видов рода Capsicum [20].

Размер кДНК INO составил 579 пн, за исключением INO S. arcanum (549 пн; делеция 30 пн в экзоне VI) и S. habrochaites (576 пн; делеция 3 пн в экзоне II) (табл. 1). У S. pennellii, который считается наиболее древним видом томата [14], размер кДНК INO составляет 585 пн. У другого представителя рода Solanum, картофеля S. tuberosum, размер кДНК INO составляет 600 пн благодаря вставке 24 пн и делеции 3 пн в экзоне III (табл. 1).

Белки INO имели размер192 а.о., за исключением INO S. arcanum (182 а.о.) и S. habrochaites (191 а.о.). Для сравнения INO видов Capsicum состоит из 215 а.о. [20], а INO A. thaliana – из 262 а.о., что предполагает существенную разницу длин междоменных участков белка INO. На основании этого можно было бы связать размер междоменных областей INO с числом покровов семязачатка. Однако у видов Prunus, как уни-, так и битегмальных, INO имеет размер около 220 а.о. [21]. К тому же было показано отсутствие связи между уни- или битегмальной структурой семязачатка и экспрессией гена INO [1, 21].

В белках INO всех анализируемых видов томата были идентифицированы консервативные домены цинкового пальца (12–52 а.о.) и YABBY (108–163 а.о.) (рис. 1,а).

Рис. 1.

Сравнение аминокислотных последовательностей ортологов INO у исследуемых образцов томата с известными белками INO томата овощного S. lycopersicum cv. Heinz 1706 (SlINO; AOS88523), S. pennellii (SpINO; XP_015075232), картофеля S. tuberosum (StINO; NW_006239143), перца C. annuum (CaINO; XP_016546914) и табака N. tabacum (NtINO; XP_016511953). Домен цинкового пальца (12–52 а.о.) и домен YABBY (108–163 а.о.) подписаны под выравниванием полужирным шрифтом. Замены в консервативных доменах указаны звездочками (а); б – дендрограмма, построенная на основе анализа аминокислотных последовательностей INO у исследуемых видов томата (ML, модель Jones–Taylor–Thornton + Gamma distributed with Invariant sites). В узлах указаны значения бутстрепа на 1000 бутстреп-реплик.

В сравнении с референсным геном SlINO в последовательностях INO исследуемых образцов томата выявлены 243 вариабельных сайта (12.9% от выровненной длины): 200 локализованы в интронах, 43 – в экзонах. Из 43 экзон-специфичных SNPs 22 были несинонимичными и приводили к замещениям аминокислотных остатков: 10 – в домене цинкового пальца (Q12E, Y22F, S34G, C37S, V40I, R44G, C48R, T49N, T50A, L52R), девять – в междоменной области (F67L, D68N, P73S, T81I, N88D, S89A, D92E, N99D, L102V), два – в YABBY-домене (V108D, F125L), и одно – на С-конце (V175G). При этом следует отметить, что четыре радикальных замещения в домене цинкового пальца (S34G, R44G, C48R, T49N) и оба радикальных замещения в YABBY-домене признаны потенциально вредными (статус “deleterious”). Интересно, что в экзоне VI INO S. arcanum была выявлена протяженная делеция 30 пн, приводящая к отсутствию 10 а.о. в С-концевой внедоменной области, сразу после YABBY-домена (рис. 1,а).

Выявленная вариабельность, в особенности потенциально вредные радикальные замещения, могут оказывать влияние на фолдинг белков INO, изменяя силу и/или специфичность связывания с ДНК-мишенями и/или белковыми партнерами. Можно предположить, что межвидовой полиморфизм INO Solanum, не изменяя основной функции белка, может приводить к морфологическому разнообразию архитектуры интегумента и отражаться на эффективности оплодотворения семязачатка и формирования оболочки семени и, как следствие, на жизнеспособности семян.

Ранее было показано, что экспрессия кДНК генов семейства YABBY A. thaliana, CRC и YABBY3, под контролем промотора гена INO (PRO_INO, A. thaliana) была способна восстанавливать формирование внешнего интегумента в трансгенных растениях A. thaliana с мутацией ino. Однако только экспрессия кДНК INO под контролем PRO_INO была ограничена базальной областью развивающихся семязачатков за счет негативной регуляции транскрипционным фактором SUPERMAN, что приводило к восстановлению правильной асимметрии внешнего интегумента [5]. Исследование отдельных областей INO A. thaliana с использованием химерных белков под контролем промоторов PRO_INO и 35S CaMV показало, что важная роль в правильном развитии интегумента принадлежит внедоменным областям [5]. В случае исследуемых видов томата N- и С-концевые области белка INO меньше, чем у INO A. thaliana в 4 и 2 раза соответственно. Это согласуется с тем, что сверхэкспрессия гена SlINO (S. lycopersicum) в растениях A. thaliana с мутацией ino не восстанавливала исходный фенотип семязачатка [1], что может свидетельствовать о функциональных различиях внедоменных областей ортологов INO у разных видов/семейств растений. В этой связи факт обнаружения 10 а.о. делеции в С-концевой внедоменной области INO S. arcanum может представлять интерес для дальнейших исследований.

Для того чтобы оценить, насколько эволюция INO соотносится с предполагаемой эволюцией видов томата в целом [14, 22], была построена дендрограмма по аминокислотным последовательностям INO (рис. 1,б). На дендрограмме виды томата секции Lycopersicon образовывали единый кластер (ИБ=100) в кладе INO, базальные ветви к которому формировали белки INO других Solanaceae – перца C. annuum, картофеля S. tuberosum и табака N. tabacum (рис. 1,б). Однако внутри кластера хорошего разделения между видами не наблюдалось. Не было показано даже достоверного разделения видов на более древние зеленоплодные и считающиеся эволюционно более молодыми красноплодные виды, что было выявлено при анализе других представителей семейства YABBY видов томата (YABBY1 и YABBY3) [19, 23]. Данный факт может указывать на более недавнее происхождение гена INO и/или более низкую скорость эволюции гена INO в сравнении с “вегетативными” генами YABBY.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 16-16-10022, с использованием экспериментальной установки искусственного климата ЭУИК и ЦКП “Биоинженерия”.