Генетика, 2019, T. 55, № 2, стр. 239-242

Пол у медоносных пчел контролируется аллельной комбинацией гена, названного csd (complementary sex determiner) [1]. При этом самки развиваются из оплодотворенных яиц, несущих гетерозиготные аллели гена csd, а трутни развиваются из неоплодотворенных яиц, несущих гемизиготные аллели. Из оплодотворенных, но гомозиготных по гену пола яиц развиваются диплоидные трутни, которые уничтожаются рабочими пчелами. Низкое аллельное разнообразие по гену csd приводит к потере силы семьи вследствие появления нежизнеспособных диплоидных трутней, поэтому идентификация аллелей гена csd является важной задачей для селекционных программ, особенно для тех, где используется искусственное осеменение маток.

Селекция медоносных пчел традиционно основывается на оценке хозяйственно полезных признаков, таких как зимостойкость, гигиеническое поведение, медовая продуктивность и др. Если при селекции сельскохозяйственных животных для усиления экономически важных признаков используют инбридинг, то в случае с медоносными пчелами он может быстро привести к летальному исходу в силу особенностей определения пола. Примером организации, использующей как оценку хозяйственно полезных признаков, так и оценку аллельного разнообразия гена csd, служит пчеловодческая организация Betta Bees из Новой Зеландии [2]. Такая программа разведения позволяет поддерживать генетическое разнообразие в условиях закрытого типа разведения.

Генетическая структура гена csd, его функциональный и эволюционные механизмы рассмотрены в обзорной работе [3]. Считается, что основной вклад в формирование функционального белка csd вносит домен PSD (potential specifying domain), находящийся под действием балансирующего отбора [4]. Этот домен включает в себя аргинин-сериновый (шестой экзон) и гипервариабельный (ГВУ, седьмой экзон) участки. Аргинин-сериновый участок принимает участие в межбелковых взаимодействиях [1], а гипервариабельный участок определяет аллельную специфичность гена csd [2, 5]. Мутации в ГВУ происходят в 2.4 раза быстрее, чем в микросателлитах [6], что обеспечивает быстрое формирование новых аллелей.

Цель данной работы – оценка аллельного разнообразия гена csd пчелиных семей с племенной пасеки на Южном Урале, специализирующейся на разведении A. m. mellifera L.

Проанализированы 42 трутня из 15 семей (по 2–3 трутня с семьи) A. m. mellifera L. из племенной пасеки Иглинского района Республики Башкортостан. Образцы были собраны весной 2016 г. ДНК выделяли из мышц торакса с использованием набора ДНК-ЭКСТРАН-2 (www.syntol.ru). Для анализа использовали праймеры, ограничивающие консервативные участки шестого и восьмого экзонов гена csd, которые фланкируют ГВУ. ПЦР-анализ проводили в термоциклере Bio-Rad T100 с использованием праймеров F-GGGAGAGAAGTTGCAGTAGAG и R-TTGATGCGTAGGTCCAAATCC. Смесь ПЦР включала 17 мкл дистиллированной воды, 2 мкл 10-кратного Taq-буфера (25 мM Mg²⁺), 0.4 мкл dNTP (10 мкМ), 0.6 мкл F- и R-праймера (2 ОЕ) и 0.3 мкл Taq-полимеразы. Режим ПЦР: 5 мин 94°С, затем 30 циклов с денатурацией 30 с при 94°С, отжигом 30 с при 54.5°С, элонгацией 60 с при 72°С и конечной элонгацией 7 мин при 72°С. Секвенирование амплифицированных фрагментов выполнено на секвенаторе Applied Biosystem sequencer в фирме “Синтол” (Москва).

Выравнивание последовательностей ДНК выполнили при помощи ClustalW в программном обеспечении MEGA ver. 6 на референсную последовательность гена csd (NCBI Reference Sequence: NC_007072.3) и другие последовательности csd, представленные в GenBank. Экзоны были определены при помощи BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Различия в аминокислотных (АК) последовательностях определяли в Unipro UGENE.

Последовательности шестого–восьмого экзонов гена csd были зарегистрированы в GenBank под номерами KY502199–KY502249. Среди 42 последовательностей были обнаружены 20 различных последовательностей ГВУ (табл. 1). Общие АК последовательности были обнаружены у семей № 13 и 52, № 43 и 45, № 43, 61 и 136. Согласно данным владельца пасеки трутни из семьи № 13 использовались для осеменения маток из семьи № 52, а в семьях № 43 и 45 матки являются сестрами, что объясняет наличие идентичных аллелей у этих семей. Поскольку в исследуемой пасеке используется искусственное осеменение маток, необходимо объединить отцовские семьи, имеющие одинаковые аллели гена csd (т.е. семьи № 13 и 52, № 43 и 45, № 43, 61 и 136), чтобы избежать появления диплоидных трутней в потомстве.

В настоящем исследовании минимальная разница между АК последовательностями, кодируемыми аллелями ГВУ, составила 6 АК (между аллелями из семей № 96 и 108), максимальная – 27 АК между аллелями из семей № 26 и 13. Согласно Lechner et al. [6], проанализировавшим 77 пар аллелей csd для определения различий между функциональными парами аллелей (гетерозиготами), число АК замен в ГВУ должно быть больше или равно шести. Тогда как в исследовании Beye et al. [7] было показано, что функциональный белок csd формируется, если в ГВУ наблюдаются пять АК замен. Различие в 5 АК замен в ГВУ считается минимально необходимым для получения функционального белка csd [5].

Мы сравнили полученные АК последовательности с последовательностями, представленными в GenBank (табл. 2). Среди 20 аминокислотных последовательностей, кодируемых аллелями ГВУ, 15 соответствуют уже известным (см. столбец GB ID в табл. 2).

К представленным в GenBank аллелям добавлены пять новых аллелей, обнаруженных в семьях № 26, 27, 45, 108 и 136-2 (обозначены полужирным шрифтом в табл. 1). Наличие 20 различных аллелей в 15 семьях разных линий A. m. mellifera свидетельствует о большом генетическом потенциале данной пасеки. Ранее Hyink et al. [2] в 42 семьях выявили 25 аллелей csd, а Zareba et al. [5] при анализе двух польских популяций медоносной пчелы обнаружили в одной из них 85 разных аллелей (в 99 семьях) и 74 аллеля в другой (в 94 семьях).

Анализ полиморфизма ГВУ гена пола в локальной популяции Apis mellifera L. в целом показал, что аллельное разнообразие данной выборки соответствует ранее полученным показателям для других популяций. Результаты исследования позволят скорректировать программу разведения медоносных пчел с установкой на предотвращение использования трутней из семей, имеющих идентичные аллели csd. Таким образом, современные программы разведения пчел должны включать оценку пасек не только на хозяйственно полезные признаки, но и на аллельное разнообразие гена csd. Если оценка ХПП позволит отфильтровывать слабые семьи на уровне всей пасеки, то контроль аллельного разнообразия гена csd предотвратит появление диплоидных трутней, большая доля которых может привести к снижению численности рабочих пчел и, следовательно, к снижению силы семьи (т.е. контроль на уровне семьи).

Выражаем благодарность к. б. н. В.О. Кугейко за предоставление пчел для исследования.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 17-44-020648 с использованием ресурсов ЦКП УФИЦ РАН и ЦКП “Коллекция насекомых ИБГ УФИЦ РАН”.