Генетика, 2019, T. 55, № 3, стр. 247-254

Эпигенетика исследует изменения в экспрессии определенных ДНК-последовательностей, которые нельзя объяснить классическими мутациями и структурными генными нарушениями. Термин “эпигенетика” был впервые введен в 1942 г. Конрадом Ваддингтоном (C.H. Waddington) еще до открытия основных эпигенетических механизмов, и только в 1980-е годы данная область получила свое развитие. Этому предшествовало открытие главенствующей роли метилирования цитозина в эпигенетической регуляции у животных в 1975 г. На сегодняшний день выделяют три основных эпигенетических механизма регуляции экспрессии генов: модификация гистонов/ремоделирование хроматина, метилирование ДНК и действие некодирующих РНК. Экспрессия генов регулируется на обоих уровнях передачи генетической информации: на уровне транскрипции (c помощью модификации гистонов и ДНК-метилирования) и на уровне трансляции (с помощью некодирующих РНК) [1, 2].

Посттрансляционная модификация гистонов представляет собой ацетилирование, метилирование и фосфорилирование их N-концевого участка; также могут встречаться другие модификации, например сумоилирование, убиквитинирование, цитрулинирование. Модификации гистонов могут приводить как к активации рядом расположенных генов (например, при ацетилировании и метилировании лизина гистона Н3), что осуществляется преимущественно благодаря более свободному доступу к ДНК, так и к депрессии транскрипции (например, при диметилировании). Комбинацию различных модификаций гистонов иногда называют “гистоновым кодом”, который “пишется” специфическими ферментами, в частности гистоновыми ацетилтрансферазами и гистоновыми деацетилазами. Ремоделирование хроматина осуществляется также специфическими белковыми комплексами и изменяет доступ к нуклеосомной ДНК [3–5].

Некодирующие РНК признаны очень важным регуляционным инструментом в экспрессии генов. Если раньше считалось, что в белки транслируется только 2% всей ДНК, а остальное является условным “мусором” (“junk”), то сейчас это мнение существенно поменялось, и некодирующие РНК занимают одно из центральных мест в изучении регуляции генной экспрессии. Выделяют множество их типов: микроРНК (miRNA), малые интерферирующие РНК (siRNA), РНК, ассоциированные с белками семейства Piwi (piRNA), длинные некодирующие РНК (lncRNA) и др. Благодаря своей сайт-специфичности некодирующие РНК участвуют в регуляции экспрессии генов на всех уровнях: транскрипции, сплайсинга и трансляции [3–5].

Метилирование ДНК – это модификация ДНК, при которой цитозиновый остаток в CpG-динуклеотиде метилируется в позиции N5-пиримидинового кольца (5mC). Доказано, что с метилированием ДНК связаны пролиферация и дифференцировка нейральных стволовых клеток, синаптическая пластичность, нейрональная репарация, обучение и память [6]. В геноме существуют два типа распределения CpG-динуклеотидов: рассеянный, при котором CpG присутствуют в виде одиночных динуклеотидов, составляя около 80% их общего числа, и районы обогащения CpG, называемые CpG-островками. Подсчитано, что в головном мозге человека около 6–8% CpG-островков метилированы. Основная функция метилирования ДНК – супрессия генов, однако это справедливо преимущественно в случаях расположения метилирования в промоторной области. При расположении метилированных CpG-сайтов внутри или после кодирующей последовательности гена регуляция может быть обратной, т.е. приводить к активации экспрессии гена [1, 5].

Метилирование CpG-сайтов осуществляется специальными ферментами ДНК-метилтрансферазами – DNMT1, DNMT3a, DMNT3b. Первый фермент DNMT1 отвечает за поддержание ДНК-метилирования, тогда как DNMT3a и DMNT3b – за метилирование de novo. При этом фермент DNMT2, несмотря на свое название, метилирует РНК, а не ДНК. Метильная группа для метилирования ДНК поступает от S-аденозилметионина (SAM), который в результате переноса превращается в S‑аденозилгомоцистеин (SAH), а последний в свою очередь регенерируется в SAM через соответствующий цикл с участием гомоцистеина, фолиевой кислоты, витаминов В6, В12 и метионина [6, 7].

CpG-метилирование – обратимая модификация ДНК. С помощью ферментов ТЕТ1, ТЕТ2, ТЕТ3 происходит поэтапное превращение 5mC в 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), затем в 5-формилцитозин (5fC), 5-карбоксилцитозин (5caC) и опять в цитозин (С). Считается, что 5hmC является функционально активной эпигенетической меткой, тогда как значение 5fC и 5саС еще предстоит исследовать [8].

Кроме CpG-сайтов метилирования привлекает исследовательское внимание не-CpG-метилирование в динуклеотидах CpA, CpT, CpC, которое наиболее часто встречается в центральной нервной системе: так, например, ДНК-метилом в зубчатом ядре взрослой мыши содержит из всех метилированных сайтов 75% CpG и 25% не-CpG. Значимость данных модификаций ДНК требует дальнейшего изучения [8]. Кроме цитозина показано метилирование гуанина и аденина (7mG, 3mA) [7]. В данном обзоре мы остановимся только на классической модификации цитозина – 5mC.

Считается, что в целом с возрастом происходит гиперметилирование ДНК, однако изменение ДНК-метилирования – это не однонаправленный процесс. Так, известный метод определения возраста, предложенный Ховатом (Horvath’s epigenetic clock), исследует 353 CpG-сайта, из которых с возрастом гиперметилируются 193 и гипометилируются 160. Эпигенетический возраст по мере развития организма увеличивается в логарифмической прогрессии, тогда как во взрослом состоянии отмечается его линейное увеличение [7]. При этом при болезнях Альцгеймера и Паркинсона многие исследования обнаруживают тенденцию к общему гипометилированию ДНК.

Нейродегенерация при болезни Альцгеймера (БА) связана с накоплением амилоидных бляшек в межклеточном пространстве и нейрофибриллярных клубков, состоящих из гиперфосфорилированного внутриклеточно тау-белка. Общее гипометилирование ДНК, упомянутое ранее, при БА соотносится с уменьшением SAM в различных областях головного мозга; также у пациентов показано увеличение фолиевой кислоты и гомоцистеина в плазме кроме, что может косвенно отражать процессы гипометилирования [9]. Основными генами семейных форм БА являются APP (предшественник β-амилоида), PSEN1 (пресенилин 1) и PSEN2 (пресенилин 2). Для спорадических форм наиболее значим аллельный вариант ε4 гена АроЕ. В первых эпигенетических исследованиях было показано гипометилирование промоторной области гена APP, однако в последующих работах были получены противоречивые результаты, так же как и для генов PSEN1 и МАРТ (последний кодирует белок тау). Для гена ApoE показано, что аллель ε4 может приводить к снижению метилирования CpG-островка, расположенного в 3'-области. Кроме основных генов также в единичных работах были исследованы гены CLU, PP2A, SORBS3, S100A2, NEP, SP1, COX2, BDNF, CREB, ANK1 с различными результатами по метилированию: для ряда генов отмечался паттерн гиперметилирования, для других – гипометилирования [9, 10]. Интересна работа, в которой показано изменение метилирования в митохондриальной ДНК, однако в связи с методическими ограничениями данная находка требует репликативных исследований [8].

Болезнь Паркинсона (БП) с молекулярной точки зрения является синуклеинопатией. Белок альфа-синуклеин обнаруживается в нервных окончаниях и составляет около 1% общего белка мозга, предположительно участвует в процессах передачи сигнала, обучения и формирования памяти [11]. Ген альфа-синуклеина, SNCA, локализуется на хромосоме 4q21.3-q22. Изменения его дозы (дупликации и трипликации), а также миссенс-мутации ассоциированы с аутосомно-доминантным наследованием БП. Мутации в гене SNCA приводят к изменению его конформации, белок синуклеин при этом приобретает новые свойства и структуру, что приводит к его агрегации и образованию характерных интранейрональных белковых включений – телец Леви [12].

Понимание того, что повышение дозы гена запускает патологические механизмы БП, привело к изучению метилирования SNCA. Несколькими исследованиями было показано, что у пациентов с БП ген SNCA гипометилирован [13–16]. По некоторым данным, при этом наблюдается параллельное увеличение мРНК альфа-синуклеина [17]. Гипометилирование может быть использовано как диагностический маркер заболевания с достаточно хорошей специфичностью 74–78%. Метилирование зависит от пола (оно больше у женщин), возраста (у пожилых лиц постепенно снижается), определенных вариантов нуклеотидной последовательности гена (rs3756063, REP1) и от дозы получаемого препарата леводопы – предшественника дофамина (увеличивается на фоне повышения дозы препарата). Способность леводопы индуцировать метилирование SNCA также была подтверждена на мононуклеарной культуре клеток [18]. У пациентов с БП уровень метилирования в лейкоцитах периферической крови соответствует таковому в клетках головного мозга [16, 19]. Несмотря на общее мнение по этому вопросу, существуют единичные работы, в которых не выявлено различий в метилировании SNCA между пациентами с БП и контрольной группой [20–22].

Для других моногенных форм паркинсонизма, в частности связанных с генами LRRK2 и PRKN, изменений метилирования обнаружено не было [17, 23]. Для БП также было показано гипометилирование промоторной области гена фактора некроза опухоли альфа, участвующего в процессах воспаления, которые также имеют прямое отношение к патогенезу данного заболевания [24].

В большом исследовании GWAS по БП были выявлены два гена, ассоциированных с заболеванием, – SNCA и MAPT [25]. Ген MAPT располагается на 17-й хромосоме (17q21.1) и кодирует тау-белок, основная функция которого – стабилизация цитоскелетных микротрубочек в нейронах. Кроме БП, патология тау-белка является ключевой в широком спектре различных нейродегенераций – так называемых таупатий (БА, лобновисочная деменция, прогрессирующий надъядерный паралич и др.). В отличие от других генов для MAPT большее значение имеет определенный гаплотип: так, H1-гаплотип является фактором риска развития нейродегенеративной патологии [26]. В недавней работе показано, что Н1-гаплотип более метилирован по сравнению с Н2-гаплотипом. Метилирование МАРТ обратно коррелирует с экспрессией гена в головном мозге, при этом уровень метилирования меньше в скорлупе по сравнению с мозжечком и поясной извилиной по аутопсийным данным. Возраст начала БП коррелирует с уровнем метилирования МАРТ, что может рассматриваться как подтверждение нейропротективных свойств гиперметилирования МАРТ, уменьшающего патологическую экспрессию гена [27].

В одном полноэпигеномном исследовании ассоциаций (epigenome-wide association study) были выявлены около 20 генов, ассоциированных с БП и отличающихся по метилированию от контроля, из которых значимость двух генов подтверждена в больших когортных исследованиях – это гены FANCC (cg14115740) и TNKS2 (cg11963436) [28].

Боковой амиотрофический склероз (БАС) и лобно-височная деменция (ЛВД) – заболевания единого фенотипического спектра. В первую очередь их объединяет ген C9orf72, который был открыт в 2011 г. Описана также возможность выявления мутации C9orf72 при БА, паркинсонизме, фенокопиях болезни Гентингтона. Основной мутацией в гене C9orf72 является экспансия гексануклеотидных повторов GGGGCC, которая располагается в первом интроне [29]. Экспансия считается патологической при числе копий гексануклеотидных повторов выше 30, а “бесспорно патологической” – от 400 до >4400 гексануклеотидных повторов [30]. Обсуждаются три возможных взаимодополняющих молекулярных механизма, через которые реализуется патологическое действие экспансии в гене C9orf72: 1) гаплонедостаточность; 2) образование РНК-фокусов с секвестрацией РНК-связывающих белков; 3) RAN-зависимая трансляция области экспансии (от англ.: repeat associated non-ATG translation), приводящая к образованию белков, состоящих из повторов и формирующих внутри клетки нерастворимые агрегаты [31, 32].

Рядом работ для гена C9orf72 было показано, что гиперметилирование промоторной области является нейропротекторным механизмом. Подсчитано, что около трети носителей экспансии в C9orf72 имеют гиперметилированный промоторный участок в цис-положении по отношению к мутации [33, 34]. Гиперметилирование увеличивает продолжительность жизни у пациентов с ЛВД, т.е. медленное прогрессирование заболевания ассоциировано с супрессией мутантного гена C9orf72. Показано, что уровень метилирования передается из поколения в поколение [35]. Уровень метилирования в лейкоцитах периферической крови соответствует таковому в различных областях головного мозга и не зависит от возраста на момент взятия крови, что свидетельствует об определенной стабильности данного молекулярного показателя [35]. При гиперметилировании C9orf72 у пациентов с ЛВД отмечается лучшее выполнение нейропсихологических тестов, а также большая сохранность гиппокампа, лобной коры, таламуса при нейровизуализационных и нейропатологических исследованиях [36]. При гистопатологических исследованиях показано, что гиперметилирование ассоциировано с подавлением транскрипции и уменьшением патологических РНК-фокусов и соответствующих дипептидных белковых включений в головном мозге. Деметилирование C9orf72 приводит к процессам аутофагии и нарастанию окислительного стресса, уменьшению патологических включений [33].

Появились первые работы по изучению метилирования C9orf72 на культурах клеток. Например, в работе с различными клеточными линиями, несущими данную мутацию, был продемонстрирован дифференцированный паттерн метилирования и подтвержден нейропротекторный эффект гиперметилирования [37].

Для больных БАС также характерно гипометилирование генов SOD1, VEGF, GLT, для больных ЛВД – гиперметилирование гена GRN [38, 39].

Для полиглутаминовых заболеваний изучение эпигенетических феноменов в основном было сосредоточено на модификации гистонов. Так, при болезни Гентингтона (БГ) в качестве нового лекарственного препарата для последующих клинических испытаний предложен один из ингибиторов гистоновых деацетилаз [40, 41]. И только в последние годы стали появляться работы по изучению метилирования ДНК при БГ [42, 43]. БГ – аутосомно-доминантное заболевание, вызываемое экспансией CAG-повторов в первом экзоне гена НТТ. В норме число CAG-повторов составляет 6–35, у больных БГ может наблюдаться от 36 до 120 повторов (редко более). Исследования in vitro на контрольных клетках и клетках, экспрессирующих мутантный HTT, показали эпигенетическую дизрегуляцию множества генов, из которых наиболее часто упоминаются ген BDNF и ген аденозинового рецептора А2А [44].

Еще одним заболеванием, относящимся к полиглутаминовым патологиям и исследованным на предмет эпигенетических изменений, является спиноцеребеллярная атаксия 2 (СЦА2), связанная с мутацией в гене ATXN2. Ген ATXN2, располагающийся в локусе 12q24.1, состоит из 30 экзонов и кодирует белок атаксин-2. Первый экзон содержит полиглутаминовый тракт (CAG/CAA; полиQ), подверженный экспансии. В норме число тандемных копий CAG-повторов варьирует от 14 до 28. “Полная” экспансия тринуклеотидных повторов (>34 CAG-копий) приводит к развитию классического полиглутаминового заболевания – аутосомно-доминантной СЦА2 [45]. “Промежуточный” интервал 28–33 повтора представляет собой “серую зону”, которая, как было показано в ряде недавних работ, является новым универсальным фактором риска развития целого ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как БП, синдромы атипичного паркинсонизма, БАС, ЛВД [46]. Установлено, что атаксин-2 участвует в процессах клеточного деления, формирования актиновых филаментов, апоптоза, клеточного сигналинга.

В работе по изучению метилирования CpG-динуклеотидов промоторной области ATXN2 было выявлено, что гиперметилирование ассоциировано с экспансией CAG-повторов у пациентов с СЦА2, что подразумевает эпигенетические механизмы контроля экспрессии мутации. Гиперметилирование промотора “смягчает” фенотипические проявления и отсрочивает развитие заболевания, что было показано на описанных в литературе примерах разных пациентов с одинаковым числом CAG-повторов [47].

Болезнь Фридрейха (БФ) – наиболее частая форма наследственных атаксий, распространенность которой составляет около одного случая на 29 000 населения. Данное аутосомно-рецессивное заболевание связано с гомозиготной экспансией GAA-повторов (66–1700 тринуклеотидов) в первом интроне гена FXN [48]. Экспандированный участок нарушает созревание первичного транскрипта, препятствуя вырезанию интрона из молекулы зрелой мРНК; это приводит к пропорциональному снижению или даже к полному блоку трансляции гена с недостаточностью в тканях синтеза белка фратаксина – продукта гена FXN. Фратаксин участвует в регуляции митохондриального транспорта железа [49]. Показано, что с нарастанием числа копий GAA-повторов в мутантном гене имеют место более ранняя манифестация симптомов и более быстрый темп прогрессирования болезни [50, 51].

Несколькими исследованиями было показано, что GAA-экспансия может приводить к формированию гетерохроматина в этом участке. Анализ также выявил повышенное метилирование в 5'‑участке и, наоборот, пониженное в 3'-участке гена. Кроме того, установлена обратная взаимосвязь между возрастом начала заболевания и повышенным метилированием ДНК в двух CpG-участках, располагающихся до области экспансии [52].

Значение эпигенетической регуляции для БФ было подтверждено в другом исследовании. У пациентов в отличие от контроля отмечалось гиперметилирование области, расположенной выше гена FXN, и гипометилирование области, расположенной ниже. Выявлена связь между гипометилированием 3'-участка и возрастом начала заболевания. Учитывая ожидаемую обратную связь между уровнем экспрессии FXN и тяжестью состояния пациентов, предполагается, что модификация ДНК-метилирования может влиять на прогрессирование заболевания, а также что эпигенетический профиль может служить измеряемым и изменяемым маркером при проведении специфического лечения [53].

Синдром ломкой Х-хромосомы является одним из первых заболеваний, для которых были описаны эпигенетические изменения. Экспансия тринуклеотидных CGG-повторов в 5'-нетранслируемой промоторной области гена FMR1 (локус Xq27.3) приводит к вариабельным клиническим нарушениям. Существуют четыре основных состояния данного хромосомного участка, характеризующихся различным числом CGG-копий: 1) нормальные аллели содержат <30 повторов; 2) “полная” мутация (>200 CGG-повторов) приводит к синдрому ломкой Х-хромосомы (FXS) с манифестацией умственной отсталости в детском возрасте; 3) премутация (от 55 до 200 CGG-повторов) приводит к развитию синдрома атаксии/тремора, ассоциированного с ломкой Х-хромосомой (FXTAS), основные клинические особенности которого – мозжечковая атаксия, интенционный тремор, периферическая полиневропатия и паркинсонизм; 4) “промежуточное” состояние (или “серая зона” экспансии, от 39 до 55 CGG-повторов) характеризуется генетической нестабильностью и может быть ассоциировано с риском развития паркинсонизма [54].

Последовательной серией работ было показано, что “полная” мутация, приводящая к репрессии FMR1, связана с метилированием самой CGG-экспансии и CpG-динуклеотидных сайтов в промоторном регионе, при этом уровень ДНК-метилирования обратно коррелирует с экспрессией FMR1. Предложено по уровню метилирования региона с геном FMR1 осуществлять скрининг новорожденных на синдром ломкой Х-хромосомы [55]. Метилирование CpG-динуклеотидных повторов в первом интроне FMR1 коррелирует с когнитивными и психиатрическими нарушениями у женщин-носительниц премутации и “полной” мутации [56, 57].

Описаны два редких случая клинически здоровых мужчин с “полной” мутацией FMR1, в обоих случаях эпигенетический анализ выявил неметилированную “полную” мутацию и неметилированный промоторный регион, при этом уровень FMR1 транскрипта был сопоставим с контрольными значениями [58].

Сравнительно давно был предложен интересный эпигенетический механизм, объясняющий как метилируются CGG-повторы FMR1 с последующей супрессией гена, который позже нашел свое подтверждение [2]. Предполагается, что CGG-повторы в составе РНК на ранних стадиях эмбриогенеза расщепляются комплексом Dicer с образованием некодирующих РНК. Эти РНК с помощью других белков приводят к метилированию CGG-повторов и к репрессии FMR1 уже в процессе развития. Таким образом, считается, что первичная генетическая мутация может приводить к “вторичной эпигенетической мутации” [59–61].

В отличие от “полной” мутации при премутации отмечается повышение уровня мРНК FMR1, однако уровень соответствующего белка FMRP сохраняется на нормальных значениях или снижен в связи с измененной трансляцией. Повышение транскрипта приводит к патологическим процессам в связи с токсическими свойствами РНК, содержащей повторы. В одном исследовании на модели FXTAS на дрозофиле было показано, что с помощью эпигенетических изменений возможны супрессия аккумуляции патологической мРНК и подавление фенотипических проявлений, характерных для синдрома FXTAS [62].

Эпигенетическая регуляция экспансии гена FMR1 также изучается на клеточных культурах [63]. Известно, что реактивация транскрипции в данном случае происходит под воздействием 5‑аза-2-дезоксицитидина, ингибитора ДНК-метилтрансфераз, но не при добавлении трихостатина А, ингибитора гистоновых деацетилаз. Это подтверждает важность именно ДНК-метилирования в развитии заболевания.

Большое значение имеет работа, опубликованная в 2018 г., в которой показаны перспективы применения разработанной системы таргетного редактирования метилома [64]. С помощью dCas9-Tet1 и направляющей молекулы РНК было осуществлено деметилирование CGG-экспансии гена FMR1, при этом гетерохроматин в промоторной области гена был переведен в активный и была восстановлена экспрессия FMR1 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках. Нейроны, получаемые из отредактированных стволовых клеток, полностью восстанавливали фенотип до нормального и сохраняли должную экспрессию FMR1 при трансплантации в мозг мыши.

Таким образом, в настоящий момент пришло время практического использования полученных знаний об эпигенетических механизмах регуляции генов, что открывает новые перспективы и стратегии в лечении нейродегенеративных заболеваний.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант 17-75-20211).