Генетика, 2019, T. 55, № 4, стр. 406-417

Наследование маркерных генов в потомстве межвидовых гибридов томатов, экспрессирующих ген recA Escherichia coli

Р. А. Комахин 1*, Н. А. Милюкова 2, С. Р. Стрельникова 1, А. А. Криницына 13, В. В. Комахина 1, А. А. Жученко 1

1 сероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии
127550 Москва, Россия

2 Российский государственный аграрный университет – МСХА им. К.А. Тимирязева
127550 Москва, Россия

3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра высших растений
119234 Москва, Россия

* E-mail: recombination@iab.ac.ru

Поступила в редакцию 12.04.2018
После доработки 11.10.2018
Принята к публикации 30.10.2018

Полный текст (PDF)

Аннотация

У межвидовых гибридов снижение частоты генетических обменов между хромосомами из разных видов и негативные взаимодействия между функционально несовместимыми локусами ограничивают генетическую изменчивость среди потомства. Ранее в потомстве линейных гибридов культурного томата Solanum lycopersicum с экспрессией гена recA Escherichia coli была повышена доля кроссоверных генотипов. В настоящей работе для изучения влияния экспрессии гена recA на частоту возникновения кроссоверов в потомстве межвидовых гибридов были получены трансгенные гибриды между S. lycopersicum и некоторыми дикорастущими видами томатов. У межвидовых гибридов обнаружены негативные взаимодействия между локусами культурного томата и видов S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium и S. habrochaites, в последнем случае приводящие к полулетальному некрозу. Экспрессия гена recA у межвидовых гибридов с S. cheesmaniae частично компенсирует среди потомства F2 дефицит рецессивных генотипов в локусе Wv:wv хромосомы 2. В целом кроссоверных генотипов в потомстве F2 было больше у межвидовых трансгенных гибридов, чем у нетрансгенных гибридов аналогичной комбинации скрещивания, однако меньше, чем у линейных гибридов S. lycopersicum.

Ключевые слова: томаты, Solanum, межвидовые гибриды, трансгенные растения, recA, рекомбинация, кроссинговер.

DOI: 10.1134/S0016675819040064

Доместикация и селекция культурного томата Solanum lycopersicum исчерпали большую часть его биологического разнообразия, полученного от предковой формы Solanum lycopersicum var. cerasiforme [1]. Девять дикорастущих видов томатов скрещиваются с культурным томатом и могут быть донорами нового аллельного разнообразия [2]. У значительного числа межвидовых гибридов культурного и дикорастущих видов томатов не обнаружено существенных нарушений синапсиса гомеологов и их сегрегации в мейозе [3]. Однако отмечено подавление кроссинговера, необходимого для формирования в потомстве рекомбинантов с кроссоверными хромосомами [36], и негативные взаимодействия Добжанского–Мюллера (“Dobzhansky–Muller” incompatibilities) между функционально несовместимыми локусами из разных видов, ограничивающие фертильность и приводящие к отклонениям в наследовании маркерных аллелей среди потомства [3, 7]. Несмотря на это, кроссинговер между гомеологами является единственным эффективным и регулярным механизмом интрогрессии отдельных локусов из генома дикорастущих видов в хромосомы культурного томата.

Для запуска мейотического кроссинговера клетки по всему геному создают двухцепочечные разрывы (ДЦР) ДНК, при репарации которых 3'-концы одноцепочечной ДНК используются ДНК-зависимыми рекомбиназами Rad51 и Dmc1 для поиска гомологичной двухцепочечной ДНК [8]. У стерильных нокаут-мутантов rad51-1 арабидопсиса хромосомы не достигают полного синапсиса во время профазы I и фрагментированы уже на стадии диакинеза, свидетельствуя об участии Rad51 в репарации ДЦР с использованием сестринской хроматиды в качестве матрицы [9]. Нокаут-мутация гена DMC1 у арабидопсиса нарушает формирование бивалентов в мейозе, но не приводит к фрагментации хромосом, предполагая участие Dmc1 в репарации ДЦР с использованием гомологичной хромосомы в качестве матрицы [10]. Считают, что белок Dmc1 обеспечивает межгомологичную репарацию ДЦР путем задержки их межсестринской репарации [11], и в этом процессе белок Rad51 выполняет поддерживающую роль без использования своей каталитической рекомбиназной активности [12]. Эти результаты предполагают, что частота и распределение кроссинговеров могут зависеть от наличия и соотношения в клетке различных белков с рекомбиназной активностью.

Экспрессия гена бактериальной рекомбиназы recA Escherichia coli в растениях табака Nicotiana tabacum в 3 раза повышала в соматических клетках количество ДЦР, восстановленных по механизму гомологичной рекомбинации, и более чем в 2 раза увеличивала число сестринских хроматидных обменов [13, 14]. В наших исследованиях у линейных гибридов культурного томата экспрессия гена recA E. coli в 1.5 раза повышала частоту мейотического кроссинговера между маркерными генами wv и d хромосомы 2 [1517].

Известен альтернативный путь индукции мейотического кроссинговера за счет подавления системы миссмэтч-репарации (MMP) ДНК. У межвидовых гибридов дрожжей мутация гена миссмэтч-репарации Msh2 приводит к повышению жизнеспособности спор [18], а у растений арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) – к повышению мейотического кроссинговера между фенотипическими маркерами хромосомы 5 с 6.31 до 8.81% [19]. К сожалению, из-за различий в основном числе хромосом у Arabidopsis и его родственных видов затруднительно оценить, как влияет супрессия гена MSH2 на кроссинговер между гомеологами. Частичное подавление экспрессии генов MMP у интрогрессивной линии культурного томата позволило умеренно (до 1.3 раза) повысить рекомбинацию между восьмыми хромосомами S. lycopersicum и S. lycopersicoides [20].

Цель данного исследования состояла в оценке влияния экспрессии гена recA E. coli у межвидовых гибридов культурного томата на частоту возникновения кроссоверов в их потомстве.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали растения культурного томата (S. lycopersicum), экспрессирующие ген recA E. coli и содержащие сцепленные маркерные гены wv (white virescent) и d (dwarf) хромосомы 2, а также ген “отсутствие антоциана”, локализованный вне хромосомы 2 [16, 17, 21]. Для получения межвидовых гибридов в качестве опылителей использовали растения дикорастущих томатов S. lycopersicum var. cerasiforme, Solanum cheesmaniae, Solanum pimpinellifolium, Solanum habrochaites и S. habrochaites var. glabratum (табл. 1). Гибриды F1 создавали и выращивали при естественном освещении в теплице в г. Москва (Россия). Статистическая оценка по критерию хи-квадрат (χ2) и расчет частоты рекомбинации (rf) методом наибольшего правдоподобия выполнены в соответствии с рекомендациями [22]. Для анализа потомства использовали популяции растений F2 (совокупность семян одного плода) со всхожестью семян не менее 90%, которые выращивали в течение месяца при освещенности 15–20 клк, температуре 24°С и фотопериоде 16/8 ч.

Таблица 1.  

Генотипы линий томатов

Линия Генотип Хромосома, локус Страна происхождения
S. lycopersicum RecA wv – верхние листья желтые
d – растения карликовые,
без антоциановой окраски
Экспрессия гена recA E. coli
2, 41
2, 70
Россия
wv – верхние листья желтые
d – растения карликовые
Без антоциановой окраски
2, 41
2, 70
Марглоб Wv – все листья зеленые
D – высокие растения
Антоциановая окраска
2, 41
2, 70
Мо938
[18]
wv – верхние листья желтые
d – растения карликовые
Без антоциановой окраски
2, 41
2, 70
Молдова
S. lycopersicum var. cerasiforme Wv – все листья зеленые
D – высокие растения
Антоциановая окраска
2, 41
2, 70
Молдова
Solanum pimpinellifolium 0722
Solanum habrochaites var. glabratum 15914
Solanum habrochaites CGN
15878
Голландия
Solanum cheesmaniae CGN
15820
Wv – все листья зеленые
D – высокие растения
Антоциановая окраска
Красные плоды
2, 41
2, 70

Выделение ДНК и РНК, получение полноразмерных последовательностей кДНК и молекулярно-биологический анализ наследования гена recA выполняли в соответствии с опубликованными ранее результатами [16, 17]. Количественное содержание мРНК гена recA с нормализацией относительно гена актина (U60482) томатов определяли при помощи полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Для каждого гена получение кДНК и ПЦР-РВ проводили последовательно в одной реакционной смеси. Для этого в 2.5× реакционную смесь для ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA Green I (Синтол, Россия) добавляли праймеры, комплементарные участку гена актина (Fwd-act 5'-ttg tgc tgg act ctg gag at-3' и Rev-act 5'-tgg gag ggc ata acc ttc a-3') или участку гена recA (EcRecA+ 5'-gtt cca tgg atg tgg aaa cc-3' и EcRecA– 5'-ata tcg acg ccc agt tta cg-3'), суммарную РНК в качестве матрицы и ревертазу MMLV-RT (Синтол, Россия). Температурный профиль реакции: 45°С – 900 с; 95°С – 300 с; 50 циклов: 95°С – 15 с, 60°С – 40 с. Специфичность амплификации с использованием пар праймеров проверяли электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле, принимая образование одного ампликона в качестве ее критерия. Уровень флуоресценции регистрировали в конце каждого цикла с использованием амплификатора CFX96 Touch Real Time System (Bio-Rad, USA). Нормализацию результатов ПЦР-РВ выполняли с использованием программы qgene-96 [23]. Измерения повторяли 5 раз в 3‑кратной повторности с использованием молодых листьев растений размером 3.5 ± 0.5 см.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Создание межвидовых трансгенных гибридов томатов, экспрессирующих ген recA E. coli

Ранее нами были созданы трансгенные гибриды культурного томата комбинации (Мо938 × Марглоб), экспрессирующие ген recA E. coli под контролем вирусного промотора CaMV35S с инсерцией Т-ДНК в одном локусе генома, который наследуется независимо от маркерных генов wv и d хромосомы 2 и гена “отсутствие антоциана” [16, 17, 21]. Среди поколения F3 от самоопыления гибридов отобрали независимые по происхождению гомозиготные в отношении гена recA, маркерных рецессивных генов wv, d и “отсутствие антоциана” растения № 6/1 и 17/6. Для контроля выбрали нетрансгенные растения из популяции 6/1 с аналогичными рецессивными маркерами. Опылением трансгенных и нетрансгенных растений культурного томата пыльцой томатов S. lycopersicum var. cerasiforme, S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium, S. habrochaites и S. habrochaites var. glabratum получили межвидовые гибриды с ожидаемым маркерным фенотипом дикорастущего вида-опылителя. В отличие от остальных комбинаций скрещиваний, у гибридов с S. habrochaites var. glabratum через 3–4 нед. после прорастания обнаружили замедление роста и постепенное усыхание листьев и стеблей, а гибридные семена с S. habrochaites прорастали и некротизировались в плодах.

Для одновременного сравнительного анализа также создали межлинейные гибриды культурного томата комбинации (Мо938 × Марглоб), содержащие в гетерозиготном состоянии те же маркерные гены, что и межвидовые гибриды.

Молекулярно-биологический анализ ДНК гибридов, созданных на основе трансгенных растений культурного томата, подтвердил наличие в их геноме последовательности гена recA и присутствие в клетках его полноразмерной мРНК ожидаемого размера около 1000 пн (данные не представлены). Для сравнения уровней экспрессии изучили содержание мРНК гена recA относительно мРНК референсного гена актина томата с использованием ПЦР в реальном времени (рис. 1).

Рис. 1.

Уровни экспрессии гена recA в листьях растений томатов по результатам ПЦР в реальном времени (нормализовано относительно экспрессии гена актина томата). Представлены средние значения для четырех гибридов (S. lycopersicum × S. lycopersicum var. cerasiforme), пяти гибридов (S. lycopersicum × S. cheesmaniae) и четырех гибридов (S. lycopersicum × S. pimpinellifolium), полученных на основе линии культурного томата № 6/1. Значения для гибридов (S. lycopersicum × S. pimpinellifolium) на основе линии № 17/6 рассчитаны на основе шести гибридов. Контроль – нетрансгенные гибриды (S. lycopersicum × S. pimpinellifolium). Планки погрешностей соответствуют стандартным ошибкам.

Экспрессия гена recA не превышала 0.10 от уровня экспрессии гена актина (рис. 1). В родительских растениях экспрессия целевого гена была выше, чем в гибридах, вероятно, из-за их гомозиготности по отношению к гену recA. Среди гибридов с S. pimpinellifolium на основе растения культурного томата № 6/1 отмечены наиболее низкие значения экспрессии, сравнительно более высокие у гибридов на основе растения № 17/6.

В целом у межвидовых гибридов фертильность пыльцы составляла от 34 до 74% и была достоверно ниже, чем у линейных гибридов культурного томата (93%) и у исходных родительских форм (92–98%). Межвидовые гибриды с S. lycopersicum var. cerasiforme и с S. cheesmaniae демонстрировали от 69 до 74% фертильной пыльцы и не различались. Уровень фертильной пыльцы у трансгенных гибридов с S. pimpinellifolium составлял 53 ± 4% и был достоверно выше, чем у их контрольных аналогов – 34 ± 4%. У гибридов этой комбинации скрещиваний фертильность была достоверно ниже, чем у остальных межвидовых гибридов.

Наследование аллелей маркерных локусов и гена recA в потомстве гибридов

В потомстве пяти линейных гибридов культурного томата (Мо938 × Марглоб) все 17 проанализированных популяций F2 демонстрировали менделевскую сегрегацию аллелей в трех маркерных локусах – Wv:wv, D:d и “наличие:отсуствие антоциана”. Доли рецессивных гомозиготных генотипов по всем проанализированным локусам среди потомства были близки к теоретически ожидаемым 0.25 и составили от 0.24 до 0.26 (табл. 2). Аналогичную картину наблюдали в потомстве всех гибридов с S. lycopersicum var. cerasiforme (табл. 2).

Таблица 2.

Доли рецессивных генотипов в потомстве различных гибридов томатов

Гибрид F1 Доля рецессивных генотипов Число растений F2
wvwv dd отсутствие антоциана
S. lycopersicum ×
× S. lycopersicum var. cerasiforme
RecA 1 0.24 ± 0.03 0.24 ± 0.01 0.25 ± 0.01 519
2 0.22 ± 0.02 0.22 ± 0.02 0.26 ± 0.02 664
3 0.24 ± 0.02 0.26 ± 0.02 0.22 ± 0.02 426
4 0.23 ± 0.02 0.23 ± 0.02 0.24 ± 0.02 670
Cреднее 0.23 0.24 ± 0.01 0.24 ± 0.01 2279
Контроль 1 0.24 ± 0.01 0.23 ± 0.02 0.25 ± 0.01 594
2 0.28 ± 0.02 0.25 ± 0.03 0.26 ± 0.03 366
3 0.25 ± 0.02 0.21 ± 0.02 0.28 ± 0.02 581
Cреднее 0.26 ± 0.01 0.23 ± 0.01 0.26 ± 0.01 1541
S. lycopersicum ×
× S. cheesmaniae
RecA 1 0.22 ± 0.02 0.22 ± 0.02 0.26 ± 0.01 640
2 0.20 ± 0.02 0.22 ± 0.02 0.30 ± 0.01 719
3 0.18 ± 0.04 0.20 ± 0.02 0.31 ± 0.02 700
4 0.24 ± 0.02 0.25 ± 0.02 0.24 ± 0.02 688
5 0.21 ± 0.01 0.22 ± 0.02 0.26 ± 0.03 434
Cреднее 0.21 ± 0.01* 0.22 ± 0.01* 0.27 ± 0.01 3181
Контроль 1 0.15 ± 0.02 0.18 ± 0.02 0.25 ± 0.02 467
2 0.10 ± 0.02 0.16 ± 0.02 0.33 ± 0.01 510
3 0.09 ± 0.01 0.14 ± 0.02 0.25 ± 0.01 820
4 0.12 ± 0.01 0.16 ± 0.01 0.27 ± 0.01 357
Cреднее 0.12 ± 0.01 0.16 ± 0.01 0.28 ± 0.02 2154
S. lycopersicum ×
× S. pimpinellifolium
RecA 1 0.25 ± 0.02 0.24 ± 0.01 0.22 ± 0.02 939
2** 0.23 ± 0.01 0.21 ± 0.02 0.13 ± 0.01 998
3** 0.22 ± 0.02 0.21 ± 0.06 0.13 ± 0.01 892
4** 0.24 ± 0.01 0.22 ± 0.01 0.15 ± 0.01 833
Cреднее 0.24 ± 0.01 0.22 ± 0.01 0.16 ± 0.02* 3660
Контроль 1 0.24 ± 0.01 0.25 ± 0.01 0.25 ± 0.01 1053
2 0.28 ± 0.01 0.28 ± 0.01 0.23 ± 0.01 1004
3 0.24 ± 0.02 0.22 ± 0.02 0.25 ± 0.02 612
4 0.27 ± 0.02 0.28 ± 0.02 0.24 ± 0.01 817
Cреднее 0.26 ± 0.01 0.26 ± 0.01 0.24 ± 0.01 3486
S. lycopersicum ×
× S. lycopersicum
1 0.24 ± 0.01 0.24 ± 0.01 0.26 ± 0.01 523
2 0.22 ± 0.01 0.24 ± 0.01 0.26 ± 0.01 423
3 0.28 ± 0.01 0.23 ± 0.01 0.24 ± 0.01 316
4 0.25 ± 0.01 0.24 ± 0.01 0.30 ± 0.01 230
5 0.25 ± 0.01 0.23 ± 0.01 0.25 ± 0.01 355
Cреднее 0.25 ± 0.01 0.24 0.26 ± 0.01 1847

 * Здесь и далее значения у трансгенных гибридов, существенно отличающиеся от их контроля при p ≤ 0.05. ** Здесь и в табл. 4 гибриды получены на основе трансгенной линии культурного томата № 17/6, оставшийся трансгенный гибрид на основе линии № 6/1.

В восьми из тридцати одной популяции F2 от трансгенных гибридов с S. cheesmaniae отмечено нарушение наследования аллелей в локусах Wv:wv и D:d (рис. 2, табл. 2). В частности, в сравнении с ожидаемым было меньше рецессивных генотипов (wvwv – 0.21 и dd – 0.22), которых, несмотря на это, было достоверно больше, чем в потомстве контрольных гибридов (wvwv – 0.12, dd – 0.16). В потомстве контрольных гибридов только в четырех из семнадцати популяций F2 наблюдали менделевское наследование всех маркеров.

Рис. 2.

Количество популяций F2 в потомстве гибридов S. cheesmaniae и S. pimpinellifolium с менделевским наследованием маркерных генов во всех трех локусах (темно-серый фон) и с отклонением сегрегации хотя бы в одном локусе (светло-серый фон). Цифрами указано количество проанализированных популяций.

Несмотря на то, что семена F2 получили со всех гибридов с S. pimpinellifolium, пригодным для анализа оказалось потомство только четырех трансгенных и контрольных гибридов, поскольку в остальном преобладали немногочисленные популяции с низким содержанием семян. В тридцати четырех из сорока трех популяций от трансгенных гибридов было нарушено наследование маркерных аллелей, прежде всего за счет достоверного уменьшения доли рецессивных гомозигот “отсутствие антоциана” (рис. 2, табл. 2). Практически двукратное снижение этих долей наблюдалось только у гибридов на основе растения культурного томата № 17/6. В потомстве гибридов с трансгенным растением № 6/1 и в потомстве контрольных гибридов доли всех рецессивных гомозиготных генотипов не различались и не отличались от аналогичных долей среди потомства линейных гибридов томата.

Для выявления взаимосвязи между характером сегрегации в локусе Wv:wv среди потомства гибридов с S. cheesmaniae и их трансгенным статусом сравнили наследование гена recA внутри совокупности растений F2 с рецессивным фенотипом wvwv от всех трех комбинаций межвидовых гибридов (табл. 3).

Таблица 3.

Наследование гена recA E. coli среди растений F2 с рецессивным фенотипом wvwv

Гибрид F1 Сегрегация Wv:wv (3 : 1) Число растений фенотипа wvwv χ2 (3 : 1)
recA (+) recA (–) всего
S. lycopersicum × S. lycopersicum var. cerasiforme Да 51 17 68 0
S. lycopersicum × S. cheesmaniae Да 37 37 74 24.66
Нет 16 9 25 1.61
S. lycopersicum (линия 6/1) × S. pimpinellifolium Да 37 17 54 1.21

Примечание. recA (+) – трансгенные или recA (–) нетрансгенные растения. Для p ≤ 0.05 и d.f. = 1 критическое значение χ2 = 3.84.

Установлено, что в потомстве гибридов с S. lycopersicum var. cerasiforme и с S. pimpinellifolium, как и ранее в потомстве линейных гибридов томата [17], ген recA наследуется моногенно, поскольку три четверти растений были трансгенными и одна четверть нетрансгенной (табл. 3). В потомстве гибридов с S. cheesmaniae среди рецессивных генотипов wvwv из популяций с моногенной сегрегацией в локусе Wv:wv доли трансгенных и нетрангенных генотипов оказались равны. В популяциях с пониженным содержанием рецессивных генотипов wvwv доля трансгенных растений оказалось в 2 раза выше, чем нетрансгенных.

Аналогично изучили наследование гена recA в потомстве трех трансгенных гибридов с S. pimpinellifolium, созданных на основе линии культурного томата № 17/6, в потомстве которых обнаружили уменьшение частоты передачи аллеля “отсутствие антоциана”. В целом оказалось, что из 182 потомков только 104 были трансгенными, что примерно на четверть ниже ожидаемого уровня.

Фенотипическая структура популяций в потомстве гибридов

Анализ наследования отдельных маркерных аллелей не дает представления о кроссоверном разнообразии среди потомства гибридов. Поэтому был определен процент кроссоверных фенотипов Wvd и wvD на участке wv–d хромосомы 2 среди всего потомства F2, независимо от характера сегрегации маркерных аллелей в каждой популяции (рис. 3).

Рис. 3.

Фенотипическая структура популяций F2 на участке wv–d хромосомы 2 в потомстве различных гибридов томатов. WvD и wvd – нерекомбинантные, а Wvd и wvD – рекомбинантные фенотипические классы. Трансгенные гибриды обозначены как RecA.

В потомстве межвидовых трансгенных и контрольных гибридов с S. lycopersicum var. cerasiforme и с S. pimpinellifolium и линейных гибридов культурного томата в совокупности кроссоверных генотипов было от 20 до 23% и различий между вариантами скрещиваний не было. В потомстве трансгенных гибридов с S. cheesmaniae в совокупности рекомбинантных генотипов было достоверно меньше (18.2%), чем у потомства линейных гибридов (22.6%), но все же больше, чем у их контрольных межвидовых аналогов (13.8%). В последнем случае сокращения в 1.7–1.8 раза затронули не только кроссоверный wvD, но и некроссоверный класс wvd.

Частоты кроссинговера между генами wv и d хромосомы 2

С целью минимизации влияния нарушений сегрегации маркеров среди F2 от межвидовых гибридов на оценку частот кроссинговера для анализа использовали только популяции с менделевским наследованием маркерных аллелей в локусах Wv:wv и D:d хромосомы 2 (табл. 4).

Таблица 4.  

Частота рекомбинации между генами wv и d хромосомы 2 у гибридов томатов

Гибрид F1 Фенотипические классы F2 χ2 (3 : 1) rf, %
WvD Wvd wvD wvd Wv:wv D:d
S. lycopersicum ×
× S. lycopersicum var. cerasiforme
RecA 1 340 51 55 73 0.03 0.34 23.5
2 453 66 66 79 3.54 3.54 24.0
3 277 48 38 63 0.40 0.25 22.8
4 438 75 80 77 0.88 1.91 28.0
Всего 1508 240 239 292 3.51 3.34 24.6 ± 1.2
Контроль 1 394 57 63 80 0.27 1.19 23.5
2 234 29 45 58 1.93 0.30 22.4
3 326 36 55 74 0.42 1.77 21.0
Всего 954 122 163 212 0.55 3.04 22.3 ± 0.7
S. lycopersicum ×
× S. cheesmaniae
RecA 1 355 46 48 75 0.65 1.02 20.6
2 299 51 41 62 1.24 0 23.5
3 209 25 30 44 0.16 1.11 20.6
4 452 72 64 100 0.50 0 22.5
5 298 43 41 52 2.95 2.24 23.3
Всего 1613 237 224 333 4.44 2.23 22.1 ± 0.6
Контроль 1 207 27 21 32 6.53 3.02
2 68 11 6 12 2.15 0.09 21.0
Всего 68 11 6 12 8.68 2.72 21.0
S. lycopersicum ×
× S. pimpinellifolium
RecA 1 543 90 89 125 0.03 0.07 23.9
2** 573 66 89 109 0.81 7.48
3** 560 77 87 100 2.33 5.44
4** 428 71 78 76 0.69 2.16 27.5
Всего 971 161 167 201 0.17 0.60 25.7 ± 1.8
Контроль 1 649 115 103 130 1.41 0.09 25.1
2 563 122 121 139 3.18 3.45 24.1
3 413 52 65 82 0.32 3.12 22.5
4 484 70 72 133 1.64 1.24 20.1
Всего 2109 359 361 484 0.45 0.35 23.0 ± 1.1
S. lycopersicum ×
× S. lycopersicum
1 340 59 60 64 0.46 0.61 27.0
2 278 51 44 50 1.74 0.28 27.0
3 199 29 44 44 1.37 0.61 26.4
4 147 26 27 30 0.01 0.05 27.5
5 232 34 43 46 0 1.5 25.4
Всего 1196 199 218 234 0.27 2.39 26.7 ± 0.4

Примечание. Для p ≤ 0.05 и d.f. = 1 критическое значение χ2 = 3.84.

У трансгенных гибридов с S. lycopersicum var. cerasiforme и с S. cheesmaniae частота кроссинговера между генами wv и d составляла соответственно 24.6 и 22.1% и была выше, чем у их контрольных гибридов: соответственно 22.3 и 21.0%, однако эти различия не были статистически значимыми. У трансгенных и контрольных гибридов с S. pimpinellifolium частоты кроссинговера не различались и составляли соответственно 25.7 и 23.0%.

У межвидовых контрольных гибридов частоты кроссинговера были ниже, чем у линейных гибридов культурного томата, – 26.7%. Однако у гибридов с S. pimpinellifolium эти различия оказались незначимыми. Трансгенные гибриды с S. lycopersicum var. cerasiforme и с S. cheesmaniae также демонстрировали более низкие значения частот кроссинговера, чем гибриды культурного томата, однако только во втором случае различия были достоверны.

В целом наблюдали тенденцию, в соответствии с которой частота кроссинговера у трансгенных гибридов была выше, чем у контрольных гибридов аналогичной комбинации скрещивания, однако все же ниже, чем у линейных гибридов культурного томата.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе в качестве опылителей растений S. lycopersicum использовали дикорастущие виды, позволяющие получать с культурным томатом жизнеспособные, фертильные и самосовместимые межвидовые гибриды [24]. По степени убывания родства наиболее близким к культурному виду признана разновидность S. lycopersicum var. cerasiforme, затем виды S. cheesmaniae или S. pimpinellifolium и, наконец, S. habrochaites [6, 25]. При этом в зависимости от филогенетических критериев, S. pimpinellifolium и S. cheesmaniae могут по-разному располагаться относительно культурного томата. Использованные в данных экспериментах образцы S. pimpinellifolium в филогенетическом отношении, по-видимому, дальше от культурного томата, чем S. cheesmaniae, гибриды с которыми были более фертильны и плодовиты.

Полулетальный фенотип межвидовых гибридов с S. habrochaites var. glabratum и S. habrochaites являлся примером постзиготического репродуктивного барьера гибридной несовместимости локусов из разных видов томатов [7]. Сходство симптомов некроза у гибридов с S. habrochaites var. glabratum и у гибридов арабидопсиса [26] предполагает, что в формировании полулетального фенотипа в типичных для выращивания условиях принимает участие аутоиммунная ответная реакции типа хозяин–патоген. Ранее А.А. Жученко (старший) были получены жизнеспособные гибриды между линиями культурного томата Мо938, Марглоб и S. habrochaites var. glabratum (в г. Кишинев, Молдова, неопубл. результаты). Вероятно, в данных исследованиях полулетальный фенотип мог быть следствием присутствия в теплице микроорганизмов, провоцирующих у гибридов реакцию аутоиммунного некроза [26].

Менделевский характер сегрегации всех маркеров являлся индикатором отсутствия сильных негативных явлений во время мейоза, формирования пыльцы, опыления, оплодотворения и формирования семян у линейных гибридов и гибридов с наиболее близкородственной разновидностью S. lycopersicum var. cerasiforme (табл. 2). Снижение частот передачи гена recA, а также аллеля wv потомству гибридов с S. cheesmaniae и аллеля “отсутствие антоциана” потомству гибридов с S. pimpinellifolium сигнализировало о негативных взаимодействиях между аллелями из разных видов томатов, которые не имели заметного морфологического проявления у самих гибридов (табл. 2, 3). В отличие от гибридов с S. cheesmaniae, у которых наиболее существенные отклонения сегрегации были среди контрольного потомства, уменьшение примерно на треть частоты передачи аллеля “отсутствие антоциана” наблюдалось только среди потомства трансгенных гибридов с S. pimpinellifolium, созданных на основе растения культурного томата № 17/6 (табл. 2). В последнем случае, с учетом одновременной элиминации среди F2 около четверти трансгенных генотипов, можно предполагать, что к нарушению сегрегации маркера приводила инсерция Т-ДНК в участке генома, функционально значимом для наследования некоторых генов в потомстве гибридов с S. pimpinellifolium.

Ранее в потомстве гибридов (S. lycopersicum × × S. cheesmaniae) отмечено нарушение наследования более 50% ДНК-маркеров, специфичных для каждого вида, причем самые существенные искажения сегрегации были во второй и в третьей хромосомах [4]. В наших исследованиях примерно в 75% популяций F2 контрольных гибридов с S. cheesmaniae нарушения наследования были связаны с недостаточной передачей потомству главным образом рецессивных аллелей wv и d хромосомы 2 (рис. 2, табл. 2). Более выраженная элиминация wv, чем d, предполагает участие в негативных взаимодействиях участка хромосомы 2, расположенного ближе к wv и дальше от d. Нельзя исключать предположения, что сам аллель wv является участником негативных взаимодействий. Кроссинговер между wv и d частично компенсирует обусловленный сцеплением негативный отбор аллеля d. Экспрессия гена recA стабилизировала наследование wv и d, поскольку у 75% популяций F2 трансгенных гибридов наблюдалась их менделевская сегрегация (рис. 2). Это предположение подтверждается тем, что в остальных восьми из тридцати одной популяции нарушения преимущественно были обусловлены уменьшением передачи потомству только аллеля wv. Неполное восстановление сегрегации Wv:wv в потомстве трансгенных гибридов может быть связано с уменьшением частоты передачи потомству самого гена recA (табл. 3). Эти же результаты свидетельствуют о значимости гена recA для выживаемости рецессивных генотипов wvwv, поскольку среди них прежде всего подвергались элиминации нетрансгенные. В данном случае механизм влияния recA, по-видимому, не связан с изменением параметров кроссинговера, поскольку у трансгенных и контрольных гибридов его частоты сопоставимы (табл. 4). Однако конкурентоспособное превосходство одних генотипов над другими на этапах опыления и оплодотворения может приводить к отклонениям в передачи аллелей в расщепляющихся популяциях томатов [7].

Мутация wv у томатов проявляется в виде ярко-желтых молодых листьев, которые с возрастом становятся зелеными, давая основание предполагать наличие компенсирующих механизмов на более поздних этапах развития листьев, однако генетическая основа формирования мутантного фенотипа не известна. Схожий фенотип был описан у мутантов арабидопсиса с инсерцей Т-ДНК в гомологе recA – ядерном гене cpRecA, белковый продукт которого локализован в хлоропластах и необходим для поддержания целостности и стабильности генома незрелых пластид [27]. Возможно, мутации cprecA и wv затрагивают один и тот же метаболический путь, необходимый в растениях для согласованной работы ядерных и цитоплазматических генов в незрелых пластидах. У двудольных при прорастании вегетативной клетки пыльцы незрелые пластиды, как правило, разрушаются и их ДНК используется для обеспечения процессов роста и оплодотворения [28]. У межвидовых гибридов с S. cheesmaniae на фоне антагонизма некоторых родительских локусов мутация wv может снижать конкурентоспособность содержащей ее пыльцы, что подтверждается дефицитом среди потомства фенотипических классов wvD и wvd (рис. 3). Экспрессия гена recA частично компенсирует негативное воздействие wv на пыльцу, вероятно, путем проникновения белка RecA из цитоплазмы клеток в пластиды и стабилизации их генома. Не исключено, что сходный эффект мог обусловливать более высокий уровень фертильной пыльцы у трансгенных гибридов с S. pimpinellifolium, хотя он не затронул их плодовитость и семенную продуктивность.

Более низкая частота кроссинговера между генами wv и d у межвидовых контрольных гибридов, по сравнению с гибридами культурного томата (табл. 4), подтверждает, что обменов между хромосомами разных видов меньше, чем между хромосомами одного вида. В наших исследованиях не обнаружено явной зависимости частоты кроссинговера от филогенетических отношений видов томатов, что, вероятно, связано с использованием для оценки кроссинговера только части потомства гибридов с S. cheesmaniae и с S. pimpinellifolium. В отличие от ранее полученных результатов у гибридов культурного томата [17], у межвидовых трансгенных гибридов частота кроссинговера не была значимо выше, чем в соответствующем контроле. Ограничителем кроссинговера между гомеологичными последовательностями является система ММР, устраняющая при репарации ДЦР ошибочно спаренные основания в ДНК [19, 29]. У межвидовых гибридов томатов из-за повышенного уровня полиморфизма ДНК между гомеологичными хромосомами стоит ожидать более активное противодействие ММР кроссинговеру, чем у линейных гибридов. Следствием этого может быть то, что белка RecA уже может быть недостаточно для достоверного увеличения частоты кроссинговера. Сочетание эффективных методов подавления ММР и высокоуровневой экспрессии гена recA или его более эффективных аналогов позволит добиться наибольшего увеличения кроссинговера между гомеологами. Однако стоит учесть, что разрушение гена MSH2 у A. thaliana одновременно приводит к нестабильности генома и накоплению мутаций у потомства [30].

В целом не отмечено значимого изменения кроссинговера между генами wv и d хромосомы 2 в зависимости от уровня экспрессии гена recA у межвидовых гибридов. Это однозначно подтверждают значения rf у гибридов комбинации S. lycopersicum × S. pimpinellifolium (табл. 4), достоверно различающихся по уровню экспрессии трансгена (рис. 1). Возможно, это обусловлено тем, что уровень экспрессии целевого гена в листьях растений не обязательно свидетельствовал о его пропорциональной экспрессии в генеративных клетках растений в момент формирования гамет, несмотря на использование сильного и конститутивного промотора CaMV35S. Однако даже невысокой экспрессии recA оказалось достаточно для изменения характера сегрегации аллелей в локусах Wv:wv и D:d гибридов с S. cheesmaniae.

Работа выполнена при поддержке средств государственного задания № 0574-2015-0005 (государственная регистрация № АААА-А17-117082950008-7).

Список литературы

  1. Rick C.M. Tomato, Lycopersicon esculentum (Solanaceae) // Evolution of Crop Plants. 2nd ed. / Eds Simmonds J., Smarttand N.W. L.: Longman, 1995. P. 452–457.

  2. Chetelat R.T., Meglic V., Cisneros P. A genetic map of tomato based on BC1 Lycopersicon esculentum × Solanum lycopersicoides reveals overall synteny but suppressed recombination between these homeologous genomes // Genetics. 2000. V. 154. № 2. P. 857–867.

  3. Chetelat R.T., Ji Y. Cytogenetics and evolution // Genetic Improvement of Solanaceous Crops / Eds Razdan M.K., Mattoo A.K. Enfield: Science Publ., 2007. V. 1. P. 77–112.

  4. Paterson A.H., Damon S., Hewitt J.D. et al. Mendelian factors underlying quantitative traitisn tomato: Comparison across species, generations, and environments // Genetics. 1991. V. 127. P. 181–197.

  5. Canady M.A., Ji Y., Chetelat R.T. Homeologous recombination in Solanum lycopersicoides introgression lines of cultivated tomato // Genetics. 2006. V. 174. P. 1775–1788. doi 10.1534/genetics.106.065144

  6. Bedinger P.A., Chetelat R.T., McClure B. et al. Interspecific reproductive barriers in the tomato clade: opportunities to decipher mechanisms of reproductive isolation // Sex Plant Reprod. 2011. V. 24. № 3. P. 171–187. doi 10.1007/s00497-010-0155-7

  7. Moyle L.C., Nakazato T. Complex epistasis for Dobzhansky–Muller hybrid incompatibility in solanum // Genetics. 2009. V. 181. № 1. P. 347–351. doi 10.1534/ genetics.108.095679

  8. Shinohara A., Shinohara M. Roles of RecA homologues Rad51 and Dmc1 during meiotic recombination // Cytogenet. Genome Res. 2004. V. 107. № 3–4. P. 201–207. doi 10.1159/000080598

  9. Li W., Chen C., Markmann-Mulisch U. et al. The Arabidopsis AtRAD51 gene is dispensable for vegetative development but required for meiosis // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. № 29. P. 10596–10601. doi 10.1073/pnas.0404110101

  10. Couteau F., Belzile F., Horlow C. et al. Random chromosome segregation without meiotic arrest in both male and female meiocytes of a dmc1 mutant of Arabidopsis // Plant Cell. 1999. V. 11. № 9. P. 1623–1634. https://doi.org/ 10.1105/tpc.11.9.1623.

  11. Kurzbauer M.T., Uanschou C., Chen D., Schlögelhofer P. The recombinases DMC1 and RAD51 are functionally and spatially separated during meiosis in Arabidopsis // Plant Cell. 2012. V. 24. № 5. P. 2058–2070. doi 10.1105/tpc.112.098459

  12. Da Ines O., Degroote F., Goubely C. et al. Meiotic recombination in Arabidopsis is catalysed by DMC1, with RAD51 playing a supporting role // PLoS Genet. 2013. № 9. doi 10.1371/journal.pgen.1003787

  13. Reiss B., Klemm M., Kosak H., Schell J. RecA protein stimulates homologous recombination in plants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 7. P. 3094–3098.

  14. Reiss B., Schubert I., Kopchen K. et al. RecA stimulates sister chromatid exchange and the fidelity of double-strand break repair, but not gene targeting, in plants transformed by Agrobacterium // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 7. P. 3358–3363. doi 10.1073/ pnas.050582797

  15. Комахин Р.А., Комахина В.В., Жученко А.А. Создание генетических конструкций, содержащих бактериальный ген recA E. coli, для индукции рекомбинации в растениях // С.-х. биол. 2007. № 3. С. 25–32.

  16. Комахин Р.А., Комахина В.В., Милюкова Н.А. и др. Трансгенные растения томата, экспрессирующие гены recA и NLS-recA-licBM3, как модель для изучения мейотической рекомбинации // Генетика. 2010. Т. 46. № 12. С. 1635–1644.

  17. Комахин Р.А., Комахина В.В., Милюкова Н.А., Жученко А.А. Анализ частоты мейотической рекомбинации у трансгенных гибридов томата, экспрессирующих гены recA и NLS-recA-licBM3 // Генетика. 2012. Т. 48. № 1. С. 30–39.

  18. Hunter N., Chambers S.R., Louis E.J., Borts R.H. The mismatch repair system contributes to meiotic sterility in an interspecific yeast hybrid // EMBO J. 1996. V. 15. № 7. P. 1726–1733.

  19. Emmanuel E., Yehuda E., Melamed-Bessudo C. et al. The role of AtMSH2 in homologous recombination in Arabidopsis thaliana // EMBO Rep. 2006. V. 7. № 1. P. 100–105. doi 10.1038/sj.embor.7400577

  20. Tam S.M., Hays J.B., Chetelat R.T. Effects of suppressing the DNA mismatch repair system on homeologous recombination in tomato // Theor. Appl. Genet. 2011. V. 123. № 8. P. 1445–1458. doi 10.1007/s00122-011-1679-4

  21. Комахин Р.А., Стрельникова С.Р., Жученко А.А. Генетические особенности маркерной линии культурного томата Мо938 // Генетика. 2019. Т. 55. № 1, С. 60–69. doi 10.1134/S1022795419010083

  22. Орлова Н.Н. Генетический анализ. М.: Изд-во МГУ, 1991. 316 с.

  23. Muller P.Y., Janovjak H., Miserez A.R., Dobbie Z. Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RT-PCR // Biotechniques. 2002. № 32. P. 1372–1374, 1376, 1378–1379.

  24. Mutschler M., Liedl B. Interspecific crossing barriers in Lycopersicon and their relationship to self-incompatibility // Genetic Control of Self-Incompatibility and Reproductive Development in Flowering Plants / Ed. Williams E. Netherlands: Kluwer Acad., 1994. P. 164–188.

  25. Moyle L.C. Ecological and evolutionary genomics in the wild tomatoes (Solanum sect. Lycopersicon) // Evolution. 2008. V. 62. P. 2995–3013. doi 10.1111/ j.1558-5646.2008.00487.x

  26. Bomblies K., Lempe J., Epple P. et al. Autoimmune response as a mechanism for a Dobzhansky-Muller-type incompatibility syndrome in plants // PLoS Biol. 2007. V. 5. e236. doi 10.1371/journal.pbio.0050236

  27. Rowan B.A., Oldenburg D.J., Bendich A.J. RecA maintains the integrity of chloroplast DNA molecules in Arabidopsis // J. Exptl Bot. 2010. V. 61. № 5. P. 2575–2588. doi 10.1093/jxb/erq088

  28. Tang L.Y., Sakamoto W. Tissue-specific organelle DNA degradation mediated by DPD1 exonuclease // Plant Signal Behav. 2011. V. 6. № 9. P. 1391–1393. doi 10.4161/psb.6.9.16595

  29. Chambers S.R., Hunter N., Louis E.J., Borts R.H. The mismatch repair system reduces meiotic homeologous recombination and stimulates recombination-dependent chromosome loss // Mol. Cell Biol. 1996. V. 16. № 11. P. 6110–6120.

  30. Hoffman P.D., Leonard J.M., Lindberg G.E. et al. Rapid accumulation of mutations during seed-to-seed propagation of mismatch-repair-defective Arabidopsis // Genes Dev. 2004. V. 18. № 21. P. 2676–2685.

Дополнительные материалы отсутствуют.