Генетика, 2019, T. 55, № 5, стр. 604-608
Митохондриальные геномы хересных штаммов дрожжей характеризуются низкой генетической вариабельностью
М. А. Эльдаров 1, А. В. Белецкий 1, Н. В. Равин 1, А. В. Марданов 1, *
1 Институт биоинженерии, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия
* E-mail: mardanov@biengi.ac.ru
Поступила в редакцию 25.05.2018
После доработки 12.07.2018
Принята к публикации 23.07.2018
Аннотация
Высокие концентрации этанола и окислительный стресс у хересных штаммов дрожжей могут оказывать мутагенное действие на их митохондриальные геномы (мтДНК). Проведен сравнительный анализ мтДНК винных и трех просеквенированных нами хересных штаммов дрожжей. МтДНК хересных штаммов отличаются высокой консервативностью нуклеотидных последовательностей и структуры. Число дестабилизирующих элементов мтДНК – GC-кластеров, коротких повторов, активных ori-участков у хересных штаммов в целом ниже, чем у винных. Консервативность мтДНК хересных штаммов может определяться как эффектами “бутылочного горлышка” в ходе эволюции, так и механизмами, направленными на поддержание генетической стабильности. В целом полученные данные не подтверждают гипотезу о повышенной генетической изменчивости митохондриальных геномов хересных штаммов дрожжей.
Хересные дрожжи – специализированная группа штаммов Saccharomyces cerevisiae, используемая для получения биологически выдержанных вин [1]. Особенностью хересных дрожжей является их способность образовывать пленку на поверхности крепленого сброженного субстрата, при этом их метаболизм переключается с ферментативного на окислительный и образуются специфические для хересных вин ароматические соединения [1]. Физиологические и биохимические свойства хересных и винных штаммов весьма различны. Такие черты хересных дрожжей, как способность к пленкообразованию, устойчивость к высоким концентрациям этанола и ацетальдегида, оксидативному стрессу являются результатом адаптации и селекции [2]. Филогенетически хересные дрожжи представляют компактную группу, дочернюю по отношению к кладе винных штаммов [2].
Ядерные геномы хересных штаммов исследованы на уровне полиморфизма и вариабельности числа копий отдельных локусов [3] и в самое последнее время – методами сравнительной геномики [4, 5]. При сравнении геномов хересных и винных штаммов были выявлены полиморфные аллели, идентифицированы геномные локусы и регуляторные сети, потенциально связанные с адаптацией хересных штаммов к специфическим условиям роста [4].
Особенности митохондриальных ДНК (мтДНК) хересных штаммов дрожжей исследованы меньше. Было выдвинуто предположение, что их мтДНК отличается повышенной вариабельностью за счет мутагенного действия высоких концентраций этанола (15% и выше) и ацетальдегида [6]. Также было показано, что перенос мтДНК хересного штамма в лабораторный штамм S. cerevisiae способен индуцировать у него повышенную устойчивость к этанолу, что указывает на наличие специфических адаптивных отличий в мтДНК хересных дрожжей [7].
Со времени расшифровки мтДНК референсного штамма S. cerevisiae [8] возможности сравнительной митогеномики дрожжей значительно расширились благодаря прогрессу технологий полногеномного секвенирования [9]. Анализ 100 расшифрованных митогеномов S. cerevisiae выявил специфические особенности мтДНК у отдельных географических популяций, различия в содержании интронов и мобильных элементов, сопоставил тенденции эволюции ядерных и митохондриальных геномов [10].
Ранее мы просеквенировали мтДНК трех штаммов хересных дрожжей из коллекции ВННИИВиВ “Магарач” [11]. Задача настоящей работы – сравнительный анализ митохондриальных геномов хересных и винных штаммов дрожжей.
Для сравнительного анализа использовали последовательности мтДНК хересных и винных штаммов (табл. 1). Дополнительно для оценки полиморфизма митохондриальных генов использовали первичные данные секвенирования геномов хересных дрожжей из базы SRA NCBI (ERR560552, ERR560553, ERR560548, ERR560540, ERR560546, ERS485776, ERR560549). Короткие чтения очищали с помощью Sickle 1.33 [12] и затем собирали в контиги с помощью SPAdes. Для множественного выравнивания применяли программы MAFFT v. 7 [13] и multi-LAGAN [14]. Для поиска GC-кластеров использовали программу FIMO [15] и описанные ранее последовательности элементов отдельных классов [10]. Для поисков вариантов участков ori использовали программу MCAST поиска повторов – сервер REPuter [16]. Для анализа полиморфизма последовательностей мтДНК использовали пакет программ DnaSP 6 [17]; для построения блочных диаграмм – приложение BoxPlotR (http://shiny.chemgrid.org/boxplotr/). Сравнение последовательностей генов cox1 и соb проводили с помощью BLASTN.
Таблица 1.
Штамм | Номер в GenBank | Длина мтДНК, пн | Кодирующие участки, %1 | GC, % | Вариабельность | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
весь митогеном | гены митобелков и рРНК2 | ||||||||||
S | Si | π | S | Si | π | ||||||
Хересные | I-30 | MG269479 | 87 571 | 21.66 | 15.7 | 620 | 4707 | 0.00431 | 41 | 10 | 0.00198 |
I-329 | MG269481 | 80 204 | 19.94 | 15.5 | |||||||
I-566 | MG269480 | 80 886 | 19.69 | 15.7 | |||||||
YJM270 | CP006479 | 82 331 | 16.94 | 15.7 | |||||||
Винные | YJM453 | CP006486 | 82 494 | 20.50 | 16.2 | 3145 | 10 432 | 0.02538 | 91 | 182 | 0.00456 |
YJM975 | CP006500 | 78 950 | 17.64 | 16.1 | |||||||
YJM1244 | CP006516 | 83 285 | 21.50 | 16.2 | |||||||
YJM1450 | CP006553 | 76 603 | 17.12 | 15.1 |
Примечание. S – число сегрегирующих сайтов, Si – число сайтов инделей, π – нуклеотидное разнообразие [20]. 1 Включают ОРС (в том числе интронные), рРНК, тРНК, rnpS. 2 atp6, atp8, atp9, cox1, cox2, cox3, cob, rns, rnl.
Митохондриальные геномы хересных и винных штаммов близки по размеру, GC-составу, доле кодирующих участков (табл. 1). Все расшифрованные митогеномы хересных штаммов кодируют специфичный для S. cerevisiae набор митобелков и РНК – три субъединицы цитохромоксидазы (cox1, cox2, cox3), цитохром b (cob), три субъединицы АТФазы (atp8, atp6, atp9), один белок и две РНК митохондральных рибосом (rps3, rns, rnl), 24 тРНК и РНК-субъединицу РНКазы Р. Порядок генов в митогеномах хересных штаммов такой же, как и в мтДНК референсного штамма S. cerevisiae S288C, и прерывается лишь несинтенными инсерциями открытых рамок считывания (ОРС) эндонуклеаз/матураз семейства LADLIDAG (рис. 1,а).
Сравнительный анализ мтДНК хересных и винных штаммов указывает на более высокую степень консерватизма геномов хересных штаммов по сравнению с винными (табл. 1), выявляет участки повышенной изменчивости, различные инсерции и делеции (рис. 1,а). В мтДНК хересных штаммов интроны локализованы исключительно в генах cox1 и cob1, причем набор интронов и сайты их интеграции идентичны. В интронах гена cox1 локализованы три ОРС, кодирующие эндонуклеазы и матуразы (рис. 1,б). Такой “хересный” вариант гена cox1 встречается еще только у двух из более чем 160 секвенированных мтДНК дрожжей (штаммы Yjm1526 и Yjm1249).
Для оценки характера возможного действия отбора сравнивали последовательности белок-кодирующих генов в мтДНК у хересных штаммов, используя как полногеномные данные, так и данные первичного секвенирования. Информативность подхода в целом оказалась невысока из-за низкой вариабельности последовательностей. Число полиморфных сайтов для atp6, atp8, atp9, cob1 составило 0–2, для cox1, cox2, cox3 – 6–11. Значение критерия D Таджимы оказалось отрицательным, но статистически незначимым для всех последовательностей, кроме cox1. Для cox1 значение критерия D составило –1.31 при значении P < 0.001, что свидетельствует о вероятном действии стабилизирующего отбора на данный локус.
Предыдущие исследования структурной организации мтДНК сахаромицетов выявили внутри- и межвидовые различия в представленности таких генетических элементов, как прямые и инвертированные повторы, GC-кластеры, участки начала репликации [10, 18]. Мобильные GC-кластеры являются важным источником инсерционно-делеционного полиморфизма мтДНК дрожжей. Эти последовательности длиной 30–80 нуклеотидов разделяют на семь классов [10, 18], в сумме число их копий ∼120 на геном. Наиболее представленными у хересных и винных штаммов оказались элементы классов М1 и М2 (рис. 1,в), при этом частота элементов почти всех классов у хересных штаммов ниже.
Другой известный источник генетической нестабильности мтДНК дрожжей – короткие прямые и инвертированные повторы. В митогеномах хересных штаммов оказалось снижено число коротких повторов размером 30–40 и 41–60 пн (рис. 1,в).
Предполагаемые участки начала репликации у S. cerevisiae определяются набором трех регулярно расположенных консенсусных мотивов GGGGGAGGGGGTGGGTGAT, GGGTCCC и GGGACCC, разделенных двумя АТ-богатыми участками размером около 200 пн. Эти локусы размером порядка 270 пн располагаются сразу после 20 пн промоторного участка [19], причем некоторые из ori-элементов у штамма S288C инактивированы вследствие инсерции GC-элемента в промотор [18]. У винных штаммов мы обнаружили в среднем шесть потенциально “активных” и 5.25 “инактивированных” ori на митогеном, для хересных штаммов это соотношение 4.8 и 7.5 соответственно. Поскольку наличие активных ori является условием накопления дефектных укороченных молекул мтДНК, можно предполагать, что снижение числа активных ori у хересных штаммов может являться одним из факторов повышения стабильности их митогеномов [9].
Консервативность последовательностей белок-кодирующих генов и экзон-интронной структуры генов cox1 и cob1 у хересных штаммов может определяться как эффектами “бутылочного горлышка” в ходе эволюции, так и механизмами, направленными на поддержание генетической стабильности мтДНК [9]. Сходные механизмы могут объяснять наблюдаемое у хересных штаммов снижение числа дестабилизирующих элементов митогеномов, GC-кластеров, коротких повторов, активных ori-участков.
Таким образом, полученные данные не подтверждают ранние гипотезы о повышенной генетической изменчивости митохондриальных геномов хересных штаммов дрожжей.
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект 16-16-00109).
Список литературы
Alexandre H. Flor yeasts of Saccharomyces cerevisiae – Their ecology, genetics and metabolism // Int. J. Food Microbiol. 2013. V. 167. № 2. P. 269–275.
Legras J.L., Moreno-Garcia J., Zara S. et al. Flor Yeast: New perspectives beyond wine aging // Front. Microbiol. 2016. V. 7. P. 503.
Legras J.L., Erny C., Charpentier C. Population structure and comparative genome hybridization of European flor yeast reveal a unique group of Saccharomyces cerevisiae strains with few gene duplications in their genome // PLoS One. 2014. V. 9. № 10. P. e108089.
Coi A.L., Bigey F., Mallet S. et al. Genomic signatures of adaptation to wine biological ageing conditions in biofilm-forming flor yeasts // Mol. Ecol. 2017. V. 26. № 7. P. 2150–2166.
Eldarov M.A., Beletsky A.V., Tanashchuk T.N. et al. Whole-genome analysis of three yeast strains used for production of sherry-like wines revealed genetic traits specific to flor yeasts // Front. Microbiol. 2018. V. 9. P. 965.
Castrejón F., Codón A.C., Cubero B. et al. Acetaldehyde and ethanol are responsible for mitochondrial DNA (mtDNA) restriction fragment length polymorphism (RFLP) in flor yeasts // Syst. Appl. Microbiol. 2002. V. 25. № 3. P. 462–467.
Ibeas J.I., Jimenez J. Mitochondrial DNA loss caused by ethanol in Saccharomyces flor yeasts // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. № 1. P. 7–12.
Foury F., Roganti T., Lecrenier N., Purnelle B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae // FEBS Lett. 1998. V. 440. № 3. P. 325–331.
Freel K.C., Friedrich A., Schacherer J. Mitochondrial genome evolution in yeasts: an all-encompassing view // FEMS Yeast Res. 2015. V. 15. № 4. fov023.
Wolters J.F., Chiu K., Fiumera H.L. Population structure of mitochondrial genomes in Saccharomyces cerevisiae // BMC Genomics. 2015. V. 16. № 1. P. 451.
Mardanov A.V., Beletsky A.V., Eldarov M.A. et al. Complete mitochondrial genomes of three Saccharomyces cerevisiae flor strains // Mitochondrial DNA Part B: Resources. 2017. V. 2. № 2. P. 849–850.
Joshi N.A., Fass J.N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files: Version 1.33 (Software). 2011.
Katoh K., Standley D.M. MAFFT: Iterative refinement and additional methods // Methods Mol. Biol. 2014. V. 1079. P. 131–146.
Brudno M., Do C.B., Cooper G.M. et al. LAGAN and multi-LAGAN: efficient tools for large-scale multiple alignment of genomic DNA // Genome Res. 2003. V. 13. № 4. P. 721–731.
Bailey T.L., Boden M., Buske F.A. et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching // Nucl. Acids Res. 2009. V. 37. P. W202–W208.
Kurtz S. REPuter: the manifold applications of repeat analysis on a genomic scale // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. № 22. P. 4633–4642.
Librado P., Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data // Bioinformatics. 2009. V. 25. № 11. P. 1451–1452.
Sulo P., Szabóová D., Bielik P. et al. The evolutionary history of Saccharomyces species inferred from completed mitochondrial genomes and revision in the “yeast mitochondrial genetic code” // DNA Res. 2017. V. 24. № 6. P. 571–583.
Turk E.M., Das V., Seibert R.D., Andrulis E.D. The mitochondrial RNA landscape of Saccharomyces cerevisiae // PLoS One. 2013. V. 8. № 10. P. e78105.
Nei M., Li W.H., Li W.-H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. № 10. P. 5269–5273.
Дополнительные материалы отсутствуют.