Генетика, 2019, T. 55, № 7, стр. 798-810

Характеристика ТП in silico и их картирование на метафазных хромосомах

Для поиска ТП использовали сборку генома свиньи S. scrofa (Sscrofa10.2). Значение метрики N50 контигов показывает наибольшую длину контига N, такую, что сумма длин контигов ≥N дает не менее 50% длины сборки. Величина метрики N50 и ее применимость для оценки качества сборки зависят в первую очередь от размера генома, и для геномов близких размеров значение N50 вполне может использоваться для сравнения качества сборок [15]. В базе данных значение N50 для контигов Sscrofa10.2 составляет 69 474 пн. Эта же метрика N50 для сборок генома человека и мыши на порядок выше. Сборка Sscrofa10.2 является наиболее законченной сборкой по сравнению с другими сборками свиньи. В табл. 2 приведены обнаруженные ТП в убывающем порядке по значению содержания ТП в геноме.

Хромосомный набор у свиньи состоит из 18 пар аутосом (12 пар Мс-хромосом и 6 пар Ас-хромосом) и двух половых хромосом (Х и Y) [16]. Окрашивание флуорохромами показало, что центромеры всех Ас-хромосом ярко окрашиваются DAPI (обогащены АТ-парами оснований ДНК), а Мс-хромосомы окрашиваются хромомицином А3 (обогащены ГЦ-парами ДНК) [17]. Молекулярно-цитогенетическими методами на Мс-хромосомах (1–12) и Х-хромосоме было выявлено Мс1-семейство сатДНК, а на Ас-хромосомах (13–18) – семейство Ас2 [18]. Эти описанные два мажорных семейства сатДНК были обнаружены после рестрикции тотальной ДНК и последующего клонирования и картирования фрагментов Мс1 и Ас2 [18]. Mc1 соответствует SSAT_A и SSAT_B по базе Repbase и Sscrf_335A по табл. 2, в которой названия ТП приведены в соответствии с нашей номенклатурой. Ac2 соответствует SSRS2 по Repbase и Sscrf_15А по табл. 2. Найденное ранее подсемейство Мс2 соответствует Ssat-1_Ssc, которое находится в геномной сборке на хромосомах 1, 2, 4, 5, 8, 9, 11; соответствует Sscrf_50A – в табл. 2. Клонированный повтор MSAT-1_SSc считают специфичным для хромосомы 11 [19] (Sscrf_38A в табл. 2). В литературе для Мс-хромосом описаны еще несколько семейств сатДНК [20, 21]. Праймеры на основе Мс1 и Ас2 использовали для мечения центромер соответствующих групп хромосом in situ методом PRINS [22]. Эти сатДНК заложены в базу данных повторов Repbase [21, 23]. Из космиды был клонирован фрагмент размером ~3 тпн, который оказался специфичным для хромосомы 9 [21]. Хромосомная специфичность достигается за счет повторов высшего порядка (HOR, high order repeats) и зонд должен быть длинным. Для мажорных ТП неудивительно наличие HOR и соответственно хромосом-специфичных вариантов [2].

Все ТП у свиньи, присутствующие в Repbase, выявляются методом, который используется в нашей лаборатории, но кроме них найдено еще 30 новых семейств ТП в сборке Sscrofa10.2. Таким образом, найдены отсутствующие в Repbase новые ТП, которые не описаны и не картированы. По набору найденных ТП свинья отличается от человека и мыши бóльшей длиной мономеров [24].

Самым представленным повтором в геномной сборке Sscrofa10.2 является семейство Sscrf_15A. Его значительно больше (~0.6%), чем остальных семейств ТП. Это семейство ТП имеет высокую степень сходства с клонированным прицентромерным повтором SSRS2. Следующее семейство по представленности в ридах – семейство ТП Sscrf_335A (69 полей в сборке Sscrofa10.2). Это семейство обладает сходством с клонированным ранее центромерным повтором SSAT [21]. Клонированный повтор локализовали на центромере хромосомы 9, что предполагает его хромосомную специфичность за счет HOR-структуры [21], однако in silico мы нашли его на бóльшем числе хромосом (табл. 2).

Из вновь выявленных повторов мы выбрали повтор Sscrf_243А, относительно богатый по содержанию GC (59%), не имеющий сходства с диспергированными повторами, но с возможной хромосомной специфичностью, определенной in silico на 5-й хромосоме.

Подсемейство Mc2 (SAT-1_SSc по Repbase и Sscrf_50A по табл. 2) было определено как специфичное для хромосомы 11 и дающее более слабый сигнал в центромерных районах других Мс-хромосом [19]. Поиск по геномной сборке in silico показал, что семейство Sscrf_50A присутствует на Мс-хромосомах 1, 2, 4, 5, 8, 9 и 11, хотя не на всех. In silico это семейство не обнаружено на хромосомах 3, 6, 7, 10 и 12. Семейство Sscrf_50A богато содержанием GC (65%). Это семейство имеет относительно высокое содержание в геноме (табл. 2). Для 11-й хромосомы in silico найдено специфичное для нее семейство ТП (Sscrf_38A), которое имеет одно поле. Это семейство присутствует в базе данных Repbase и обозначено MSAT-1_SSc (табл. 2).

In silico обнаружено много (31) семейств ТП, присутствующих только на одной хромосоме (табл. 2). Семейств ТП, локализующихся исключительно на одной хромосоме in silico, нет всего у четырех хромосом – у двух маленьких Ас-хромосом (16 и 17), Y-хромосомы и хромосомы 3. На Y‑хромосоме не удалось обнаружить ни одного семейства больших ТП. Данные FISH на метафазных хромосомах показывают, что из использованных зондов, обнаруженных в геномной сборке на одной или нескольких хромосомах, два (Sscrf_15A и Sscrf_243A) гибридизовались в центромерном районе Ас-хромосом, один (Sscrf_335А) – на всех хромосомах и один (Sscrf_50A) – на Мс-хромосомах (рис. 1). Таким образом, данные in silico недостаточны для предсказания позиций зонда и обязательно нуждаются в экспериментальной проверке.

Рис. 1.

Гибридизация зондов (приведены на каждой панели) на метафазных пластинках лимфоцитов свиньи. Зонд 15A дает сигналы на Ас-хромосомах, зонд 335A дает сигналы на всех хромосомах, хотя и с разной интенсивностью. 50A дает сигналы на Мс-хромосомах; зонд 243A дает сильные сигналы на Ас-хромосомах, есть более слабые сигналы на некоторых Мс-хромосомах, например на 5-й. Отмечены хромосомы 5 и 11. Масштабный отрезок 10 мкм.

Центромерный ТП для свиньи не известен. В процессе анализа мы нашли повтор Sscrf_1985A, хорошо представленный в сборке и сходный с SSRS1 (табл. 2). Повтор SSRS1 по классификации Repbase не относится к сатДНК (ТП), но специфичен для Y-хромосомы. Повтор SSRS1 длиной 3832 пн выравнивается практически по всему полю повтора Sscrf_1985A (на хромосоме 18 поле этого ТП составляет 13517 пн, а на некартированном скэффолде – 9695 пн) с невысокой степенью идентичности (около 67%). Вероятно, несмотря на известную уникальную структуру ТП половых хромосом [25], этот ТП ошибочно принимали за повтор, специфичный для Y-хромосомы. Sscrf_1985A может оказаться вариантом центромерного ТП, специфичного для Y-хромосомы, подобно Y-хромосомному варианту минорного центромерного сателлита мыши [26]. До экспериментальной проверки предположения мы считаем использованные в настоящей работе зонды для ТП прицентромерными.

ТП в клетках сперматогенного ряда

Для гибридизации с ДНК клеток сперматогенного ряда мы использовали четыре зонда (Sscrf_15A, Sscrf_335A, Sscrf_50A, Sscrf_243A). Теломерный зонд дает 6—16 сигналов на ядро, что говорит об ассоциации хромосом в сперматозоидах [9]. Зонд Sscrf_335А (для всех хромосом) дает тот же порядок числа сигналов. В предельном случае они слиты вместе в центре ядра в хромоцентр, но чаще распадаются на 6–10 отдельных сигналов. Группа сигналов регулярно находится в нижней части ядра (рис. 2, зонд Sscrf_335А, ряд sp). Число сигналов в сперматозоидах зависит от природы зонда, специфичного для определенного подтипа хромосом. Ас-центромеры сливаются преимущественно в один или два хромоцентра (рис. 2, зонды Sscrf_15А и Sscrf_243А, ряд sp), тогда как Мс-центромеры ассоциируют в меньшие и более многочисленные кластеры (рис. 2, зонд Sscrf_50А, ряд sp).

Рис. 2.

Гибридизация (FISH) клеток сперматогенного ряда с зондами ТП, указанными на каждой панели. SI – ядра сперматоцитов 1-го порядка (профаза 1-го деления мейоза), SII – ядра сперматоцитов 2-го порядка, sp – сперматозоиды. Масштабный отрезок для всех изображений 10 мкм. ДНК окрашена DAPI (синий), зонд красный.

Зонды Sscrf_15А и Sscrf_243А (Ас) дают сходную картину – обширный сигнал на середине ядра (рис. 2, зонды Sscrf_15А и Sscrf_243А, ряд sp). Второй сигнал в верхней части ядра при использовании зонда Sscrf_243А, видимо, принадлежит Мс-хромосомам, которые выявляются этим зондом на метафазных пластинках (рис. 1, зонд Sscrf_243А). Если на метафазной пластинке зонд Sscrf_50А выявляет семь пар Мс-хромосом, то в сперматозоидах – четыре ярких сигнала в области экватора и два сигнала в верхней и нижней частях ядра, т.е. в среднем по одному сигналу на одну центромеру. Результаты FISH в целом совпадают с данными, опубликованными другими авторами [9].

Стадии сперматогенеза в процессе мейотического деления использовали, чтобы проследить, как образуется укладка хроматина сперматозоида (рис. 3, зонд Sscrf_335А). Сигнал зондов часто наблюдали в виде кольца, особенно у сперматоцитов I порядка. Кольцевые структуры наблюдали со всеми использованными зондами (рис. 2, Sscrf_15А, Sscrf_50А и Sscrf_243А; рис. 3). Кольца расположены в районах, сравнительно слабо окрашенных DAPI. Кольца могут быть результатом объединения центромер разных хромосом, а могут принадлежать каждой отдельной хромосоме. Чтобы проверить эти предположения, мы учитывали число сигналов в сперматоцитах и сперматозоидах по отношению к числу сигналов на метафазных пластинках (табл. 3). Число сигналов варьирует в зависимости от эффективности гибридизации, и слабые сигналы проявляются не регулярно, а общий результат числа сигналов не дает возможности отдать полное предпочтение какой-либо из двух гипотез, однако не исключает возможности того, что мы наблюдаем именно сборку отдельных центромер (табл. 3, рис. 4).

Рис. 3.

Центромеры на разных стадиях укладки, гибридизация с зондом 335А. SI – сперматоциты 1-го порядка, SII – сперматоциты 2-го порядка, sp – сперматозоиды. 1 – профаза 1-го митоза, пахитена; 2 – профаза 2-го мейоза; 3 – ряд сперматид; 4 – сперматозоиды. На панели 2 и 3 приведено черно-белое изображение хроматина ядер (окраска DAPI). Зонд к Sscrf_335A.

Рис. 4.

Кольцевые структуры, характерные для клеток SI сперматогенного ряда. Зонды указаны на каждой панели. Масштабный отрезок 1 мкм.

Число сигналов в сперматоцитах 1-го порядка в среднем в 2 раза меньше, чем таковое для метафазных пластинок. Сигналы Ас-хромосом (зонды Sscrf_15А и Sscrf_243А) проявляют большую тенденцию к слиянию, чем сигналы Мс-хромосом (зонд Sscrf_50А). Можно думать, что в профазе 1-го деления мейоза (2n) мы наблюдаем сигналы отдельных хромосом (рис. 2, ряд SI), а кольцо отражает образование центромеры одной хромосомы.

Центромеры в виде двух параллельных линий (рис. 4,в''', г', г''') наблюдали при иммунофлуоресценции [27], однако изображений кольцевых образований на мейотических хромосомах нам не удалось найти в доступной литературе. Двойные кольца (рис. 4,в, а', а'') мы наблюдали чаще на стадии пахитены. Стадию пахитены определяли по морфологическим критериям состояния хроматина, когда уже произошло сближение гомологов [28]. Полагаем, что наш набор зондов, расположенных в прицентромерных районах, позволяет проследить как образование отдельных центромер, так и объединение гомологичных бивалентов.

Организация хромосом при сперматогенезе

Организация хроматина в сперматозоидах кардинально отличается от соматических клеток, хотя слияние центромер хромосом в хромоцентрах можно наблюдать и в специализированных клетках (рис. 5). Литературные данные работ, сделанных на сперматозоидах разных видов, свидетельствуют о том, что хромосомные территории различимы в сперматозоидах и организованы неслучайным образом [4, 8]. Достигнут значительный прогресс в понимании важности организации ядра сперматозоида; известно, что нарушение этой организации ведет к нарушениям развития зиготы и снижает фертильность. В отношении клеток человека (как максимально изученного вида) пришли к выводу, что организация хромосомных территорий в лимфоцитах и сперматозоидах сходна и зависит от величины хромосомы и плотности генов в ней [30].

Рис. 5.

Объединение центромер Ас-хромосом в интерфазных специализированных клетках (клетках Сертоли). В присутствии сигнала на семи парах хромосом на метафазной пластине всегда выделяются четыре хромоцентра, но не во всех хромоцентрах присутствует сигнал. Клетки Сертоли определены по состоянию хроматина (окраска DAPI), характерного для активно синтезирующих клеток.

В сперматозоидах быка самая большая (1-я) и самая маленькая (29-я) хромосомы тяготеют к противоположным концам ядра: хромосома 1 преимущественно локализована в акросомной части, тогда как хромосома 29 находится в базальной части ядра [8]. В сперматозоидах свиньи наблюдали кластеризацию центромер в зависимости от типа хромосом [9]. Нет корреляции между величиной хромосомы и ее позицией в ядре: маленькие хромосомы 11, 18 и Y находят как у края, так и внутри ядра сперматозоида, большие хромосомы 1, 6 и 13 тяготеют к внутренней части ядра [3]. На основе литературных данных можно сделать вывод, что длинные хромосомы вытянуты по длинной оси ядра – показано для хромосомы 1 [31] и хромосом 14, 15 [32–34]. Тенденцию к распределению хромосом вдоль длинной оси наблюдали в работе [35]: Мс-хромосомы 11 и 10 обнаружили ближе к верхней части ядра, а Ас-хромосому 18 и Мс‑хромосому 1 – ближе к хвостовой части. Согласно работе [36], Ас-хромосома 13 занимает промежуточное положение, ближе к хвостовой части. Эти работы [35, 36] выполнены с использованием в качестве зондов бактериальных искусственных хромосом (ВАС) или хромосомных красок (отдельных сортированных хромосом, меченых с помощью DOP-праймера). Такие зонды, в отличие от использованных в настоящей работе, далеко не всегда гибридизуются с прицентромерным районом [37, 38].

Использование зондов ТП позволяет следить именно за центромерными районами и их перемещением при сперматогенезе. По литературным данным центромеры Ас-хромосом кластеризуются в один или два хромоцентра, а центромеры Мс-хромосом – в более многочисленные, но и более мелкие хромоцентры [9]. Зонд, выявляющий центромеры всех хромосом в настоящей работе (Sscrf_335А), используется впервые (рис. 2). Он позволяет видеть, как центромерные районы распределяются по длине сперматозоида (рис. 3). Картина соответствует схеме, предложенной в работе [39] для сперматозоидов человека, где подчеркивается внутреннее, но не центральное, расположение центромер без тотального слияния в хромоцентр в отличие от ранее предложенной схемы [4, 40].

Зонд Sscrf_50А позволяет видеть, что при кластеризации Мс-хромосом в ядрах сперматозоидов видны шесть сигналов, что соответствует попарной кластеризации (рис. 1, рис. 2). Зонд Sscrf_243А дает два дополнительных сигнала по сравнению с зондом Sscrf_15А, дающим в среднем два сигнала. Вероятно, дополнительные сигналы от зонда Sscrf_243А по сравнению с зондом Sscrf_15А связаны с Мс-хромосомами, которые также содержат этот ТП (рис. 1). Хромосомы 5 и 11 занимают максимально периферическое положение в ядре сперматозоида у свиньи [3]. На метафазных пластинках (рис. 1) они определены по сходству с таковыми стандартного кариотипа свиньи [41]. Именно хромосома 5 (Мс) метится зондом Sscrf_243А дополнительно к набору Ас-хромосом (рис. 1). Мы планируем проверить это предположение с помощью зондов, специфичных для хромосомы 5. Зонды, полученные на основании методов биоинформатики и проверенные в настоящей работе, при гибридизации в основном подтверждают литературные данные и пригодны для дальнейшей работы.

Организация центромерного района

Не вызывает сомнения, что в основе укладки хромосом, и соответственно центромер, лежит петлевая организация [4, 28]. Прицентромерные ТП организованы в большие поля, которые, например, у мыши и человека составляют до 10% генома. Известны транскрипты ТП, обнаруженные в раннем эмбриональном развитии разных организмов [42, 43] и в клетках опухолей [1]. Для клеток подавляющего большинства высших эукариот известны лишь несколько мажорных ТП. Даже бурное развитие техник секвенирования и сборки геномов не дало алгоритмов сборки ТП. В сборках геномов большинства высших эукариот в центромерной (прицентромерной) области находится незаполненный промежуток — Golden Path Gap (GPG). Геном свиньи не является исключением, поэтому невозможно оценить истинный размер полей найденных ТП. Максимально длинное поле ТП, найденное в геномной сборке Sscrofa10.2, составляет 47 744 пн для семейства Sscrf_15А, что практически соответствует экспериментальной оценке величины петель ДНК сперматозоида – 20–50 тпн [7]. Петли в районе центромеры могут быть меньше [44] и соответствовать величине даже меньшим полям ТП. Петли, выступающие за ось хромосом с торца хромосомы, выглядят как розетка [45]. Можно предполагать, что именно такие поля, организованные в виде розетки петель, мы наблюдаем в процессе организации мейотических хромосом. Это предположение может быть проверено при использовании в качестве зонда ТП строго для одной хромосомы; такие ТП по нашим предварительным данным обнаружены у хомяков. У мыши ассоциацию как бивалентов, так и отдельных хромосом наблюдали в районе гетерохроматина [46]. Мы предполагаем использовать метод иммуноFISH, т.е. антитела против элементов синаптонемного комплекса, и зонды к ТП для того, чтобы проверить, справедливо ли это в случае двойных колец (рис. 4, Sscrf_15А, в, и зонд Sscrf_50A, а').

Некартированные на хромосомах и неаннотированные поля ТП присутствуют в контигах баз данных. Использование методов биоинформатики позволило нам выявить набор ТП в геноме свиньи домашней S. scrofa (объекта, важного для народного хозяйства) и определить специфичность изготовленных зондов. Мы показали следующее: 1) короткие олигонуклеотидные зонды выявляют Мс- и Ас-наборы хромосом; 2) в сперматозоидах существует характерный паттерн для каждого зонда; 3) центромерные зонды вероятно, дают возможность наблюдать сборку центромерного района.

Авторы признательны А.Ф. Сайфитдиновой и И.Л. Трофимовой за плодотворную дискуссию, И.А. Гамалей за бесценную помощь в редактировании текста статьи, а также сотрудникам ЦКП “Хромас” (С.-Петербургский университет) за методическую помощь.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (18-04-00238-мол_а), гранта Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология” и РНФ 19-74-20102.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.