Генетика, 2019, T. 55, № 7, стр. 788-797

Поиск DD41D-транспозонов

Для поиска ДНК-транспозонов с каталитическим доменом DD41D был использован tBLASTn со стандартными настройками [25]. В качестве матриц для поиска были взяты аминокислотные последовательности, кодируемые ОРС элементов Crmar2.5 (AAK61417) и Apismar5.1 [22]. Нуклеотидные последовательности геномной ДНК гребневиков Mnemiopsis leidyi (MneLei_Aug2011, GCA_000226015) и Pleurobrachia bachei (P.bachei_draft_genome_v.1.1, GCA_000695325) были взяты из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Первый геном составляет 155.9 млн пн, объединенных в 5100 скаффолдов; второй состоит из 156.1 млн пн, организованных в 21 979 скаффолдах [26, 27]. Для того чтобы определить полные нуклеотидные последовательности каждого элемента, фрагменты, обладающие наибольшей гомологией к аминокислотным последовательностям транспозаз Crmar2.5 и Apismar5.1, были извлечены из соответствующих скаффолдов вместе с фланкирующими участками протяженностью 5000 пн. В каждой извлеченной последовательности был осуществлен поиск инвертированных повторов (TIR и SIR) с помощью BLASTn [28]. Каждая полная последовательность нового выявленного элемента затем использовалась для определения количества присутствующих в геноме копий и уточнения границ элемента. Последовательности протяженностью менее 10% от длины полноразмерного МГЭ исключались из анализа. Консенсусные последовательности были получены с использованием правила относительного большинства.

Анализ последовательностей

Границы предполагаемых ОРС определяли с помощью ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) и далее уточняли визуально. Последовательность сигнала ядерной локализации (NLS) выявляли с помощью ScanProsite [29]. ДНК-связывающий мотив HTH определяли, используя PSIPRED v3.3 [30]. Мотив GRPR-типа, а также DDE/D-домен идентифицировали визуально.

Филогенетический анализ

Для филогенетического анализа и анализа DDE/D-доменов, помимо изучаемых последовательностей, были взяты транспозазы 29 элементов, представляющих различные группы суперсемейства IS630/Tc1/mariner, и 19 DD41D-транспозонов подсемейств Crmar-like и LTIR (табл. 1). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей было выполнено с помощью MUSCLE [31] с использованием стандартных настроек. Поиск наилучшей модели для филогенетического анализа и филогенетический анализ проводили с использованием программного обеспечения MEGA7.0 [32].

Выявление случаев горизонтального переноса

Консенсусные нуклеотидные последовательности DD41D-транспозонов, выявленных в настоящей работе, были использованы для идентификации возможных случаев горизонтального переноса. С помощью BLASTn осуществлен поиск по базам данных нуклеотидных (nr) и полногеномных (WGS) последовательностей, доступных в NCBI. Как было предложено ранее [33], случаи возможного горизонтального переноса рассматривались когда элементы имели более 75% идентичности к более 90% последовательности матрицы для поиска.

DD41D-транспозоны в геноме M. leidyi

Для идентификации ДНК-транспозонов семейства rosa у мнемиопсиса в качестве матрицы для поиска были взяты аминокислотные последовательности транспозаз элемента Crmar2.5 (подсемейство Crmar-like) и элемента Apismar5.1 (подсемейство LTIR). В результате анализа геномной ДНК M. leidyi с помощью tBLASTn выявлено около ста локусов, имеющих высокую гомологию с транспозазами элементов Crmar2.5 и Apismar5.1. Выявленные нуклеотидные последовательности были фрагментами делетированных и полноразмерных копий трех DD41D-транспозонов, которые согласно номенклатуре Repbase [34] названы Mariner-2_MLe, Mariner-3_MLe и Mariner-N1_MLe (табл. 2).

Для элементов Mariner-2_MLe и Mariner-3_MLe обнаружены потенциально функциональные копии, тогда как для Mariner-N1_MLe были найдены только делетированные варианты. При сравнении структур исследуемых элементов с известными DD41D-транспозонами установлено, что по длине TIR и общей протяженности они имеют сходство с элементами подсемейства Crmar-like (рис. 1). Кроме того, у элементов Mariner-2_MLe и Mariner-3_MLe были выявлены SIR, что обусловливает их сходство с МГЭ подсемейтва LTIR, в структуре которых SIR могут присутствовать [6]. У Mariner-N1_MLe SIR не были обнаружены.

Рис. 1.

Размерные характеристики DD41D-транспозонов. пн – пары нуклеотидов; а.о. – аминокислотные остатки.

В результате анализа с помощью BLASTn обнаружено 129 копий элемента Mariner-2_MLe, 143 копии Mariner-3_MLe и восемь копий Mariner-N1_MLe (табл. 2). При этом были выявлены 21 и 17 полноразмерных вариантов элементов Mariner-2_MLe и Mariner-3_MLe соответственно. Оценка идентичности полноразмерных копий к консенсусной последовательности показала, что у транспозона Mariner-2_MLe эта характеристика варьирует от 92 до 96%. У элемента Mariner-3_MLe уровень идентичности был гораздо шире (78–96%). Здесь же следует отметить, что среди полноразмерных копий данного элемента не было ни одной с потенциально функциональной транспозазой. Это дает основания полагать, что Mariner-3_MLe – более древний элемент, чем Mariner-2_MLe, и в ходе эволюции генома мнемиопсиса подвергся вертикальной инактивации. У Mariner-N1_MLe не было выявлено ни одной полноразмерной копии. Отсутствие потенциально функциональных вариантов и малое число копий в целом свидетельствуют о том, что либо Mariner-N1_MLe является еще более древним транспозоном и большая часть его копий была элиминирована из генома, либо он подвергся ранней инактивации и не смог широко распространиться по геному.

Особенности транспозаз DD41D-транспозонов M. leidyi

Активные mariner-подобные транспозазы содержат ДНК-связывающий мотив HTH и мотив GRPR-типа (известный как AT-крюк) в N-концевой части белка, а также каталитический домен (DDE/D-домен) в С-концевой части. Кроме того, у некоторых mariner-подобных транспозаз выявляют последовательность сигнала ядерной локализации (NLS), которая, как правило, расположена в петле, разделяющей HTH и DDE/D-домен. Однако участие NLS в функциональности фермента пока не подтверждено [35].

Для анализа транспозаз Mariner-2_MLe и Mariner-3_MLe были выбраны копии с наиболее полной ОРС, без стоп-кодонов и сдвигов рамки считывания. У Mariner-N1_MLe сохранились только копии, ОРС которых содержали участок, кодирующий С-конец транспозазы с DDE/D-доменом. Анализ транспозаз Mariner-2_MLe и Mariner-3_MLe показал, что в обоих белках присутствуют мотив HTH (в позиции 70 и 30 соответственно) и АТ-крюк (в позиции 63 и 23 соответственно). Последовательность NLS нами не была выявлена ни в одной из транспозаз исследуемых элементов мнемиопсиса. В работе Буалег с соавт. [22] NLS также не были обнаружены в транспозазах элементов Crmar-like и LTIR.

Каталитический домен ДНК-транспозонов имеет три маркерных аминокислотных остатка: два аспартата (D) и третий либо глутамат (Е), либо аспартат, в связи с чем эта триада называется DDE/D-домен. Этот домен отвечает за разрезание цепей ДНК и лигирование в процессе инсерции. Для сохранения ферментативной активности необходимо наличие всех трех маркерных аминокислотных остатков, поэтому данная область обладает большей консервативностью по сравнению с N-концевой частью транспозазы [35].

При анализе DD41D-транспозонов M. leidyi каталитический домен был идентифицирован в транспозазах всех трех МГЭ, но в аминокислотной последовательности Mariner-3_MLe третий аспартат DDE/D-домена был замещен на аспарагин (N). Таким образом, только фермент, кодируемый ОРС Mariner-2_MLe, имеет НТН-мотив, АТ-крюк и полноценный DDE/D-домен, наличие которых характерно для активных транспозаз, что свидетельствует о его возможной функциональности.

leidyi – новое подсемейство DD41D-транспозонов

Различия в протяженности района транспозазы между вторым и третьим маркерными аминокислотными остатками (аспартат и глутамат/аспартат) каталитического домена являются классификационным критерием для элементов суперсемейства IS630/Tc1/mariner. По этому признаку IS630/Tc1/mariner-транспозоны подразделяются на восемь семейств: DDxE (IS630) [17], DD34E (Tc1) [18], DD34D (mariner) [18], DDхD (pogo) [19], DD37D (maT) [20], DD37E (mosquito) [20], DD39D (plants) [20] и DD41D (rosa) [21]. Такое деление подтверждается и филогенетическими исследованиями [6, 22, 36], но встречаются исключения – недавно было описано подсемейство TRT, которое филогенетически относится к транспозонам Tc1, но обладает DD37E-доменом [37]. Сравнение консервативных областей каталитичеcкого домена транспозаз 19 элементов подсемейств Crmar-like и LTIR (табл. 1) и элементов мнемиопсиса показало, что DDE/D-домены Mariner-2_MLe, Mariner-3_MLe и Mariner-N1_MLe имеют явные отличия (рис. 2). Консенсусные последовательности областей маркерных аспартатов (D) элементов M. leidyi имеют уникальные, характерные только для этих МГЭ аминокислотные остатки (на рис. 2 отмечены стрелками). Данные различия дают основания предполагать, что исследуемые транспозоны могут представлять новую, не описанную ранее группу ДНК-транспозонов с каталитическим доменом DD41D, названную нами leidyi. В пользу этой гипотезы свидетельствуют особенности структуры МГЭ M. leidyi, в соответствии с которыми их нельзя отнести ни к подсемейству Crmar-like (из-за наличия SIR), ни к LTIR (из-за коротких TIR и относительно небольшой длины МГЭ) (рис. 1).

Рис. 2.

Множественное выравнивание каталитических доменов ДНК-транспозонов rosa. Символами “/ /” указаны неотображенные на рисунке участки аминокислотных последовательностей. Черным цветом выделены маркерные аспартаты DDD-доменов; серым цветом обозначены гомологичные участки среди элементов подсемейств; стрелками указаны отличия в консенсусных последовательностях DDD-доменов элементов leidyi от Crmar-like и LTIR.

Для того чтобы проверить гипотезу о принадлежности МГЭ M. leidyi к новому подсемейству, мы провели филогенетический анализ, в который были включены ДНК-транспозоны семейства rosa как мнемиопсиса, так и описанные в работах Жанг с соавт. [6] и Буалег с соавт. [22], а также представители других семейств суперсемейства IS630/Tc1/mariner (рис. 3). Все три элемента мнемиопсиса сформировали отдельную от Crmar-like и LTIR ветвь с высоким бутстреп-значением (88). Таким образом, обнаруженные нами МГЭ в геноме M. leidyi действительно представляют новое подсемейство DD41D-транспозонов.

Рис. 3.

Филогения ДНК-транспозонов суперсемейства IS630/Tc1/mariner. Дерево было сгенерировано в MEGA7 с использованием метода максимального правдоподобия с использованием модели WAG+G+F. Указаны только бутстреп-значения выше 60%. Семейства и подсемейства указаны справа от дерева. Стрелками указаны исследуемые в данной работе DD41D-транспозоны.

В связи с тем, что для элементов суперсемейства IS630/Tc1/mariner горизонтальный перенос – достаточно распространенное явление [38], мы предприняли поиск последовательностей, обладающих идентичностью свыше 75% к не менее чем 90% протяженности элементов Mariner-2_MLe, Mariner-3_MLe и Mariner-N1_MLe. В результате данного анализа не было установлено случаев возможного горизонтального переноса между мнемиопсисом и представителями других таксонов. И если подобные события имели место, то они были далеко в прошлом. Поскольку геномные исследования последних лет позволили установить, что гребневики – это наиболее древняя ветвь среди многоклеточных животных [26, 27, 39], то, вероятно, все три элемента являются “потомками” древнего DD41D-транспозона, проникшего в геном гребневика и эволюционировавшего вместе с ним.

DD41D-транспозоны в геноме Pleurobrachia bachei

Помимо M. leidyi полная нуклеотидная последовательность геномной ДНК была определена у P. bachei (гребневика из отряда Cydippida) [27]. Для того чтобы выяснить, ограничивается ли присутствие транспозонов подсемейства leidyi геномом M. leidyi (отрядом Lobata) или распространяется и на другой отряд гребневиков, мы провели поиск DD41D-транспозонов в геноме P. bachei. В качестве матрицы для поиска с помощью tBLASTn были взяты аминокислотные последовательности транспозаз элементов Crmar2.5 и Mariner-2_MLe. Нами найдены два МГЭ, гомологичных DD41D-транспозонам, которые были названы согласно номенклатуре Repbase [34] Mariner-1_PBaс и Mariner-2_PBaс (табл. 1). В результате анализа с помощью BLASTn обнаружено семь копий элемента Mariner-1_PBaс и среди них только одна полноразмерная. У элемента Mariner-2_PBaс выявлено 89 делетированных копий, полноразмерная копия была реконструирована нами из двух делетированных. Оба элемента имеют протяженность свыше 2000 пн и длину TIR 87 (Mariner-1_PBaс) и 377 пн (Mariner-2_PBaс), характерные для транспозонов LTIR (рис. 1). SIR обнаружены не были, что, однако, не протеворечит данным, полученным ранее, поскольку не все элементы LTIR обладают SIR [6, 22]. Транспозазы обоих элементов имели HTH-мотив, АТ-крюк и DDE/D-домен. Несмотря на высокую гомологию обоих элементов P. bachei DD41D-транспозонам, их каталитические домены имеют большую протяженность как между первым и вторым и маркерными аспартатами, так и между вторым и третьим – D127D55D у Mariner-1_PBaс и D105D45D у Mariner-2_PBaс (рис. 2). В то же время области маркерных аспартатов более всего гомологичны элементам подсемейства LTIR (рис. 2). Филогенетический анализ также показал, что оба элемента P. bachei являются представителями подсемейства LTIR (рис. 3). Таким образом, в геноме P. bachei не обнаружено МГЭ подсемейства leidyi, что может быть свидетельством ограниченного распространения данных транспозонов среди гребневиков.

Интерес представляют каталитические домены элементов P. bachei, необычные для LTIR. Поскольку и у Mariner-1_PBaс, и у Mariner-2_PBaс было обнаружено только по одной копии, содержащей DDE/D-домен, невозможно установить, является ли этот признак характерным для данных элементов или отличия в протяженности обусловлены мутационными событиями в конкретной сохранившейся копии. Подобный случай наблюдался в геноме тихоокеанской устрицы Crassostrea gigas, в котором был обнаружен элемент Mariner-21_CGi с DD83D-доменом, имеющий 80 копий, среди которых только одна полноразмерная [40].

На сегодняшний день известно достаточно большое количество генов, возникших от транспозонов, хотя биологическая роль большинства из них остается неясной [41]. Отдельные случаи “приручения” белков МГЭ геномом рассматриваются как адаптация к различным эволюционным конфликтам. Некоторые белки МГЭ были перепрофилированы как часть защитных систем, которые ограждают геном хозяина от инфекционных или инвазивных агентов, включая вирусы и сами МГЭ. Предполагается, что “приручение” белков МГЭ часто является единственным эволюционным путем к уменьшению ущерба, причиняемого транспозиционной активностью [42]. В результате “приручения” используемые геномом функциональные домены МГЭ как правило сохраняются в исходной или несколько измененной форме, тогда как остальные структуры утрачиваются [43]. На данный момент предложено несколько критериев, по которым можно предположить происхождение генов от МГЭ [10]: 1) элементы, которые были “приручены”, существуют в геномах как одиночные копии; 2) в структуре таких генов отсутствуют молекулярные особенности ДНК-транспозонов, такие как инвертированные повторы или дуплицируемые сайты встраивания; 3) ортологи обнаруживаются у далеких видов. У многоклеточных уже известны три независимых случая “приручения” pogo-подобных транспозаз [44]. Mariner-1_PBaс и Mariner-2_PBaс соответствуют первому из предложенных критериев, поэтому можно предположить, что эти МГЭ не просто подверглись инактивации и элиминации, но вовлечены в генетические процессы хозяина, что, возможно, объясняет и наличие более протяженных каталитических доменов.

В настоящей работе впервые описаны DD41D-транспозоны гребневика M. leidyi. Было установлено, что данные МГЭ представляют новую, неизвестную ранее кладу элементов суперсемейства IS630/Tc1/mariner, которая была названа нами leidyi. Представители этого подсемейства сочетают в себе признаки, присущие для двух других подсемейств DD41D-транспозонов – Crmar-like и LTIR. Подсемейство leidyi не является характерным для всех гребневиков, что было показано при исследовании генома P. bachei. Мы также идентифицировали DD41D-подобные транспозоны, принадлежащие к подсемейству LTIR, которые имеют более протяженные каталитические домены. Данные, полученные в работе, послужат основой для будущих исследований, направленных на понимание роли мобильных генетических элементов в процессах эволюции и адаптации, а также механизмов “приручения” МГЭ геномом-носителем.

Исследование ДНК-транспозонов M. leidyi выполнено при финансовой поддержке РФФИ и города Севастополь в рамках научного проекта № 18-44-920002. Изучение МГЭ P. bachei проведено в рамках государственного задания ФГБУН ИМБИ “Функциональные, метаболические и токсикологические аспекты существования гидробионтов и их популяций в биотопах с различным физико-химическим режимом”, номер гос. регистрации НИОКТР АААА-А18-118021490093-4.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.