Генетика, 2019, T. 55, № 7, стр. 837-843

Межвидовой полиморфизм генов DEP1 и форма колоса у пшениц

В. Ю. Вавилова 1*, И. Д. Конопацкая 1, А. Г. Блинов 1, Н. П. Гончаров 1

1 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
630090 Новосибирск, Россия

* E-mail: valeriya-vavilova@bionet.nsc.ru

Поступила в редакцию 08.11.2018
После доработки 28.11.2018
Принята к публикации 05.12.2018

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведен анализ последовательностей гена DEP1 у десяти образцов видов Triticum macha Decapr. et Menabde, T. antiquorum Heer ex Udacz., T. sphaerococcum Perciv., мутантов мягкой и твердой пшениц и единичного полукомпактного образца донора генома D мягкой пшеницы Aegilops tauschii Coss. В результате сравнения было показано, что у всех исследованных образцов пшеницы кроме образца изогенной линии мягкой пшеницы i: Cp-M808(Vrn1) представлено по одному аллельному варианту каждого из генов Dep1-A, Dep1-B и Dep1-D. Последовательности генов Dep1-A, Dep1-B и Dep1-D, полученные для образцов пшениц и мутантов мягкой и твердой пшениц, идентичны описанным ранее. Исключение составляют образцы Cp-M808(Vrn1) и cp-M808(Vrn1). В изогенной линии Cp‑M808(Vrn1) были обнаружены новые аллельные варианты: Dep1-Aа, Dep1-Bb, Dep1-Da и Dep1-Db. Новые аллели Dep1-Ba и Dep1-Dc были описаны для изогенной линии сp-M808(Vrn1). Индивидуальные мутации генов Dep1 были выявлены у отдельных образцов пшениц. Однако аллели, коррелирующие с определенной морфологией колоса у пшениц, не установлены. В уникальном образце Ae. tauschii KT-120-16 с полукомпактным колосом был обнаружен аллель Dep1-Dd, отличающийся от аллеля Dep1-D спельтоидных образцов Ae. tauschii наличием делеций в 5'-UTR. Эти делеции, вероятно, оказывают влияние на экспрессию гена Dep1-Dd и определяют формирование компактного колоса у Ae. tauschii KT-120-16.

Ключевые слова: морфология колоса, ген DEP1, вариабельность, Triticum, Aegilops.

DOI: 10.1134/S0016675819070142

Молекулярно-генетический контроль сложного и хозяйственно важного признака “форма колоса” у пшениц рода Triticum L. изучен недостаточно [16]. Ген DENSE AND ERECT PANICLE 1 (DEP1), первоначально описанный у риса Oriza sativa L., может быть кандидатом на роль гена, контролирующего компактную форму колоса у пшениц [7]. У риса ген DEP1 расположен на хромосоме 9 и кодирует вторую γ-субъединицу типа AGG3 гетеротримерного G-белка [8, 9]. В исследованиях Ху и соавт. [9] было показано, что у риса ген OsDEP1 плейотропно контролирует группу признаков, в том числе плотность метелки, число зерен в ней и формирование высокопродуктивной метелки (erect panicle). Мутантный аллель dep1 отличается от DEP1 делецией, которая приводит к потере цистеин-богатого домена на С-конце Gγ-субъединицы белка (gain-of-function mutation). Наличие аллеля dep1 приводит к формированию особой архитектоники метелки, хорошо развитых сосудистых пучков, увеличению числа зерен на метелку и увеличению урожайности.

При изучении гена DEP1 у ячменя Hordeum vulgare L. была продемонстрирована взаимосвязь между вариабельностью последовательности данного гена и морфологией колоса и урожайностью [10, 11]. Были выявлены мутации, вызывающие потерю функции (loss-of-function mutations), например у сорта Golden Promise они приводят к удлинению стебля и увеличению размера зерновок [11]. Кроме того, в 5'-нетранслируемом районе (5'-untranslated region (5'-UTR)) гена DEP1 ячменя обнаружена дополнительная открытая рамка считывания, которая, как ожидается, может участвовать в посттранскрипционной регуляции гена [10].

В экспериментах Хуанг и соавт. [8] продемонстрировано, что у пшеницы подавление экспрессии TaDEP1 приводит к формированию более длинного и менее компактного колоса с меньшим числом колосков. Вариабельность гена DEP1 у пшениц была изучена для ряда ди-, тетра- и гексаплоидных пшениц и были выявлены делеции по сравнению с геном DEP1 у ячменя, однако корреляции между аллелями данного гена и морфологией колоса не обнаружено [7, 8].

В настоящей работе изучена вариабельность 5‑го экзона и нетранслируемых районов 5'-UTR и 3'-UTR генов DEP1 для образцов T. macha Decapr. et Menabde, T. antiquorum Heer ex Udacz., T. sphaerococcum Perciv., Aegilops tauschii Coss. (=syn. Ae. squarrosa L.), а также для двух изогенных линий мягкой пшеницы и трех мутантных линий мягкой и твердой пшениц (табл. 1). Изогенная линия мягкой пшеницы с геном cp Mироновская 808 (Vrn1) (i: сp-M808(Vrn1)) является сестринской линией изогенной линии Сp‑M808(Vrn1) [12]. Характеристика других изогенных и мутантных линий, проанализированных в настоящем исследовании, дана в публикации Косуге с соавт. [13]. Для каждого из 10 изученных образцов гексаплоидных пшениц и одного образца эгилопса Тауша, характеризуемого полукомпактной формой колоса [14], при стандартных световом и температурном режимах в условиях тепличного комплекса было выращено по 10 растений. После созревания для всех растений визуально был определен основной признак морфологии колоса – форма (нормальная, компактная, компактоидная, спельтоидная, полукомпактная). Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1.  

Характеристика образцов, использованных для изучения генов DEP1

Номер по каталогу Название вида Генетический банк Место сбора Форма колоса 5'-UTR генов DEP1 в GenBank 5-й экзон и 3'-UTR генов DEP1 в GenBank
K-31689 T. macha Decapr. et Menabde ВИР Грузия Компактная Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
K-28195 T. macha Decapr. et Menabde » » » Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
K-58671 T. macha Decapr. et Menabde » » » Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
K-56397 T. antiquorum Heer ex Udacz. » Таджикистан » Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
K-13173 T. sphaerococcum Perciv. » Индия » Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
i: сp-M808(Vrn1) Изогенная линия мягкой пшеницы » Россия Нормальная Dep1-A
Dep1-Bа
Dep1-Dс
Dep1-A
Dep1-Bа
Dep1-Dс
i: Cp-M808(Vrn1) Изогенная линия мягкой пшеницы » » Компактная Dep1-
Dep1-Bb
Dep1-Da
Dep1-Db
Dep1-
Dep1-Bb
Dep1-Da
Dep1-Db
МСК 2617 Мутант мягкой пшеницы сорта Скала АлтНИИСХ » » Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
Dep1-A
Dep1-B
Dep1-D
cv. MA 17648 Мутант линии твердой пшеницы » » » Dep1-A
Dep1-B
Dep1-A
Dep1-B
МСК 739 Мутант линии твердой пшеницы » » » Dep1-A
Dep1-B
Dep1-A
Dep1-B
KT-120-16 Ae. tauschii Coss. KIBR, Япония Китай Полукомпактная Dep1-Dd Dep1-Dd

Из листьев выращенных растений была выделена тотальная ДНК с помощью коммерческого набора реагентов (DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)). В настоящем исследовании с использованием специфических праймеров Dep1-MF 5'-CAGATCGAAACTGTGCATAT-3' и Dep1-MR 5'-TACTAGAGCTACTTCACTCC-3' [7] для исследуемых образцов был амплифицирован фрагмент, охватывающий 5-й экзон и 3'-UTR генов DEP1. Продукты амплификации ПЦР ожидаемого размера получены для всех исследуемых образцов, клонированы (pGEM-T Easy kit (Promega)), амплифицированы с помощью стандартной пары праймеров (M13F: 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′, M13R: 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′) и секвенированы с использованием ЦКП “Геномика” СО РАН (http://sequest.niboch.nsc.ru/). Нуклеотидные последовательности 5-го экзона и 3'-UTR генов Dep1-A, Dep1-B и Dep1-D были размещены в базе данных GenBank NCBI под номерами: MK166804–MK166832. Для нуклеотидных последовательностей получены предполагаемые аминокислотные последовательности в программе ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/).

Сравнение полученных последовательностей 5-го экзона и 3'-UTR генов Dep1-A, Dep1-B и Dep1-D с последовательностями данных генов, представленными в базе данных GenBank, проводилось с использованием программ MAFFT v7.397 [15] и AliView 1.18.1 [16]. В результате сравнения было показано, что у всех исследованных образцов пшеницы, кроме образца изогенной линии мягкой пшеницы i: Cp-M808(Vrn1), представлено по одному аллельному варианту каждого из генов Dep1-A, Dep1-B и Dep1-D (табл. 1; рис. 1,а). Полученные последовательности генов Dep1-A идентичны описанным ранее последовательностям А-геномной копии данного гена. Исключение составляет последовательность образца i: Cp‑M808 (Vrn1). В 5-м экзоне гена Dep1-Aa данного образца обнаружена нуклеотидная замена, которая приводит к аминокислотной замене Вал → Мет (ам. позиция 283) (рис. 1,а).

Рис. 1.

Вариабельность последовательностей 5-го экзона генов DEP1 у пшениц и эгилопсов (а). Вариабельность последовательностей 3'-UTR генов DEP1 у пшениц и эгилопсов (б). * – образцы T. macha (K-31689, K-28195 и K-58671), T. antiquorum K-56397, T. sphaerococcum K-13173, T. aestivum i: сp-M808(Vrn1), мутанты T. durum MA 17648 и МСК 739; ** – образцы T. macha (K-31689, K-28195 и K-58671), T. antiquorum K-56397, T. sphaerococcum K-13173, мутант сорта мягкой пшеницы Скала МСК 2617, мутанты T. durum MA 17648 и МСК 739; *** – образцы T. macha (K-31689, K-28195 и K-58671), T. antiquorum K-56397, T. sphaerococcum K-13173. Аминокислотные и нуклеотидные позиции указаны в соответствии с последовательностью T. monococcum (MF979621). Полужирным шрифтом выделены образцы, проанализированные в настоящей работе. Градацией серого цвета обозначены последовательности генов Dep1-A, Dep1-B и Dep1-D.

Отличия между новыми и описанными ранее последовательностями гена Dep1-B были выявлены только для образцов изогенных линий Cp‑M808(Vrn1) и сp-M808(Vrn1). Для образца cp‑M808(Vrn1) характерна однонуклеотидная замена, приводящая к аминокислотной замене Цис → → Арг в 139-й ам. позиции (Dep1-Ba). В образце Cp-M808(Vrn1) отсутствует делеция длиной 30 пн в 5-м экзоне, характерная для описанного ранее аллеля Dep1-B, а последовательность “встройки” имеет гомологию 93.3% с аналогичным районом генов Dep1-A и Dep1-D (обозначен Dep1-Bb) (рис. 1,а). По-видимому, новый аллель Dep1-Bb является результатом кроссинговера между хромосомами А и В.

Для изогенной линии Cp-M808(Vrn1) выявлены два аллельных варианта гена Dep1-D (обозначены как Dep1-Da и Dep1-Db). В случае аллеля Dep1-Da последовательность 5-го экзона была идентична ранее описанному D-геномному варианту, однако последовательность 3'-UTR частично гомологична аналогичному району гена Dep1-A (рис. 1,а). Dep1-Db отличается от аллеля Dep1-D, описанного ранее, двумя нуклеотидными заменами, которые приводят к двум аминокислотным заменам (Мет → Арг и Лей → Фен в 118-й и 120-й ам. позиции соответственно). Таким образом, данный участок 5-го экзона Dep1-Db идентичен Dep1-A и Dep1-B (рис. 1,а). Последовательность 5‑го экзона Dep1-D сестринской изогенной линии сp-M808(Vrn1) с 1 по 379 пн идентична Dep1-A, а последовательность 5-го экзона с 380 по 632 пн и 3'-UTR длиной 173 пн идентичны аллелю Dep1-D, описанному для гексаплоидных видов пшениц (аллель Dep1-Dс) (рис. 1,б). Новые аллельные варианты гена Dep1-D, выявленные в настоящей работе, также, по-видимому, образовались в результате кроссинговера. Последовательности 5-го экзона и 3'-UTR Dep1-D для других восьми образцов пшениц и образца Ae. tauschii идентичны ранее описанному варианту Dep1-D.

Последовательности 5'-UTR генов DEP1 для образцов пшениц и полукомпактного образца Ae. tauschii были получены с использованием подходов, описанных выше для 5-го экзона DEP1. ПЦР-амплификацию фрагментов с геномной ДНК проводили с помощью специфических пар праймеров: Dep1-LF 5'-GCCGTGCGTGCAATCAAT-3' и Dep1-LR 5'-ACCTTGAGGAACGTGAGCT-3' (Dep1-A, Dep1-D) [7], Dep1-L2F 5'-GTACTGCTAGTACGTGATGGC-3' и Dep1-LR 5'-ACCTTGAGGAACGTGAGCT-3' (Dep1-B). Нуклеотидные последовательности 5'-UTR генов Dep1-A, Dep1-B и Dep1-D были размещены в базе данных GenBank NCBI под номерами MK166833–MK166861.

Сравнительный анализ последовательностей 5'-UTR, выявленных в образцах пшеницы и представленных в базе данных GenBank, показал отсутствие новых аллельных вариантов (табл. 2). При проведении сравнения последовательностей 5'-UTR гена Dep1-D у образцов Ae. tauschii KT-120-16 (генотип обозначен Dep1-Dd) и Ae. tauschii cv. AL8/78 (MCGU01048243) были выявлены четыре делеции длиной 4, 5, 5 и 8 пн (табл. 2).

Таблица 2.  

Вариабельность 5'-UTR генов DEP1 у пшениц и эгилопсов

Образцы (номер в базе данных GenBank) Номер нуклеотидной позиции 5'-UTR генов до старт-кодона гена DEP1 относительно последовательности T. aestivum (FAOM01435944)
–674 –578 –431 –415...–411 –398 –384 –350 –280...–276 –227...–222 –181...–174 –7
T. aestivum (FAOM01435944),
T. macha (3 образца), T. antiquorum, T. sphaerococcum
T G A TCACC T TCTC T TTACT GCCCCC ACGCACGC G
Изогенные линии мягкой пшеницы i: сp-M808(Vrn1), Cp-M808(Vrn1) T G A TCACC A TCTC T TTACT GCCCCC ACGCACGC G
T. compactum (MF979629) T G G TCACC T TCTC C TTACT GCCCCC ACGCACGC A
T. spelta (MF979630) T G A TCACC T TCTC T TTACT GCCCCC ACGCACGC G
Ae. tauschii cv. AL8/78 (MCGU01048243) T G A TCACC T TCTC T TTACT - - - - - - ACGCACGC G
Ae. tauschii KT-120-16 G A A - - - - - T - - - - T - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G

Примечание. Полужирным шрифтом обозначены образцы, проанализированные в настоящей работе.

В рамках настоящего исследования были обнаружены новые аллельные варианты генов Dep1-A, Dep1-B и Dep1-D (рис. 1, табл. 2). В отличие от ячменя, для которого описаны lose-of-function мутации, у пшениц и эгилопсов не выявлены мутации, приводящие к потере функции гена. При сравнении образца с компактной формой колоса i: Cp-M808(Vrn1) с образцом с нормальной формой колоса i: сp-M808(Vrn1) выявлены различия в нуклеотидных последовательностях 5-го экзона и 3'-UTR, приводящие к аминокислотным заменам в белке Dep1 (рис. 1). Данные различия могут быть связаны с формированием компактной формы колоса у изогенной линии Cp-M808(Vrn1). Однако аллельные варианты генов DEP1, выявленные у образца Cp-M808(Vrn1), не были обнаружены у других исследованных образцов с компактной формой колоса. Таким образом, для генов DEP1 выявлены индивидуальные мутации в отдельных образцах пшениц, однако аллели, коррелирующие с определенной морфологией колоса у пшениц, не обнаружены. Поскольку ранее было показано, что подавление экспрессии DEP1 у T. aestivum приводит к изменению формы колоса [8], участие гена DEP1 в контроле формирования данного признака у пшениц не вызывает сомнений. Однако результаты настоящего исследования и результаты Вавиловой и соавт. [7] показывают, что влияние гена DEP1 на форму колоса не связано с вариабельностью последовательности данного гена. Для уникального образца Ae. tauschii KT-120-16 с полукомпактным колосом был выявлен аллель Dep1-Dd, отличающийся от аллеля Dep1-D спельтоидных образцов Ae. tauschii наличием делеций в 5'-UTR. Эти делеции могут оказывать влияние на экспрессию гена Dep1-Dd и определять формирование компактного колоса. Для подтверждения данной гипотезы требуется проведение дополнительных исследований экспрессии аллелей Dep1-D у эгилопсов.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-10021).

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Список литературы

  1. Simons K.J., Fellers J.P., Trick H.N. et al. Molecular characterization of the major wheat domestication gene Q // Genetics. 2006. V. 172. № 1. P. 547–555. https://doi.org/10.1534/ genetics.105.044727

  2. Zhang Z., Belcram H., Gornicki P. et al. Duplication and partitioning in evolution and function of homoeologous Q loci governing domestication characters in polyploid wheat // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. № 46. P. 18737–18742. https://doi.org/10.1073/pnas.1110552108

  3. Rao M.V.P. Mapping of the compactum gene C on chromosome 2D of wheat // Wheat Inf. Serv. 1972. V. 35. P. 9.

  4. Johnson E.B., Nalam V.J., Zemetra R.S. et al. Mapping the compactum locus in wheat (Triticum aestivum L.) and its relationship to other spike morphology genes of the Triticeae // Euphytica. 2008. V. 163. № 2. P. 193–201. https://doi.org/10.1007/s10681-007-9628-7

  5. Гончаров Н.П., Гайдаленок Р.Ф. Локализация генов, контролирующих округлую форму зерновок и компактную форму колоса у Triticum antiquorum Heer ex Udacz // Генетика. 2005. Т. 41. № 11. С. 1531–1537.

  6. Гончаров Н.П. Сравнительно-генетическое изучение тетраплоидных форм мягкой пшеницы без генома D // Генетика. 1997. Т. 33. № 5. С. 660–663.

  7. Vavilova V., Konopatskaia I., Kuznetsova A.E. et al. DEP1 gene in wheat species with normal, compactoid and compact spikes // BMC Genet. 2017. V. 18. Suppl. 1. P. 106. https://doi.org/10.1186/s12863-017-0583-6

  8. Huang X., Qian Q., Liu Z. et al. Natural variation at the DEP1 locus enhances grain yield in rice // Nat. Genet. 2009. V. 41. № 4. P. 494–497. https://doi.org/10.1038/ng.352

  9. Xu H., Zhao M., Zhang Q. et al. The DENSE AND ERECT PANICLE 1 (DEP1) gene offering the potential in the breeding of high-yielding rice // Breed. Sci. 2016. V. 66. P. 659–667. https://doi.org/10.1270/jsbbs.16120

  10. Bélanger S., Gauthier M., Jean M. et al. Genomic characterization of the Hordeum vulgare DEP1 (HvDEP1) gene and its diversity in a collection of barley accessions // Euphytica. 2014. V. 1. P. 29–41. https://doi.org/10.1007/s10681-014-1089-1

  11. Wendt T., Holme I., Dockter C. et al. HvDep1 is a positive regulator of culm elongation and grain size in barley and impacts yield in an environment-dependent manner // PLoS One. 2016. V. 11. № 12. P. 1–21. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0168924

  12. Митрофанова О.П. Наследование и характер действия индуцированной мутации Cp (Compact Plant) мягкой пшеницы // Генетика. 1997. Т. 33. № 4. P. 482–488.

  13. Kosuge K., Watanabe N., Melnik V.M. et al. New sources of compact spike morphology determined by the genes on chromosome 5A in hexaploid wheat // Genet. Resour. Crop Evol. 2012. V. 59. № 6. P. 1115–1124. https://doi.org/10.1007/s10722-011-9747-9

  14. Goncharov N.P., Kondratenko E.Y., Kawahara T. Inheritance of dense spike in diploid wheat and Aegilops squarrosa // Hereditas. 2002. V. 137. № 2. P. 96–100.

  15. Katoh K., Standley D.M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: Improvements in performance and usability // Mol. Biol. Evol. 2013. V. 30. № 4. P. 772–780. https://doi.org/10.1093/molbev/mst010

  16. Larsson A. AliView: a fast and lightweight alignment viewer and editor for large datasets // Bioinformatics. 2014. V. 30. № 22. P. 3276–3278. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu531

Дополнительные материалы отсутствуют.