Генетика, 2019, T. 55, № 8, стр. 955-963
Молекулярно-генетическое исследование фенилкетонурии у пациентов из Грузии
П. Гундорова 1, *, И. А. Кузнецова 1, Д. Агладзе 2, Л. Маргвелашвили 3, Е. Клдиашвили 4, О. Квливидзе 4, 5, С. И. Куцев 1, А. В. Поляков 1
1 Медико-генетический научный центр
115522 Москва, Россия
2 Исследовательский институт клинической медицины
0112 Тбилиси, Грузия
3 Детская новая клиника
0159 Тбилиси, Грузия
4 Нью Вижен университет
0159 Тбилиси, Грузия
5 Грузинский фонд генетических и редких заболеваний
0162 Тбилиси, Грузия
* E-mail: p_gundorova@inbox.ru
Поступила в редакцию 25.12.2018
После доработки 11.03.2019
Принята к публикации 19.03.2019
Аннотация
Впервые проведено молекулярно-генетическое исследование полного спектра мутаций при фенилкетонурии (ФКУ) у пациентов из Грузии. Частота ФКУ по данным неонатального скрининга за 15 лет составила 1 : 6111 новорожденных. Обследованы 140 пробандов с входящим диагнозом “фенилкетонурия”. Использованы методы поиска 25 частых мутаций гена PAH, высокопроизводительное секвенирование генов PAH, PTS, GCH1, PCBD1, QDPR, SPR и DNAJC12, метод поиска крупных делеций и дупликаций MLPA. Наиболее частые патогенные варианты, выявленные в ходе исследования: p.Pro281Leu (33.7%), IVS10-11G>A (21.1%), p.Arg261* (8.6%). Мутации обнаружены на 97.8% исследованных хромосом. Два патогенных варианта обнаружены у 135 пробандов (96.4%), подтвержден диагноз “фенилкетонурия”. По результатам предсказания потенциального ответа на терапию сапроптерином, исходя из генотипа, 70% пробандов не будут отвечать на лечение. В ходе исследования не выявлено пациентов с BH4-зависимыми формами гиперфенилаланинемии.
Гиперфенилаланинемии – группа наследственных заболеваний, главной характеристикой которых является повышение в крови или других жидкостях организма уровня фенилаланина (ФА). Фенилкетонурия (MIM# 261600) – наследственная патология обмена веществ, обусловленная дефицитом фермента фенилаланингидроксилазы (ФАГ). Мутации в гене PAH, кодирующем белок ФАГ, – причина 98% всех случаев фенилкетонурии (ФКУ) и гиперфенилаланинемии (ГФА) [1]. Заболевания наследуются аутосомно-рецессивно. Повреждение генов синтеза и обмена тетрагидробиоптерина (BH4), кофактора фермента ФАГ, также вызывает схожие симптомы заболевания. Эта группа патологий носит название BH4-дефицитных ГФА, к развитию этих форм ГФА приводят мутации в генах PTS, QDPR, GCH1, SPR, PCBD1 [2]. Также выделяют не-BH4-ГФА, причиной которой являются мутации в гене DNAJC12 (MIM# 617384) [3], кодирующем белок, участвующий в фолдинге ФАГ.
ФКУ выявляют на неонатальном скрининге новорожденных с целью раннего начала лечения. Диетотерапию применяют для лечения пациентов с РАН-обусловленной ФКУ. Лечение фармакологическим аналогом BH4 сапроптерином применяют у пациентов с BH4-дефицитными ГФА, не-BH4-ГФА [4], а также у пациентов с BH4-чувствительной РАН-обусловленной ФКУ [5]. В последнем случае это возможно если хотя бы одна из двух мутаций гена РАН является мягкой, т.е. остаточная активность белка ФАГ больше 10%. Пациенты с двумя тяжелыми мутациями ФАГ не отвечают на терапию сапроптерином [6]. Таким образом, по генотипу пациента можно предсказать потенциальный ответ на лечение сапроптерином. В России более 55% пациентов с ФКУ потенциально не отвечают на терапию аналогами BH4 [7].
Неонатальный скрининг введен в Грузии с 1992 г. С 1992 по 2004 г. охват новорожденных на скрининге составлял 40%. С 2004 по настоящий момент охват составляет 100%. На сегодняшний день в рамках Государственной программы лечение получают 156 пациентов с ФКУ и ГФА, общее число пациентов с ФКУ и ГФА в Грузии составляет 342 человека (данные на сентябрь 2018 г.).
Молекулярно-генетическое обследование пациентов с ФКУ и ГФА из Грузии ранее не проводилось. Неизвестна доля пациентов с BH4-чувствительной ФКУ (потенциально отвечающих на терапию сапроптерином) и доля BH4-зависимых ГФА среди пациентов с ГФА из Грузии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследуемая выборка
Биологический материал (венозная кровь или сухие пятна крови на фильтре) был получен от 151 пациента с направляющим диагнозом “фенилкетонурия”. Пациенты или их законные представители подписали письменное информированное согласие на проведение исследования и публикацию данных. Также были собраны данные о национальности пациентов до третьего поколения, данные о соблюдении диеты, значения уровня ФА в крови на неонатальном скрининге, ре-тесте, максимальные значения в течение периода наблюдения врача, текущие значения.
В исследовании участвовал 151 пациент из 139 семей. Одна из обследованных семей состояла из трех больных братьев и сына одного из них. В выборку пробандов включен один из братьев и его сын. При подсчете частот мутаций учитывали обе хромосомы отца и одну из хромосом сына, полученную от матери-носительницы ФКУ. Таким образом, в выборку вошло 279 хромосом от больных с ФКУ. Общее число пробандов принято за 140, при этом двое из них являются членами одной семьи.
Поиск частых мутаций РАН
Всем пациентам был выполнен поиск частых мутаций гена РАН, являющийся рутинной процедурой при диагностике пациентов с ГФА и ФКУ из России в лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ “МГНЦ” [8]. Поиск 25 частых мутаций гена РАН (p.Ser16* (с.47_48delCT), p.Leu48Ser, IVS2+5G>A, IVS2+5G>C, p.Arg111*, IVS4+5G>T, EX5del4154ins268, p.Arg158Gln, p.Asp222* (c.664_665delGA), p.Arg243Gln, p.Arg243*, p.Arg252Trp, p.Arg261Gln, p.Arg261*, p.Glu280Lys, p.Pro281Leu, p.Ala300Ser, p.Ile306Val, p.Ser349Pro, IVS10-11G>A, p.Glu390Gly, p.Ala403Val, p.Arg408Trp, p.Tyr414Cys, IVS12+1G>A) выполнен методом аллель-специфичной MLPA.
Методика основана на технологии MLPA и осуществляется в трех реакциях. Мультиплексная лигазная реакция (MLPA) для детекции частых точковых замен гена PAH проводилась на программируемом термоциклере МС2 фирмы “ДНК-технология” (Россия) в два этапа. На первом этапе оригинальные олигонуклеотиды отжигали с исследуемой денатурированной ДНК в присутствии термостабильной ДНК-лигазы в течение одного часа в объеме 5 мкл реакционной смеси следующего состава: 10–50 нг геномной ДНК; по 0.16–10 фмоль/мкл каждого олигонуклеотида (Евроген, Россия); 0.4 единицы активности Pfu-DNA-лигазы (Хеликон, Россия); буфер для лигирования (20 ммоль Tris-HCl, pH 7.5, 20 ммоль KCl, 10 ммоль MgCl2, 0.1% Igepal, 0.01 ммоль rATP, 1 ммоль DTT); 20–30 мкл минерального масла. На втором этапе проводили стандартную ПЦР с олигопраймерами, комплементарными участкам последовательностей, специально синтезированным в олигонуклеотидах. В смесь, в которой предварительно провели лигазную реакцию, добавляли реакционную смесь для ПЦР в объеме 15 мкл (по 0.25 мкмоль каждого оригинального олигопраймера (Евроген); по 200 мкмоль каждого нуклеозидтрифосфата (Хеликон); 1.0 единица активности ДНК-полимеразы Biotaq (“БиоМастер”); буфер для ПЦР (67 ммоль Tris-HCl, 16.6 ммоль (NH4)2SO4, 0.01% Twin-20, рН 8.8)). Результаты исследования оценивали с помощью вертикального электрофореза (20 × 20 см) в 9%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-излучении с длиной волны 312 нм.
Высокопроизводительное секвенирование
Анализ методом высокопроизводительного секвенирования (ВПС) проведен с использованием пользовательской панели “PKU” AmpliSeq™, покрывающей кодирующие последовательности и экзон-интронные соединения генов PAH, PTS, GCH1, PCBD1, QDPR, SPR и DNAJC12. Использовалось программное обеспечение производителя. Панель включает два пула ПЦР праймеров с общим числом 68 и средней длиной ампликонов 158 пн. Для каждого образца была создана библиотека при помощи коммерческого набора Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0 (Life Technologies, США) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы помечали уникальными баркодами (Ion Xpress™ Barcode Adapters Kit, Life Technologies), а затем объединяли в эквимолярных концентрациях. Подготовку библиотек к секвенированию проводили в автоматическом режиме на приборе Ion Chef™. ВПС проводили на приборе Ion S5™. Обработка данных секвенирования проведена с использованием стандартного автоматизированного алгоритма, предлагаемого TermoFisher Scientific (Torrent Suite™), а также программного обеспечения Gene-Talk. Покрытие генов составило: PAH – 100%, PTS – 98%, GCH1 – 87.2%, PCBD1 – 94%, QDPR – 100%, SPR – 82.3%, DNAJC12 – 100%. Оценка клинической значимости (патогенности) выявленных вариантов проводилась на основании российских рекомендаций для интерпретации данных, полученных методами ВПС [9].
Количественный анализ
Дополнительно проводился поиск протяженных делеций/дупликаций гена PAH с использованием набора SALSA MLPA P055-050R PAH probemix (MRC-Holland, Нидерланды). Реакцию проводили по протоколам фирмы-производителя. Для точного количественного анализа данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Coffalyser V8, предоставляемого компанией-разработчиком.
Секвенирование по Сенгеру
Определение нуклеотидной последовательности проводили методом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру продукта ПЦР с прямого и обратного праймеров. В качестве матрицы для сиквенса использовали фрагменты, полученные амплификацией методом ПЦР. Секвенирование проводилось по протоколу фирмы-производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Частота фенилкетонурии в Грузии
Запрошены данные из Центра неонатального скрининга Грузии по выявляемости новорожденных с фенилкетонурией. Для расчета частоты заболевания ФКУ использованы данные о числе новорожденных и числе выявленных ФКУ в 2004–2018 гг., когда охват скрининга составлял 100%. За 2018 г. приведены данные скрининга с января по октябрь включительно. За 15 лет скрининга выявлено 129 новорожденных с ФКУ из 788 349 рожденных детей. Частота ФКУ составила 1 : 6111 новорожденных или 0.16 ± 0.01 на 1000 новорожденных (табл. 1).
Таблица 1.
Данные неонатального скрининга в Грузии в 2004–2018 гг.
| Год | Число новорожденных | Число выявленных ФКУ | Частота заболевания | Частота заболевания в расчете на 1000 человек, ‰ |
|---|---|---|---|---|
| 2004 | 40 388 | 8 | 1 : 5049 | 0.20 ± 0.07 |
| 2005 | 43 574 | 8 | 1 : 5447 | 0.18 ± 0.06 |
| 2006 | 44 965 | 11 | 1 : 4088 | 0.24 ± 0.07 |
| 2007 | 47 464 | 6 | 1 : 7911 | 0.13 ± 0.05 |
| 2008 | 53 519 | 13 | 1 : 4117 | 0.24 ± 0.07 |
| 2009 | 59 053 | 6 | 1 : 9842 | 0.10 ± 0.04 |
| 2010 | 60 021 | 6 | 1 : 10 004 | 0.10 ± 0.04 |
| 2011 | 55 271 | 9 | 1 : 6141 | 0.16 ± 0.05 |
| 2012 | 56 464 | 11 | 1 : 5133 | 0.19 ± 0.06 |
| 2013 | 56 845 | 9 | 1 : 6316 | 0.16 ± 0.05 |
| 2014 | 58 777 | 8 | 1 : 7347 | 0.14 ± 0.05 |
| 2015 | 60 408 | 10 | 1 : 6041 | 0.17 ± 0.05 |
| 2016 | 56 149 | 6 | 1 : 9358 | 0.11 ± 0.04 |
| 2017 | 52 799 | 10 | 1 : 5280 | 0.19 ± 0.06 |
| 2018 | 42 652 | 8 | 1 : 5332 | 0.19 ± 0.07 |
| Итого | 788 349 | 129 | 1 : 6111 | 0.16 ± 0.01 |
Генотипирование больных фенилкетонурией
ДНК 140 пробандов была исследована по следующему алгоритму: 1) поиск 25 частых мутаций гена РАН; 2) поиск мутаций в генах PAH, PTS, GCH1, PCBD1, QDPR, SPR и DNAJC12 с использованием панельного ВПС; 3) поиск крупных делеций и дупликаций гена РАН.
Методом поиска 25 частых мутаций гена PAH были выявлены патогенные варианты на 241 хромосоме из 279 (87.5%) исследованных. Оба патогенных варианта выявлены у 108 пробандов (77.1%), один патогенный вариант – у 25 (17.9%). У семи пробандов (5%) не выявлено частых мутаций гена РАН.
Наиболее частой мутацией среди пациентов из Грузии является вариант p.Pro281Leu, его аллельная частота составила 33.7%. Другие распространенные варианты: IVS10-11G>A – 21.1%, p.Arg261* – 8.6%, p.Leu48Ser – 4.3%, p.Arg261Gln – 3.6%, p.Arg408Trp – 3.2%.
ДНК 32 пробандов, у которых не были выявлены патогенные варианты на обоих аллелях, была исследована методом ВПС с использованием кастомной панели “PKU”. Обнаружены мутации на 32 из 38 исследуемых хромосом. Все выявленные варианты, а также их аллельные частоты, патогенность и остаточная активность ФАГ представлены в табл. 2.
Таблица 2.
Варианты, выявленные в гене РАН среди больных ФКУ из Грузии
| Позиция в кДНК | Позиция в белке | Число хромосом с мутацией | Аллельная частота, % | Патогенность варианта | Остаточная активность ФАГ, % |
|---|---|---|---|---|---|
| c.842C>T | p.Pro281Leu | 94 | 33.7 | п | 2 |
| c.1066-11G>A | p.Gln355_Tyr356ins GlyLeuGln (IVS10-11G>A) |
59 | 21.1 | п | 5 |
| c.781C>T | p.Arg261* | 24 | 8.6 | п | – |
| c.143T>C | p.Leu48Ser | 12 | 4.3 | п | 39 |
| c.782G>A | p.Arg261Gln | 10 | 3.6 | п | 44 |
| c.1222C>T | p.Arg408Trp | 9 | 3.2 | п | 2 |
| c.809G>A | p.Arg270Lys | 7 | 2.5 | п | 11 |
| c.1169A>G | p.Glu390Gly | 7 | 2.5 | п | 62 |
| c.168+5G>C | IVS2+5G>C | 6 | 2.2 | п | – |
| c.838G>A | p.Glu280Lys | 4 | 1.4 | п | 11 |
| c.592_613del22 | p.Tyr198Serfs*136 | 4 | 1.4 | п | – |
| c.754C>T | p.Arg252Trp | 3 | 1.1 | п | 15 |
| c.898G>T | p.Ala300Ser | 3 | 1.1 | п | 65 |
| c.441+1G>A | IVS4+1G>A | 2 | 0.7 | п | – |
| c.442-2913_509+1173del 4154ins268 |
EX5del4154ins268 | 2 | 0.7 | п | – |
| c.727C>T | p.Arg243* | 2 | 0.7 | п | – |
| c.1089delG | p.Lys363Asnfs*37 | 2 | 0.7 | п | – |
| c.1162G>A | p.Val388Met | 2 | 0.7 | п | 28 |
| c.611A>G | p.Tyr204Cys | 2 | 0.7 | п | – |
| c.166delT | p.Phe55Leufs*6 | 2 | 0.7 | п | – |
| c.843-5T>C | IVS7-5T>C | 2 | 0.7 | п | 2 |
| c.728G>A | p.Arg243Gln | 1 | 0.4 | п | 14 |
| c.473G>A | p.Arg158Gln | 1 | 0.4 | п | 10 |
| c.1045T>C | p.Ser349Pro | 1 | 0.4 | п | 1 |
| c.1315+1G>A | IVS12+1G>A | 1 | 0.4 | п | – |
| c.441+5G>T | IVS4+5G>T | 1 | 0.4 | п | – |
| c.331C>T | p.Arg111* | 1 | 0.4 | п | – |
| c.355C>T | p.Pro119Ser | 1 | 0.4 | вп | – |
| c.722G>A | p.Arg241His | 1 | 0.4 | п | 23 |
| c.631C>A | p.Pro211Thr | 1 | 0.4 | п | 72 |
| c.1249T>A | p.Tyr417Asn | 1 | 0.4 | вп | – |
| c.1159T>C | p.Tyr387His | 1 | 0.4 | п | – |
| c.511G>A | p.Gly171Arg | 1 | 0.4 | п | – |
| c.208T>C | p.Ser70Pro | 1 | 0.4 | п | 20 |
| c.529G>A | p.Val177Met | 1 | 0.4 | вп | – |
| c.970-1G>T | IVS9-1G>T | 1 | 0.4 | п | – |
| c.533A>G | p.Glu178Gly | 1 | 0.4 | п | 39 |
| Не обнаружено | 6 | 2.2 | |||
| Всего | 280 | 100.0 | |||
Подтверждена первая и обнаружена вторая мутация у 22 пробандов, подтверждена первая и не обнаружена вторая мутация у трех пробандов, два патогенных варианта выявлены у пяти пробандов, один патогенный вариант выявлен у одного пробанда, патогенных вариантов не обнаружено у одного пробанда.
Из всех выявленных в ходе исследования вариантов 34 являются патогенными, три – вероятно патогенными. Вариантов неопределенного клинического значения, а также ранее неописанных вариантов не выявлено. Пациентам с двумя патогенными или с одним патогенным и одним вероятно патогенным вариантом диагноз “фенилкетонурия” молекулярно-генетическими методами подтвержден – всего 134 пробанда (95.7%).
Пробандам, у которых не выявлены мутации на одном или двух аллелях, проведен поиск крупных делеций и дупликаций методом MLPA. Редких крупных перестроек в гене РАН не обнаружено.
Таким образом, по результатам всех этапов диагностики две мутации в гене РАН обнаружены у 135 пробандов (95.7%), одна мутация – у четырех (2.9%) пробандов, мутаций не обнаружено у одного пробанда (0.7%). С помощью всех представленных в работе методов мутации выявлены на 97.8% исследованных хромосом.
Материал больных сибсов был исследован методом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру отдельных экзонов гена РАН с целью детекции вариантов, выявленных у пробандов из этой семьи. У больных сибсов подтверждены варианты, обнаруженные ранее у обследованных пробандов.
Особенности выборки
В ходе диагностики выявлена семья с больным отцом, матерью-носительницей и больным сыном. При расчете учитывались обе хромосомы отца и одна из хромосом сына, унаследованная от матери, вследствие чего общее число хромосом в выборке нечетное – 279.
При анализе методом ВПС у одного пробанда выявлены три патогенных варианта p.Ser70Pro(;) Val177Met(;)Pro281Leu в гене РАН. Все три варианта верифицированы методом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру. Биологический материал для уточнения цис-транс-положения родители пробанда предоставить отказались, но был получен материал от здорового сибса, у которого не выявлено ни одного из трех вариантов. Для данного пациента не удалось установить взаимного расположения мутаций на хромосомах. Все три варианта указаны в табл. 2, но общее число хромосом включает две хромосомы от данного пробанда. Таким образом в табл. 2 приведено всего 280 мутантных аллелей, но расчет частот произведен на 279 хромосом.
ОБСУЖДЕНИЕ
Особенности спектра мутаций гена РАН
Спектр мутаций в исследуемой выборке включает распространенные в РФ частые мутации гена РАН, но распределение частот мутаций различается. Наиболее часто встречается вариант p.Pro281Leu – аллельная частота 33.7%. В соседних с Грузией странах вариант p.Pro281Leu имеет значительно более низкую частоту: в России 2.9%, в Армении 5.8%, в Иране от 5 до 11% [10–12], в популяции азербайжданцев Ирана не встречается [13]. Ни в одной популяции вариант p.Pro281Leu не встречается с такой высокой частотой, как у грузин.
Второй по распространенности среди пациентов из Грузии вариант IVS10-11G>A (21.1%) в России имеет частоту 2.5%, наиболее широко он распространен в Турции (24.6%) [14] и в Армении (25%) [15].
Третий по распространенности патогенный вариант p.Arg261* наиболее часто выявляется в популяциях, населяющих регионы Кавказа. Среди коренного населения Карачаево-Черкесской республики он является наиболее частым (76.1%) патогенным вариантом в гене РАН [16]. У пациентов из Республики Дагестан аллельная частота p.Arg261* составляет 9.5%, среди пациентов из Чечни p.Arg261* также встречается чаще (неопубликованные данные лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ “МГНЦ”). Вариант p.Arg261* с аллельной частотой 4.9% встречается в выборке пациентов с ФКУ из Ирана [11].
Вариант p.Leu48Ser также встречается у грузин чаще, чем у пациентов из РФ: 4.3 и 1% соответственно. Мутация является мягкой, пациенты с этой мутацией отвечают на терапию сапроптерином. Также отвечают на терапию пациенты с мутацией p.Arg261Gln, которая в выборке грузин и больных из РФ с ФКУ встречается с аллельной частотой 3.6 и 5.8% соответственно.
Наиболее частая у российских больных (51.8%) мутация p.Arg408Trp встречается у грузин с низкой частотой 3.2%.
Патогенный вариант p.Arg270Lys встречается в исследуемой выборке с частотой 2.5%, в то время как в выборке пациентов РФ практически не встречается (частота 0.03% – неопубликованные данные лаб. ДНК-диагностики ФГБНУ “МГНЦ”).
Система поиска частых мутаций гена PAH, изначально предназначенная для диагностики пациентов с ФКУ из РФ, оказалась высоко эффективна для молекулярно-генетической диагностики пациентов из Грузии. Несмотря на то что наиболее частые варианты гена РАН у пациентов из Грузии совпадают с таковыми для российских больных, частоты мутаций различаются коренным образом. Уникальное распределение частот мутаций отражает такие характеристики исследуемой популяции как высокая генетическая и демографическая однородность, частичная изолированность. В то же время распространенные варианты также встречаются у популяций, проживающих на приграничных территориях, что отражает наличие в прошлом миграционных потоков между этими территориями.
Предсказание потенциального ответа на лечение сапроптерином исходя из генотипа
На основании генотипа РАН можно предсказать потенциальный ответ на лечение сапроптерином у пациентов с ФКУ (табл. 3). Если хотя бы на одном аллеле обнаружена мягкая мутация, пациент является потенциальным ответчиком на лечение сапроптерином. У пациентов с двумя тяжелыми мутациями проводить нагрузочные тесты препаратом не имеет смысла. Потенциальными ответчиками на лечение являются 35 (25%) пробандов, не будут отвечать на лечение 98 (70%) пробандов, невозможно предсказать эффект от лечения у семи (5%) пробандов.
Таблица 3.
Спектр клинических проявлений ФКУ у пациентов из Грузии и потенциальный эффект от лечения сапроптерином
| Клиническая форма ФКУ | Все генотипы | Потенциально нечувствительные | Потенциально чувствительные | Неизвестный эффект | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| число человек | доля, % | число человек | доля, % | число человек | доля, % | число человек | доля, % | |
| Классическая ФКУ | 95 | 67.9 | 79 | 80.6 | 14 | 38.9 | 2 | 33.3 |
| Среднетяжелая ФКУ | 25 | 17.9 | 10 | 10.2 | 13 | 36.1 | 2 | 33.3 |
| Мягкая ФКУ | 8 | 5.7 | 1 | 1.0 | 6 | 16.7 | 1 | 16.7 |
| Мягкая ГФА | 4 | 2.9 | 0 | 0.0 | 3 | 8.3 | 1 | 16.7 |
| Не определена | 8 | 5.7 | 8 | 8.2 | 0 | 0.0 | 0 | 0.0 |
| Всего | 140 | 100.0 | 98 | 100.0 | 36 | 100.0 | 6 | 100.0 |
Высокая доля пациентов, которые не будут отвечать на лечение, обусловлена высокой суммарной аллельной частотой тяжелых мутаций – 82.4%. Наиболее распространенные среди грузин варианты являются тяжелыми. Варианты были классифицированы как тяжелые в случае если остаточная активность ФАГ составила меньше 10%, или если по данным литературы мутации “нечувствительны” к терапии сапроптерином. Также в эту группу были отнесены мутации, приводящие к изменениям сайтов сплайсинга, образованию стоп-кодона, в том числе делеции и инсерции, приводящие к сдвигу рамки считывания, а также крупные делеции. Доля мягких мутаций составила 14%. К мягким были отнесены варианты, остаточная активность ФАГ при которых больше 10% или они описаны в литературе как “чувствительные” к терапии сапроптерином.
Доля пациентов, которые потенциально не будут отвечать на лечение, в Грузии (70%) превышает таковую для России (56.9%) [17], которая в свою очередь является выше, чем в странах Западной Европы [18, 19].
Спектр клинических проявлений и гено-фенотипические корреляции
Проанализированы значения ФА в крови исследуемых пациентов, на основании чего классифицирован их клинический диагноз. Данные анализа представлены в табл. 3. Классическая ФКУ зафиксирована у 95 пробандов (67.9%), среднетяжелая ФКУ – у 25 (17.9%), мягкая ФКУ – у восьми (5.7%), мягкая ГФА – у четырех (2.9%). У восьми пробандов не удалось установить клиническую форму ФКУ ввиду недостаточных данных. Высокая доля тяжелых клинических форм – классической и среднетяжелой ФКУ – объясняется высокой суммарной аллельной частотой тяжелых мутаций. Среди больных с двумя тяжелыми мутациями гена РАН, потенциально нечувствительных к сапроптерину, 90.8% имеют тяжелые клинические проявления. Данные гено-фенотипические корреляции согласуются с представлениями о работе фермента ФАГ [17]: отсутствие остаточной активности белка выражается, с одной стороны, в тяжелой клинической картине, с другой – в отсутствии эффекта от лечения сапроптерином.
Среди пациентов с хотя бы одной мягкой мутацией гена РАН (потенциально чувствительных к терапии сапроптерином) наблюдается большее разнообразие клинических проявлений. Вопреки распространенному мнению среди таких пациентов помимо мягких клинических форм присутствует значительная доля классической и среднетяжелой ФКУ. Это обусловлено тем, что некоторые мягкие мутации, например p.Arg261Gln, вызывают формирование тяжелого фенотипа. В физиологических условиях мутантная p.Arg261Gln ФАГ не работает, но при введении дополнительного количества BH4 проявляет остаточную активность. Таким образом, пациенты с мутацией p.Arg261Gln демонстрируют тяжелый фенотип, но являются чувствительными к препаратам сапроптерина.
Национальный состав выборки
Из 140 обследованных пробандов 115 (82.1%) являются грузинами по национальности вплоть до третьего колена. Девять человек – метисы от браков грузин с представителями других этносов. У трех пробандов бабка или дед русские, у одного – осетины, при этом остальные предки являются грузинами. Также в выборке есть одна греко-грузинская семья, одна армяно-грузинская, три грузино-осетинские семьи.
В шести семьях азербайджанского происхождения можно наблюдать различия в спектре мутаций РАН: у пробандов не встречается мутация IVS10-11G>A, мутация p.Pro281Leu выявлена только у одного пробанда в гомозиготном состоянии. В шести семьях армянского происхождения у пробандов мутация IVS10-11G>A встречается на трех хромосомах, мутация p.Pro281Leu – на одной хромосоме. Одна из семей идентифицирует себя с национальностью “ассирийцы”, пробанд имеет гомозиготный генотип p.Pro281Leu. Одна семья в выборке иранского происхождения. Для двух семей нет данных о национальности.
В результате комплексного обследования пациентов с фенилкетонурией из Грузии определена частота фенилкетонурии в Грузии 1 : 6111 новорожденных, описан полный спектр мутаций, характерный для исследуемой популяции для данной нозологии. Выявлены наиболее распространенные варианты гена РАН: p.Pro281Leu (33.7%), IVS10-11G>A (21.1%), p.Arg261* (8.6%).
Выявлены следующие особенности исследуемой популяции в отношении заболевания ФКУ:
1) спектр мутаций гена РАН представлен в основном повторяющимися вариантами с высокой частотой, что позволяет применять экономичные системы поиска частых мутаций для диагностики больных;
2) крупные делеции гена РАН представлены только одним распространенным вариантом, который в свою очередь входит в панель частых мутаций, что позволяет отказаться от методики поиска крупных делеций/дупликаций гена РАН;
3) доля потенциально чувствительных к терапии BH4 пациентов из Грузии составила 25%, доля нечувствительных – 70%; ввиду высокой доли нечувствительных пациентов рекомендуется проводить предварительное генотипирование пациентов в целях экономии ресурсов, требующихся для проведения нагрузочного теста BH4.
Примененный в работе диагностический подход оказался высокоэффективным по соотношению полученного результата и затраченных материальных и временных ресурсов.
Работа выполнена в рамках Государственного задания Минобрнауки России.
Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.
От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Список литературы
Blau N., Shen N., Carducci C. Molecular genetics and diagnosis of phenylketonuria: state of the art // Expert. Rev. Mol. Diagn. 2014. V. 14. № 6. P. 655–671. https://doi.org/10.1586/14737159.2014.923760
Economou-Petersen E., Henriksen K.F., Guldberg P. et al. Molecular basis for nonphenylketonuria hyperphenylalaninemia // Genomics. 1992. V. 14. № 1. P. 1–5.
van Spronsen F.J., Himmelreich N., Rufenacht V. et al. Heterogeneous clinical spectrum of DNAJC12-deficient hyperphenylalaninemia: from attention deficit to severe dystonia and intellectual disability // J. Med. Genet. 2017. https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2017-104875
de Sain-van der Velden M.G.M., Kuper W.F.E., Kuijper M.A. et al. Beneficial effect of BH4 treatment in a 15-year-old boy with biallelic mutations in DNAJC12 // JIMD Rep. 2018. https://doi.org/10.1007/8904_2017_86
Kure S., Hou D.C., Ohura T. et al. Tetrahydrobiopterin-responsive phenylalanine hydroxylase deficiency // J. Pediatr. 1999. V. 135. № 3. P. 375–378.
Muntau A.C., Roschinger W., Habich M. et al. Tetrahydrobiopterin as an alternative treatment for mild phenylketonuria // N. Engl. J. Med. 2002. V. 347. № 26. P. 2122–2132. https://doi.org/10.1056/NEJMoa021654
Гундорова П., Степанова А.А., Бушуева Т.В. и др. Генотипирование больных фенилкетонурией из различных регионов Российской Федерации с целью определения чувствительности к препаратам BH4 // Генетика. 2017. Т. 53. № 6. 732–739.
Гундорова П., Степанова А.А., Щагина О.А. и др. Результаты использования новых медицинских технологий “Детекция основных точковых мутаций гена PAH методом мультиплексной лигазной реакции” и “Детекция десяти дополнительных точковых мутаций гена PAH методом мультиплексной лигазной реакции” в ДНК-диагностике фенилкетонурии // Мед. генетика. 2016. Т. 15. № 2. С. 29–36.
Рыжкова О.П., Прохорчук Е.Б., Коновалов Ф.А. и др. Руководство по интерпретации данных, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) // Мед. генетика. 2017. Т. 7. С. 4–17.
Biglari A., Saffari F., Rashvand Z. et al. Mutations of the phenylalanine hydroxylase gene in Iranian patients with phenylketonuria // Springerplus. 2015. V. 4. P. 542. https://doi.org/10.1186/s40064-015-1309-8
Razipour M., Alavinejad E., Sajedi S.Z. et al. Genetic study of the PAH locus in the Iranian population: familial gene mutations and minihaplotypes // Metab. Brain. Dis. 2017. V. 32. № 5. P. 1685–1691. https://doi.org/10.1007/s11011-017-0048-7
Alibakhshi R.P., Moradi K.M., Biglari M.M. et al. Spectrum of phenylalanine hydroxylase gene mutations in Hamadan and Lorestan provinces of Iran and their associations with variable number of tandem repeat alleles // Iran. J. Med. Sci. 2018. V. 43. № 3. P. 318–323.
Bagheri M., Rad I.A., Jazani N.H. et al. Mutation analysis of the phenylalanine hydroxylase gene in Azerbaijani population, a report from West Azerbaijan province of Iran // Iran. J. Basic. Med. Sci. 2015. V. 18. № 7. P. 649–653.
Dobrowolski S.F., Heintz C., Miller T. et al. Molecular genetics and impact of residual in vitro phenylalanine hydroxylase activity on tetrahydrobiopterin responsiveness in Turkish PKU population // Mol. Genet. Metab. 2011. V. 102. № 2. P. 116–121. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2010.11.158
Kostandyan N., Britschgi C., Matevosyan A. et al. The spectrum of phenylketonuria genotypes in the Armenian population: identification of three novel mutant PAH alleles // Mol. Genet. Metab. 2011. V. 104. Suppl. P. S93–S96. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2011.08.006
Гундорова П., Степанова А.А., Макаов Р.А. и др. Особенности спектра мутаций в гене PAH у больных фенилкетонурией из Карачаево-Черкесской Республики // Генетика. 2016. Т. 52. № 12. С. 1448–1457. https://doi.org/10.7868/S0016675816110047
Гундорова П., Кузнецова И.А., Куцев С.И. и др. Результаты программы генотипирования больных фенилкетонурией и гиперфенилаланинемией // Мед. генетика. 2018. Т. 17. № 12 (198). С. 14–24. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2018.12.14-24
Zurfluh M.R., Zschocke J., Lindner M. et al. Molecular genetics of tetrahydrobiopterin-responsive phenylalanine hydroxylase deficiency // Hum. Mutat. 2008. V. 29. № 1. P. 167–175. https://doi.org/10.1002/humu.20637
Trefz F., Lichtenberger O., Blau N. et al. Tetrahydrobiopterin (BH4) responsiveness in neonates with hyperphenylalaninemia: a semi-mechanistically-based, nonlinear mixed-effect modeling // Mol. Genet. Metab. 2015. V. 114. № 4. P. 564–569.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Пн.-пт.: 10.00-19.00