Генетика, 2020, T. 56, № 1, стр. 119-124

Аминогликозидфосфотрансфераза AphSR2 Streptomyces rimosus ATCC 10970: зависимость устойчивости к антибиотикам от серин-треониновых протеинкиназ PkSR1 и PkSR2

Н. Н. Рудакова 1*, М. Г. Алексеева 1, Н. В. Захаревич 1, Д. А. Мавлетова 1, В. Н. Даниленко 1

1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
119991 Москва, Россия

* E-mail: natachka92@mail.ru

Поступила в редакцию 10.04.2019
После доработки 10.06.2019
Принята к публикации 12.06.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

При секвенировании в геноме штамма Streptomyces rimosus АТСС 10970 было аннотировано 14 генов аминогликозидфосфотрансфераз: aphSR1aphSR14. Ранее нами было показано, что гены aphVIII (aphSR5) и aph(3'')-Id (aphSR3) при клонировании в E. coli обусловливают устойчивость к канамицину, неомицину, паромомицину и стрептомицину. Установлено, что устойчивость к антибиотикам AphVIII повышается после фосфорилирования по сайту Ser146 в активационной петле фермента серин-треониновыми протеинкиназами (СТПК). При клонировании гена aphSR2 в E. coli показано, что он обусловливает устойчивость к неомицину и гигромицину. В представленной работе исследовали влияние генов СТПК на повышение устойчивости E. coli к аминогликозидным антибиотикам при совместном клонировании гена aphSR2 и генов СТПК (pkSR1 и pkSR2), локализованных в одном кластере генома S. rimosus АТСС 10970. Установлено, что в совместной конструкции E. coli/aphSR2/pkSR1 происходит повышение уровня устойчивости к неомицину в 2 раза. Представленные данные являются вторым примером влияния СТПК на модуляцию уровня устойчивости к аминогликозидным антибиотикам у бактерий рода Streptomyces.

Ключевые слова: Streptomyces rimosus, ген аминогликозидфосфотрансферазы (aph), серин-треониновые протеинкиназы (СТПК), спектр и уровень устойчивости к антибиотикам.

Способность микроорганизмов развивать устойчивость к действию антибиотиков известна с момента открытия противомикробных агентов [1]. В последние десятилетия сформировано понятие “резистом”, включающее совокупность генов устойчивости, характерную для конкретного бактериального сообщества. По данным Antibiotic Resistance Genes Database (ARDB) в настоящее время насчитывается 23 137 генов устойчивости. Ингибирование генов устойчивости делает возможным использование существующих антибиотиков против резистентных бактерий [2].

Впервые устойчивость бактерий к аминогликозидным антибиотикам выявлена в 1952 г. В начале 70-х гг. была выдвинута гипотеза о происхождении генов лекарственной устойчивости, в частности аминогликозидфосфотрансфераз, из почвенных микроорганизмов – продуцентов антибиотиков [3]. В 1983 г. были идентифицированы и секвенированы гены аминогликозид-3'-фосфотрансфераз на плазмидах и мобильных элементах у клинических штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий [4].

Известно, что гены устойчивости к антибиотикам гипотетически берут начало в бактериях – продуцентах антибиотиков, относящихся к роду Streptomyces. При аннотации геномов у актинобактерий выявлено от 4 до 14 генов аминогликозидфосфотрансфераз. Однако функции генов, аннотированных как aph в секвенированных геномах (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/), в настоящее время недостаточно изучены [5].

При секвенировании в геноме штамма Streptomyces rimosus subsp. rimosus АТСС 10970 (продуценте окситетрациклина) [6] идентифицировано 14 генов, аннотированных как aph, которым нами были присвоены названия aphSR1aphSR14. Нами был проведен сравнительный и филогенетический анализ аминокислотных последовательностей продуктов 14 aph-генов с известными ранее aph-генами из клинических изолятов и штаммов-продуцентов аминогликозидных антибиотиков, относящихся к семи подсемействам. По результатам проведенного анализа AphSR5 (AphVIII) относится к подсемейству Aph(3'), AphSR3 – к подсемейству Aph(3''), а AphSR2 расположена на одной ветви с Aph(7'')-Ia.

Ранее нами в штамме S. rimosus АТСС 10970 с высоким уровнем устойчивости к аминогликозидам были идентифицированы и охарактеризованы две аминогликозидфосфотрансферазы. AphSR5 (Aph(3')-VIII) обусловливает устойчивость к канамицину, неомицину и паромомицину; важной особенностью AphVIII S. rimosus является зависимость активности фермента от уровня его фосфорилирования серин-треониновыми протеинкиназами; получена 3D-структура AphVIII (код PDB 4H05) [710]. При клонировании гена aphSR3 (aph(3'')-Id) в E. coli установлено, что он обусловливает устойчивость к стрептомицину [11].

Объектом данного исследования является аминогликозидфосфотрансфераза AphSR2. Согласно проведенному филогенетическому анализу, AphSR2 расположена на одной ветви с Aph(7'')-Ia, но бутстреп-поддержка соответствующего узла дерева невелика (<60%), тем не менее предоставляется возможным отнести их к подсемейству Aph(7''). Вместе с этим сравнительный анализ AphSR2, при помощи программы SAS (https://www.ebi.ac.uk/ thornton-srv/databases/sas/), с известными 3D-структурами показал сходство AphSR2 с 3D-структурой трансферазы Rv3168 (PDB ID – 3ATS) штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv (процент идентичности 31.2%).

Анализ выравнивания аминокислотных последовательностей, проведенный по программе Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/). показал, что последовательность AphSR2 имеет значительно больше общих консервативных аминокислотных остатков с последовательностью Rv3168, чем с аминогликозидфосфотрансферазой Aph(7'')-Ia (рис. 1,а).

Рис. 1.

Характеристика кластера генов aphSR2 и pkSR1, pkSR2 штамма S. rimosus АТСС 10970 и кодируемых ими белков. а – сравнение аминокислотной последовательности AphSR2 с последовательностями APH(7'')-Ia и Rv3168 (остатки консервативные между всеми тремя последовательностями выделены черным цветом, между двумя – серым); б – транскрипционная организация кластера генов aphSR2 и pkSR1, pkSR2 штамма S. rimosus АТСС 10970 (hp – hypothetical protein, citB – putative two-component system response transcriptional regulator, pdha1 – pyruvate dehydrogenase E1); в – электрофорез растворимой фракции белков штамма E. coli BL21(DE3), содержащего плазмиды: 1 – pET32a, 2 – pET32a:aphSR2; 3 – pET32a:pkSR1, 4 – pET32a:aphSR2 + pkSR1, 5 – pET32a:pkSR2, 6 – pET32a:aphSR2 + pkSR2. М – маркер молекулярной массы белков SM0441 (Fermentas, Литва).

Рис. 1.

Окончание.

С использованием баз данных NCBI и UniProt (http://www.uniprot.org/) установлено, что ген aphSR2 расположен в одном кластере с генами двух серин-треониновых протеинкиназ (СТПК), которым нами были присвоены следующие названия (по номерам локусов генов): SRIM_07563 – pkSR1, SRIM_07568 – pkSR2. Транскрипция гена pkSR1 происходит в том же направлении, как и гена aphSR2, рис. 1,б.

Ранее нами была проведена классификация СТПК грамположительных бактерий, в основу ее лег анализ сигнатуры из девяти вариабельных аминокислотных остатков, боковые цепи которых экспонированы в область связывания аденина. По итогам классификации все СТПК были разделены на 20 групп. По предложенной классификации СТПК, PkSR1 относится к группе IIa, а PkSR2 – к группе IIb [12, 13]. Ортологами данных СТПК являются киназы Streptomyces coelicolor Pk13 (идентичность по программе BLAST 89%) и Pk12 (идентичность по программе BLAST 93%) соответственно [14]. Обсуждаемые киназы S. coelicolor расположены на хромосоме так же, как и киназы S. rimosus – рядом, но направлены в разные стороны. Ни одна из 11 описанных и хорошо изученных СТПК M. tuberculosis не является ортологом рассматриваемых СТПК S. rimosus.

В рамках настоящей работы экспериментально изучалось влияние генов СТПК pkSR1 и pkSR2 на устойчивость E. coli BL21(DE3), содержащих ген aphSR2, к аминогликозидным антибиотикам, в связи с чем проводили совместное клонирование данных генов в составе экспрессионного вектора pET32a.

Белок PkSR1 состоит из 573 аминокислотных остатков, доменная структура белка представлена каталитическим доменом (19–288 а/к) и PASTA доменом (503–569 а/к). Белок PkSR2 состоит из 516 аминокислотных остатков, доменная структура белка представлена каталитическим доменом (5–265 а/к).

На первом этапе проводили клонирование каталитических доменов протеинкиназ в E. coli. Амплификацию генов pkSR1 и pkSR2 осуществляли с геномной ДНК штамма S. rimosus методом ПЦР (набор РСК-100 фирмы “Dialat Ltd.” на приборе PTC-0150 (MJ Research, Inc.)) с использованием олигонуклеотидов PkSR1-N (5'-tcgcggatcccgctaccagctccgtgatct-3') и PkSR1-C (5'-tcgcggatcccgctaccggctcacgcgccg-3') для гена pkSR1 и олигонуклеотидов PkSR2-N (5'-tcgcggatcccgctaccggctcacgcgccg-3') и PkSR2-C для гена pkSR2 (5'-ccgcaagcttgcgcatctcctccgcggtctg-3'). Полученные фрагменты клонировали по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII в экспрессионный вектор pET28a (селективный маркер Km). Затем полученные гибридные плазмиды pET28a:pkSR1 и 28a:pkSR2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции XbaI и XhoI и встраивали по указанным сайтам рестрикции в экспрессионный вектор pET32a (селективный маркер ампициллин). В результате клонирования получены гибридные плазмиды pET32aM:pkSR1 и pET32aM:pkSR2.

Затем проводили клонирование гена aphSR2 в плазмиды pET32aM:pkSR1 и pET32aM:pkSR2 по сайту эндонуклеазы рестрикции XbaI. Для контроля было проведено клонирование гена aphSR2 в плазмиду pET32a по сайту эндонуклеазы рестрикции XbaI. Амплификацию гена aphSR2 проводили с плазмидной ДНК pET16b:aphSR2 с использованием олигонуклеотидов T7prom (5'-ttaatacgactcactatagg-3') и AphSR2C-XbaI (5'-agcctctagatcactccgtgaaggccgcc-3'). Скрининг клонов проводили при помощи ПЦР с использованием олигонуклеотидов T7prom и AphC-XbaI, что позволяло отбирать клоны с требуемой ориентацией. Полученные плазмиды обозначены pET32aM:aphSR2/pkSR1, pET32aM:aphSR2/pkSR2 и pET32a:aphSR2.

Для изучения экспрессии генов aphSR2, pkSR1 и pkSR2 в E. coli полученными гибридными плазмидами трансформировали компетентные клетки штамма E. coli BL21(DE3) (F, dcm, ompT, hsdS(${\text{r}}_{{\text{B}}}^{--}{\text{m}}_{{\text{B}}}^{--}$), gal λ (DE3)) (Novagen) и выращивали в жидкой среде LB при 37°С до оптической плотности 0.6 (~2 ч), затем индуцировали экспрессию добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида (ИПТГ) до финальной концентрации 1.3 мМ. Далее проводили культивирование при 28°С в течение 18 ч, клетки осаждали центрифугированием (5000 об./мин, 10 мин, 4°С) и суспендировали в Sample буфера и анализировали с помощью SDS-электрофореза в 12.5%-ном ПААГ по методу Лэммли. В качестве контроля использовали фракции белков штаммов E. coli, содержащих плазмиду pET32a без вставки. Анализ электрофореграммы показал экспрессию белков с молекулярными массами 33, 32 и 41 кДа, что соответствует расчетным молекулярным массам белков каталитических доменов протеинкиназ PkSR1 и PkSR2 и массе белка AphSR2, рис. 1,в.

На следующем этапе работы проводили тестирование спектра устойчивости к аминогликозидным антибиотикам методом стандартных дисков штаммов E. coli BL21(DE3), содержащих все полученные рекомбинантные плазмиды. Тестирование спектра устойчивости проводилось с использованием бумажных дисков с аминогликозидными антибиотиками: канамицином (30 мкг/диск), неомицином (30 мкг/диск), амикацином (30 мкг/диск), стрептомицином (10 мкг/диск), гентамицином (10 мкг/диск), тобрамицином (10 мкг/диск), сизомицином (10 мкг/диск), нетилмицином (10 мкг/диск), изепамицином (30 мкг/диск) и гигромицином (100 мкг/диск). Учет результатов проводили после инкубирования в течение 16–18 ч при 37°C.

Проведенные исследования по определению зоны подавления роста вокруг бумажных дисков показали, что ген aphSR2 обусловливает устойчивость E. coli BL21(DE3) к неомицину и гигромицину (табл. 1). В случае совмещения генов aphSR2 и pkSR1 в одном векторе уровень устойчивости E. coli к неомицину увеличивался, а в случае совмещения генов aphSR2 и pkSR2 не изменялся. Совмещение генов aphSR2 и СТПК (pkSR1 или pkSR2) не оказывало влияния на устойчивость к гигромицину. В качестве контроля были проведены исследования по влиянию генов СТПК на устойчивость E. coli BL21(DE3), данные гены не оказывали влияния на устойчивость к неомицину, но повышали чувствительность к гигромицину. Эти результаты позволяют предположить, что ген aphSR2 может быть кандидатом устойчивости к гигромицину у S. rimosus. Согласно литературным данным, aph(7'')-Ia обусловливает устойчивость к гигромицину В [15], а rv3168 – к канамицину [16]. В отличие от rv3168 и aph(7'')-Ia, aphSR2 показал влияние на устойчивость клеток E. coli к неомицину и гигромицину.

Таблица 1.  

Изменение уровня устойчивости к аминогликозидным антибиотикам при совместной экспрессии в E. coli BL21(DE3) генов aphSR2, pkSR1 и pkSR2

Проверяемый антибиотик* Исследуемые конструкции
BL21(DE3) BL21(DE3) pET32a BL21(DE3) pET32a:aphSR2 BL21(DE3) pET32a:aphSR2 + pkSR1 BL21(DE3) pET32a:pkSR1 BL21(DE3) pET32a:aphSR2 + pkSR2 BL21(DE3) pET32a:pkSR2
Неомицин
(30 мкг/диск)
19 ± 0.61 19 ± 0.47 16 ± 0.59 12.5 ± 0.71 19 ± 0.61 16 ± 0.54 19 ± 0.55
Канамицин
(30 мкг/диск)
21 ± 0.50 21 ± 0.55 21 ± 0.80 21 ± 0.56 21 ± 0.51 21 ± 0.55 21 ± 0.73
Гигромицин (100 мкг/диск) 15 ± 0.53 15 ± 0.59 12 ± 0.47 14 ± 0.44 17 ± 0.55 16.5 ± 0.58 18 ± 0.53

Примечание. Приведены усредненные результаты трех независимых измерений, данные представлены в виде: среднее значение ± σ (сигма, среднее отклонение). Достоверность различий между выборками оценивали по t-критерию Стьюдента. Уровень значимости отличий между выборками составлял 0.05 (программа Statistica v6). * Чувствительность к антибиотикам, исследованная методом наложения дисков.

Далее проводили тестирование уровня устойчивости к неомицину и гигромицину методом анализа минимальных ингибирующих концентраций (МИК). Для анализа использовали клоны трансформантов E. coli BL21(DE3), содержащих рекомбинантные плазмиды pET32a, pET32a:aphSR2 и pET32aM:aphSR2/pkSR1. Отдельные колонии собирали и переносили в пробирки, содержащие 2 мл бульона LB, после чего выращивали ночную культуру до оптической плотности OD625 = 0.3, а затем разбавляли средой LB, получая конечную плотность 105–106 КОЕ/мл. К каждой из серии пробирок, содержащих двукратные разведения неомицина в 2 мл среды LB, добавляли 100 мкл культуры клеток (ИПТГ, 100 мкМ), чтобы индуцировать экспрессию генов aphSR2 и pkSR1. После инкубации культур при комнатной температуре (~25°С) и 250 об./мин в течение 18 ч значения МИК (минимальная ингибирующая концентрация) определяли как самую низкую концентрацию неомицина или гигромицина, которая приводила к полному ингибированию роста (что определялось спектрофотометрически при OD625).

В экспериментах по определению МИК методом серийных разведений, для контрольного штамма E. coli BL21(DE3) концентрация неомицина составляла 8 мкг/мл; индукция экспрессии рекомбинантного белка увеличивала МИК до 16 мкг/мл, совместная экспрессия генов pkSR1 и aphSR2 обусловливает повышение МИК до 32 мкг/мл. Таким образом, было установлено, что при совместном клонировании в E. coli aphSR2 обусловливает устойчивость к неомицину, которая моделируется pkSR1. МИК гигромицина для контрольного штамма E. coli BL21(DE3) составляла 100 мкг/мл, это указывает на устойчивость штамма E. coli к гигромицину, что затрудняет измерение МИК [17].

Таким образом, AphSR2 является второй аминогликозидфосфотрансферазой стрептомицетов, и в частности S. rimosus, для которой полученные данные показывают, что уровень устойчивости повышается СТПК и является аккумулятивным результатом их совместной экспрессии в E. coli. Полученные результаты подтверждают выдвинутую гипотезу о роли сигнал-передающих систем почвенных бактерий в модуляции экспрессии генов устойчивости к антибиотикам у актинобактерий [18].

В рамках дальнейшей работы предполагаются выделение рекомбинантных белков AphSR2, PkSR1 и PkSR2, изучение in vitro уровня и сайтов фосфорилирования исследуемой аминогликозидфосфотрансферазы и влияния фосфорилирования на активность фермента.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 17-04-01106 от 6 апреля 2017 г.) и в рамках Государственного задания “Генетические технологии в биологии, медицине, сельскохозяйственной и природохозяйственной деятельности” (№ 0112-2019-0002 2019 г.).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Davies J. Antibiotic resistance and the golden age of microbiology // Ups. J. Med. Sci. 2014. V. 119. № 2. P. 65–67. https://doi.org/10.3109/03009734.2014.898718

  2. Gerard D., Wright G.D. The antibiotic resistome: the nexus of chemical and genetic diversity // Nat. Rev. Microbiol. 2007. V. 5. P. 175–186. https://doi.org/10.1038/nrmicro1614

  3. Davies J. Bacterial resistance to aminoglycoside antibiotics // J. Infect. Dis. 1971. V. 124. Suppl. S7–S10.

  4. Wright G.D. Molecular mechanisms of antibiotic resistance // Chem. Commun. (Camb.). 2011. V. 47. № 14. P. 4055–4061. https://doi.org/10.1039/c0cc05111j

  5. Anderson A.S., Clark D.J., Gibbons P.H. et al. The detection of diverse aminoglycoside phosphotransferases within natural populations of actinomycetes // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 29. № 2. P. 60–69.

  6. Pethick F.E., MacFadyen A.C., Tang Z. et al. Draft genome sequence of the oxytetracycline-producing bacterium Streptomyces rimosus ATCC 10970 // Genome Announc. 2013. V. 1. № 2. P. e00063-13. https://doi.org/10.1128/genomeA.00063-13

  7. Сизова И.А., Хегеманн П., Фурманн М. и др. Аминогликозид-3'-фосфотрансфераза VIII из Streptomyces rimosus: сравнение с аминогликозид-3'-фосфотрансферазами из штаммов-продуцентов аминогликозидов и с эукариотическими протеинкиназами // Мол. биология. 2002. Т. 36. № 1. С. 18–25.

  8. Елизаров С.М., Сергиенко О.В., Сизова И.А. и др. Зависимость активности аминогликозид-3'-фосфотрансферазы типа VIII от серин-треонинпротеинкиназ у Streptomyces rimosus // Мол. биология клетки. 2005. Т. 39. № 2. С. 1–9.

  9. Елизаров С.М., Алексеева M.Г., Новиков Ф.Н. и др. Идентификация сайтов фосфорилирования аминогликозидфосфотрансферазы VIII Streptomyces rimosus // Биохимия. 2012. Т. 77. № 11. С. 1504–1512. https://doi.org/10.1134/S0006297912110041

  10. Boyko K.M., Gorbacheva M.A., Korzhenevskiy D.A. et al. Structural characterization of the novel aminoglycoside phosphotransferase AphVIII from Streptomyces rimosus with enzymatic activity modulated by phosphorylation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2016. V. 477. № 4. P. 595–601. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2016.06.097

  11. Алексеева М.Г., Рудакова Н.Н., Захаревич Н.В. и др. Новый ген аминогликозидфосфотрансферазы aph(3'')-Id из Streptomyces rimosus АТСС10970, кодирующий устойчивость к стрептомицину // Генетика. 2018. Т. 54. № 10. С. 1228–1232. https://doi.org/10.1134/S001667581810003X

  12. Zakharevich N.V., Osolodkin D.I., Artamonova I.I. et al. Signatures of the ATP-binding pocket as a basis for structural classification of the serine/threonine protein kinases of gram-positive bacteria // Proteins. 2012. V. 80. № 5. P. 1363–1376. https://doi.org/10.1002/prot.24032

  13. Захаревич Н.В., Даниленко В.Н. Серин-треониновые протеинкиназы бактерий – потенциальная мишень для регуляции состава микробиоты человека // Вестн. РГМУ. 2017. № 2. С. 20–29.

  14. Petrícková K., Petrícek M. Eukaryotic-type protein kinases in Streptomyces coelicolor: variations on a common theme // Microbiology. 2003. V. 149. № 7. P. 1609–1621. https://doi.org/10.1099/mic.0.26275-0

  15. Berthold P., Schmitt R., Mages W. An engineered Streptomyces hygroscopicus aph 7'' gene mediates dominant resistance against hygromycin B in Chlamydomonas reinhardtii // Protist. 2002. V. 153. № 4. P. 401–412. https://doi.org/10.1078/14344610260450136

  16. Kim S., Nguyen C.M., Yeo S.J. et al. Cloning, expression, purification, crystallization and X-ray crystallographic analysis of Rv3168 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv // Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 2011. V. 67. № 5. P. 627–629. https://doi.org/10.1107/S1744309111010487

  17. Rao R.N., Allen N.E., Hobbs J.N. Genetic and enzymatic basis of hygromycin B resistance in Escherichia coli // Antimicrob. Agents Chemother. 1983. V. 24. № 5. P. 689–695.

  18. Danilenko V.N., Mironov V.A., Elizarov S.M. Calcium as a regulator of intracellular processes in actinomycetes: A review // Appl. Biochem. and Microbiol. 2005. V. 41. № 4. P. 319–329.

Дополнительные материалы отсутствуют.