Генетика, 2020, T. 56, № 10, стр. 1215-1217

Полиморфизм последовательностей ДНК агробактериального происхождения в сортах Nicotiana tabacum

Г. В. Хафизова 1*, Т. В. Матвеева 1

1 Санкт-Петербургский государственный университет
199034 Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: galina.khafizova@gmail.com

Поступила в редакцию 12.12.2019
После доработки 24.12.2019
Принята к публикации 14.01.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Nicotiana tabacum – один из видов растений, геном которого содержит последовательности клеточной Т-ДНК (Т-ДНК агробактерий, полученной растениями в ходе эволюции в результате горизонтального переноса генов). Внутри вида N. tabacum выделяют пять подвидов и множество сортов, филогенетические отношения сортов в пределах вида не установлены. Несмотря на разнообразие фенотипов, для сортов N. tabacum характерен низкий уровень генетического разнообразия, что осложняет уточнение внутривидовой филогении. В данной работе по результатам сравнительного анализа фрагментов клТ-ДНК ТА и ТВ, и гена РМТ2 у 11 сортов N. tabacum предложен новый маркер для изучения филогении вида N. tabacum. Показано, что для последовательностей агробактериального происхождения, приобретенных растениями в результате горизонтального переноса генов, характерны те же механизмы эволюции, что и для растительных последовательностей. Исходя из чего клТ-ДНК (а именно – ТА) могут быть использованы в качестве филогенетического маркера для вида N. tabacum.

Ключевые слова: горизонтальный перенос генов, Nicotiana tabacum, клТ-ДНК.

Клеточная Т-ДНК (клТ-ДНК) – это последовательности, гомологичные агробактериальным Т-ДНК, полученные растениями в результате горизонтального переноса генов. На сегодняшний день клТ-ДНК-подобные последовательности обнаружены в геномах представителей более чем 20 видов растений [1], из них наиболее хорошо изучены клТ-ДНК в геномах растений рода Nicotiana [24]. Один из самых широко используемых видов этого рода – Nicotiana tabacum (культурный табак) – аллотетраплоид, образовавшийся в результате гибридизации видов N. sylvestris и N. tomentosiformis. Геном Nicotiana tabacum содержит три различающиеся по составу и возрасту клТ-ДНК (ТА, ТВ, ТD) (рис. 1,а), полученные от родительского вида N. tomentosiformis. Самой старой из них является ТВ, а самой молодой – ТА [4].

Рис. 1.

КлТ-ДНК в геномах N. tabacum. а – схемы строения трех клТ-ДНК, слева жирным шрифтом указаны названия клТ-ДНК, стрелками показана ориентация генов, курсивом указаны названия генов; б – схема структуры последовательности ТА из N. tomentosiformis (KJ599826), цифрами отмечены координаты в контиге, черными прямоугольниками отмечен ген orf13, центральная часть не показана. (1) клТ-ДНК ТА без делеции: ранее описана в сортах Wisconsin 38, Havana 425, в данной работе обнаружена в сортах: Vuelta abajo, Suifu, BlackIndian, Havana 307, Турецкий, Ориенталь. (2) клТ-ДНК ТА с делецией, белым прямоугольником отмечена последовательность неизвестного происхождения длиной 42 пн, расположенная между двумя фрагментами orf13, в данной работе обнаружена в сортах Брянский 91 и Virginia x Berley 38. Ранее описана у сортов Basma Drama, Samsoun, и Xanthi; в: (1) – фрагменты, полученные с использованием праймеров F и innR, (2) – фрагменты, полученные с использованием праймеров F и R, (3) – схема расположения праймеров.

В настоящее время внутри вида N. tabacum выделяют пять подвидов и множество (точное число неизвестно) сортов, филогенетические отношения сортов в пределах вида N. tabacum не установлены, многие сорта имеют неизвестное происхождение [5]. Уточнение филогении вида осложнено тем, что при широкой вариабельности фенотипов для сортов N. tabacum наблюдается низкий уровень генетического разнообразия, описанный методами RFLP, RAPD, AFLP [5]. В то же время для ряда сортов были показаны структурные вариации в последовательностях клТ-ДНК. У сортов Basma Drama, Samsoun, и Xanthi в центральной части вставки ТА имеется протяженная (9684 пн) делеция, тогда как у других – Wisconsin 38 и Havana 425 – подобной делеции в ТА нет (рис. 1,б) [4].

Мы провели сравнительный анализ растительных генов и клТ-ДНК в геномах ряда сортов N. tabacum с целью уточнить филогению внутри вида. Для сравнения были использованы три подхода: анализ полиморфизма гена PMT2 растительного происхождения, анализ консервативности клТ-ДНК, то есть поиск и учет однонуклеотидных замен и небольших (1–3 нуклеотида) вставок/выпадений нуклеотидов, анализ структуры (конкретного порядка генов и межгенных спейсеров) TA.

В качестве гена растительного происхождения был выбран PMT2 – ген путресцин-N-метилтрансферазы, один из четырех РМТ-генов – ключевых участников синтеза никотина. PMT2 содержит делецию 99 пн в первом экзоне, благодаря чему его можно достоверно отличить от PMT1, PMT3 и PMT4. Материалом для анализа послужили секвенированные геномы сортов N. tabacum K326 (NCAA00000000.1, AWOJ00000000.1), TN90 (AYMY00000000.1) и Basma Xanthi (AWOK00000000.1). Нуклеотидные последовательности гена PMT2 как экзонов так и интронов идентичны у сортов K326 и TN90, и отличаются от сорта Basma Xanthi двумя нуклеотидными заменами в первом и в шестом экзонах соответственно, а в двух интронах содержатся по два выпадения нуклеотидов (прилож. 1).

В качестве клТ-ДНК были выбраны участки межгенных последовательностей и генов, сохранивших рамку считывания. В ТА для анализа был выбран ген rolC и последовательность между rolC и orf13, в ТВ – ген orf14 и последовательность между orf14 и mis (рис. 1). Помимо имеющихся в базе данных NCBI сортов K326, TN90 и Basma Xanthi в анализ были взяты еще восемь сортов: Vuelta abajo, Suifu, BlackIndian, Havana 307, Турецкий, Ориенталь, Брянский 91 и Virginia x Berley 38. Все изученные фрагменты, как гены так и межгенные спейсеры, имеют сходство на уровне 99–100%.

Анализ центральных участков фрагментов ТА 11 сортов N. tabacum, позволил разделить все исследованные образцы на две группы: несущие делецию (Брянский 91, Virginia x Berley 38, Basma Xanthi) и сорта без делеции в центральном участке ТА (Vuelta abajo, Suifu, BlackIndian, Havana 307, Турецкий, Ориенталь, Wisconsin 38, Havana 425). Положение делеции у сортов Брянский 91, Virginia x Berley 38 и Basma Xanthi совпадает с точностью до нуклеотида. На расстоянии 47 пн от делеции в позиции 47 (AWOK01769803.1, позиция 152) у сорта Basma Xanthi находится С, в то время как у сортов без делеции (TN90 и К326) – Т (прилож. 2, 3).

Полученные в данной работе результаты указывают на низкий уровень генетического разнообразия внутри вида N. tabacum, что было показано на примере анализа гена PMT2. Также была показана консервативность последовательностей клТ-ДНК на примере фрагментов вставок ТА и ТВ, в связи с чем использование этих фрагментов для филогенетического анализа невозможно. В то же время в качестве филогенетического маркера может быть использована центральная делеция во вставке ТА, что позволяет разделить сорта внутри вида N. tabacum на группы по происхождению. Интересно, что как анализ полиморфизма гена PMT2 растительного происхождения, так и анализ структуры клТ-ДНК привели к одному и тому же результату – разделению сортов К326, TN90 и сорта Basma Xanthi на разные группы как по уровню сходства последовательности гена PMT2, так и по наличию/отсутствию делеции в центральном участке клТ-ДНК ТА. Молекулярный маркер делеции дешевле и удобнее в использовании, чем секвенирование генов, но дает те же результаты. Таким образом, структурный полиморфизм клТ-ДНК в сортах N. tabacum может быть использован для изучения филогенетических отношений в пределах данного вида, поскольку события горизонтального переноса агробактериальных генов оставляют след в эволюции вида, отмечая возникающие в процессе эволюции этапы дивергенции.

В данной работе были использованы следующие методы: фрагменты для анализа участков клТ-ДНК были получены методом ПЦР на матрицах ДНК восьми сортов N. tabacum. Ранее полученные фрагменты были отсеквенированы по Сенгеру. Поиск по базе генов РМТ осуществляли с помощью алгоритма BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Для проведения множественного выравнивания использовали программу MAFFТ (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/).

Работа поддержана грантом РФФИ 18-016-00118 с использованием оборудования ресурсного центра “РМКТ” научного парка СПбГУ.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Matveeva T., Otten L. Wide spread occurrence of natural genetic transformation of plants by Agrobacterium // Plant Mol. Biology. 2019. V. 101. P. 415–437. https://doi.org/10.1007/s11103-019-00913-y

  2. White F.F., Garfinkel D.J., Huffman G.A. et al. Sequence homologous to Agrobacterium rhizogenes TDNA in the genomes of uninfected plants // Nature. 1983. V. 301. P. 348–350. https://doi.org/10.1038/301348a0

  3. Intrieri M.C., Buiatti M. The horizontal transfer of Agrobacterium rhizogenes genes and evolution of the genus Nicotiana // Mol. Phylogenet. Evol. 2001. V. 20. P. 100–110. https://doi.org/10.1006/mpev.2001.0927

  4. Chen K., Dorlhac de Borne F., Szegedi E., Otten L. Deep sequencing of the ancestral tobacco species Nicotiana tomentosiformis reveals multiple T-DNA inserts and a complex evolutionary history of natural transformation in the genus Nicotiana // Plant J. 2014. V. 80. P. 669–682. https://doi.org/10.1111/tpj.12661

  5. Lewis R., Nicholson J. Aspects of the evolution of Nicotiana tabacum L. and the status of the United States Nicotiana Germplasm Collection // Genet. Resour. Crop Evol. 2007. V. 54. P. 727–740. https://doi.org/10.1007/s10722-006-0024-2

Дополнительные материалы

скачать App_1.docx
Приложение 1.
 
 
скачать App_2.docx
Приложение 2.
 
 
скачать App_3.docx
Приложение 3.