Генетика, 2020, T. 56, № 2, стр. 211-224

Генетический полиморфизм экспериментально воспроизводимых форм артериальной гипертонии

О. Е. Редина 1 2*, В. А. Девяткин 1 2, Н. И. Ершов 1, А. Л. Маркель 1 2

1 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
630090 Новосибирск, Россия

2 Новосибирский государственный университет, кафедра молекулярной биологии и биотехнологии
630090 Новосибирск, Россия

* E-mail: oredina@ngs.ru

Поступила в редакцию 18.02.2019
После доработки 21.03.2019
Принята к публикации 09.04.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

В работе проведен анализ распределения полиморфных локусов у крыс разных гипертензивных линий. При анализе транскрибируемых локусов крыс НИСАГ (ISIAH) и соответствующих им локусов 11 других гипертензивных линий/сублиний крыс максимальная частота встречаемости одинаковых SNPs у разных линий составила 0.58 (т.е. у семи из 12 гипертензивных линий/сублиний). Анализ геномных последовательностей 11 гипертензивных линий/сублиний крыс, моделирующих разные формы гипертонии, также не выявил ни одного SNP, общего для всех 11 взятых в анализ гипертензивных линий/сублиний крыс. Анализ экспериментальных данных свидетельствует о том, что артериальная гипертония является генетически гетерогенным заболеванием.

Ключевые слова: артериальная гипертония, полиморфизм, линии гипертензивных крыс, генетическая гетерогенность.

Изучение генетических основ проявления полигенных социально значимых заболеваний – важная задача современной медицинской генетики. Известно, что в развитии полигенных заболеваний значительную роль может играть полиморфизм, как в кодирующих, так и в регуляторных последовательностях генов. Идентификация генетических вариантов, ассоциированных с развитием полигенных заболеваний, помогает определению генетической базы патологии [1, 2] и служит выявлению молекулярных мишеней для разработки новых лекарственных препаратов, а также помогает наметить наиболее рациональные подходы к лечению и профилактике [3].

Артериальная гипертония (АГ), или гипертоническая болезнь – широко распространенное заболевание, основным признаком которого является стабильное повышение артериального давления (АД). В человеческой популяции моногенно контролируемые формы АГ встречаются чрезвычайно редко, в большинстве случаев проявление АГ контролируется полигенно. В базе даных RGD (https://rgd.mcw.edu/) в настоящее время представлено более 700 генов, ассоциированных с патогенезом АГ, тем не менее изучение генетической природы АГ остается актуальной проблемой.

Известно, что на развитие АГ существенное влияние могут оказывать наряду с генетическими также средовые факторы. Чтобы исключить влияние последних, изучение генетической основы заболевания проводят на разных линиях крыс, моделирующих АГ и содержащихся на строго контролируемой диете и в константных средовых условиях [4].

Ранее методом RNA-Seq были проведены поиск нуклеотидных вариантов (SNPs), специфических для крыс линии НИСАГ (ISIAH) с наследуемой индуцируемой стрессом артериальной гипертензией, и сравнение найденных SNPs с данными секвенирования геномов 42 других линий и сублиний крыс, имеющихся в базах данных, 11 из которых известны как гипертензивные. Были показаны значительные отличия генотипа крыс НИСАГ от генотипов всех проанализированных гипертензивных линий/сублиний крыс. Работа позволила выявить 1849 SNPs, специфических для крыс линии НИСАГ, а также 158 SNPs, встречающихся только у гипертензивных линий крыс, но не встречающихся у других линий крыс с нормальным уровнем АД [5]. Последняя группа из 158 SNPs является наиболее интересной для поиска общих, либо наиболее часто встречающихся нуклеотидных вариантов, ассоциированных с гипертонией. С учетом того, что разные модели АГ, представленные разными гипертензивными линиями, могут иметь специфический набор полиморфных локусов, целью настоящей работы было проведение анализа распределения полиморфных локусов у крыс разных гипертензивных линий. Предполагалось найти ряд полиморфных сайтов, свойственных всем без исключения гипертензивным, но не нормотензивным, линиям с тем чтобы идентифицировать некое “генетическое ядро” АГ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Подробное описание методики проведения анализа транскриптома (RNA-Seq) было сделано ранее [5]. Коротко: RNA-Seq анализ был проведен у самцов гипертензивной линии крыс НИСАГ/Icgn (наследуемая индуцируемая стрессом артериальная гипертензия, ISIAH – в англоязычной литературе) и WAG/GSto-Icgn (Wistar Albino Glaxo). Последние использованы как нормотензивный контроль. Крысы были получены из Центра генетических ресурсов лабораторных животных ИЦиГ СО РАН, где они содержались в стандартных условиях и получали стандартный полнорационный корм и воду без ограничения. В каждой экспериментальной группе было по шесть животных. От каждого животного в RNA-Seq анализ брали образцы пяти тканей (ствол мозга, гипоталамус, надпочечник, корковое и мозговое вещество почки). Секвенирование всех тканей проводили раздельно. Эксперимент был выполнен в соответствии с Международными правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных и одобрен биоэтическим комитетом ИЦиГ СО РАН.

Анализ RNA-Seq проводили в ЗАО “Геноаналитика” (Москва, РФ). Все образцы анализировались как биологические повторы. Использовали: Dynabeads mRNA Purification Kit (Ambion, США) для получения мРНК и NEBNext mRNA Library Prep Reagent Set for Illumina (NEB, США) для получения кДНК библиотек. Секвенирование кДНК библиотек проводили на платформе Illumina. Полученные данные картировали на референсный геном крысы (Rnor_5.0/rn5) с помощью программы TopHat2 (v2.0.13) [6]. Аннотацию генов проводили в базе данных NCBI Gene. Качество картированных данных оценивали с помощью модуля ‘CollectRnaSeqMetrics’ в пакете программ Picard (v2.4.1) (http://broadinstitute.github.io/picard/). С помощью модуля Picard ‘MarkDuplicates’ из картированных данных в формате bam, полученных для пяти различных тканей каждого животного, удаляли потенциальные ПЦР-дупликаты, после чего использовали модуль Picard ‘MergeSamFiles’ для объединения данных по каждому животному в один пул.

Транскриптомные данные крыс НИСАГ и WAG выравнивались на референсный геном rn5 (strain BN/NhsdMcwi). Для каждой особи был получен GVCF-файл отличий от референса, после чего все GVCF обеих линий одновременно были генотипированы (joint genotyping) относительно этого референса. Определение SNPs проводили в пакете программ GATK (Genome Analysis Toolkit) [7] с учетом параметров фильтрации недостоверных позиций, согласно рекомендациям разработчиков для данных RNA-Seq. Дополнительно использовали следующие критерии: отобраны только те позиции, генотип которых установлен хотя бы для трех животных в каждой из экспериментальных групп, так чтобы генотип НИСАГ был гомозиготным по альтернативному аллелю (Alt1/Alt1) во всех детектированных образцах, а генотип WAG не содержал этого аллеля (Alt1/* и */Alt1) во всех детектированных образцах. Покрытие генотипов Alt1/Alt1 должно было составлять ≥10 хотя бы в одной из библиотек НИСАГ.

Для определения SNPs, встречающихся только у гипертензивных линий крыс, проводили сравнение полученного для крыс НИСАГ списка нуклеотидных замен с данными, имеющимися в базе RGSC (Rat Genome Sequencing Consortium) для последовательностей геномов 42 линий и сублиний [8], среди которых были 11 линий/сублиний, моделирующих различные формы гипертонии (FHH/EurMcwi, LH/MavRrrc, MHS/Gib, SBH/Ygl, SHR/OlaIpcv, SHRSP/Gla, SHR/NCrlPrin, SHR/NHsd, SHR/OlaIpcvPrin, SS/Jr, SS/JrHsdMcwi), 10 линий крыс (FHL/EurMcwi, LN/MavRrrc, LL/MavRrrc, MNS/Gib, SBN/Ygl, SR/Jr, WKY/N, WKY/Gla, WKY/NCrl, WKY/NHsd), которые принято использовать в качестве нормотензивного контроля, а также 21 линия крыс (ACI/N, ACI/EurMcwi, BBDP/Wor, BN-Lx/Cub, BN-Lx/CubPrin, BN/SsN, BUF/N, DA/BklArbNsi, F334/N, F344/NHsd, F344/NCrl, SUO_F344, GK/Ox, LE/Stm (SOLiD), LEW/Crl, LEW/NCrlBR, LE/Stm (Illumina), M520/N, MR/N, WAG/Rij, WN/N), используемых в экспериментальных исследованиях, не связанных с гипертонией.

В настоящей работе использовали часть ранее полученных данных (см. сайт ФИЦ ИЦиГ СО РАН, дополнительный файл_2, http://icg.nsc.ru/ isiah/snp-2/), которые представляют собой список SNPs, встречающихся только у гипертензивных линий крыс, а также геномные данные перечисленных выше 11 линий/сублиний, моделирующих различные формы гипертонии, полученные из базы RGSC (Rat Genome Sequencing Consortium) [8]. Сравнение однонуклеотидных замен, найденных у крыс НИСАГ/Icgn и WAG/Gsto-Icgn, с генотипами 42 линий/сублиний проводилось только по геномным локусам, соответствующим локусам, секвенированным при транскриптомном анализе крыс НИСАГ/Icgn и WAG/Gsto-Icgn. При анализе геномных данных крыс 11 гипертензивных линий/сублиний использовали следующие критерии: были отобраны только те позиции, генотип которых хотя бы у одной из гипертензивных линий был установлен как Alt1/Alt1 или Alt1/* и не встречался у крыс остальных 31-й линии.

Классификация нуклеотидных замен и их эффекты описывались в программе SnpEff (http:// snpeff.sourceforge.net/SnpEff_manual.html). Определение возможных эффектов замены аминокислоты на функции белка проводили в программе SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant, http:// sift.bii.a-star.edu.sg/) [9]. Гены, ассоциированные с гипертонией, выявляли согласно данным базы Rat Genome Database (RGD, http://rgd.mcw.edu/). При проведении анализа главных компонент в качестве меры расстояния использовали результаты анализа идентичности аллелей по состоянию (identity-by-state, IBS), полученные в пакете SNPRelate в программной среде R [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поиск общих SNPs на уровне транскрибируемых локусов крыс НИСАГ и 11 других гипертензивных линий/сублиний крыс

Был проведен анализ встречаемости 158 SNPs, которые были детектированы только у гипертензивных линий крыс (у крыс НИСАГ, а также у одной или нескольких из 11 других гипертензивных линий/сублиний крыс), но не были найдены в генотипах других линий крыс, используемых как нормотензивный контроль или для проведения других экспериментов, не связанных с гипертонией. Анализ показал, что 117 SNPs из 158 (т.е. 74%) встречаются у крыс НИСАГ и только у какой-либо одной из других взятых в анализ гипертензивных линий/сублиний. Остальные 41 SNPs, детектируемые у крыс НИСАГ, характерны одновременно для двух или более линий/сублиний других гипертензивных крыс (рис. 1). Однако не было найдено ни одного SNP общего для всех гипертензивных линий, включая линию НИСАГ. Наиболее часто встречающиеся SNPs были найдены не более чем у семи из 12 проанализированных линий/сублиний гипертензивных крыс, при этом следует отметить, что пять из них были представлены сублиниями крыс, полученных из линии SHR. Таким образом, в исследуемой выборке максимальная частота встречаемости общих SNPs у 12 гипертензивных линий/сублиний составила 0.58. Характеристики 41 SNPs, наиболее часто встречающихся у гипертензивных крыс, представлены в табл. 1.

Рис. 1.

Встречаемость SNPs, детектированных у нескольких из 12 гипертензивных линий/сублиний крыс. Сравнение проведено только по геномным локусам, соответствующим локусам, секвенированным при транскриптомном анализе крыс НИСАГ. Сублинии показаны одинаковой штриховкой.

Таблица 1.

Характеристика 41 SNPs, встречающихся у крыс НИСАГ и у 11 других линий/сублиний гипертензивных крыс

Символ гена Хромосома,
позиция
ID SnpEff, классификация Замена SIFT Score,
классификация
Частота встречаемости у гипертензивных линий Линии крыс
нуклеотида аминокислоты
Akt1s1 1,
101913691
Synonymous variant c.171C>T p.Ala57Ala 1.000,
tolerated
0.25(3/12) SS/Jr
SS/JrHsdMcwi
НИСАГ/Icgn
Rcn3 1,
102142070
3 prime UTR variant c.*174dupC     0.25(3/12) SS/Jr
SS/JrHsdMcwi
НИСАГ/Icgn
Grb2 10,
104085931
3 prime UTR variant c.*424delG     0.25(3/12) SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
НИСАГ/Icgn
Thrb 15,
12953654
3 prime UTR variant c.*2392A>G     0.25(3/12) LH/MavRrrc
MHS/Gib
НИСАГ/Icgn
Thrb 15,
12953856
3 prime UTR variant c.*2190T>C     0.25(3/12) LH/MavRrrc
MHS/Gib
НИСАГ/Icgn
Blvra 3,
126087217
5 prime UTR variant c.-25_-24delAC     0.25(3/12) MHS/Gib
SBH/Ygl
НИСАГ/Icgn
Dst 9,
37702470
Missense variant c.9010C>A p.Arg3004Ser   0.25(3/12) FHH/EurMcwi
MHS/Gib
НИСАГ/Icgn
Dst 9,
37702497
Synonymous variant c.8983C>A p.Arg2995Arg   0.25(3/12) FHH/EurMcwi
MHS/Gib
НИСАГ/Icgn
Dst 9,
37704092
Missense variant c.7388C>T p.Thr2463Ile   0.25(3/12) FHH/EurMcwi
MHS/Gib
НИСАГ/Icgn
Dst 9,
37704660
Missense variant c.6820G>A p.Asp2274Asn   0.25(3/12) FHH/EurMcwi
MHS/Gib
НИСАГ/Icgn
Wac 17,
62660946
rs8165343 Downstream gene variant c.*3186C>T     0.33(4/12) LH/MavRrrc
SS/Jr
SS/JrHsdMcwi
НИСАГ/Icgn
Bsdc1 5,
151409923
rs198680609 3 prime UTR variant c.*471G>A     0.33(4/12) SHRSP/Gla
SHR/NCrlPrin
SHR/OlaIpcvPrin
НИСАГ/Icgn
Arhgap20-Fdx1 8,
54948485
Intergenic region n.54948485_
54948486insT
    0.33(4/12) LH/MavRrrc
SS/Jr
SS/JrHsdMcwi
НИСАГ/Icgn
Fdx1 8,
54961118
Intron variant c.452+1694C>T     0.33(4/12) LH/MavRrrc
SS/Jr
SS/JrHsdMcwi
НИСАГ/Icgn
Fdx1 8,
54965432
Intron variant c.323-2491G>A     0.33(4/12) LH/MavRrrc
SS/Jr
SS/JrHsdMcwi
НИСАГ/Icgn
Fdx1 8,
54968746
Intron variant c.322+2167C>T     0.33(4/12) LH/MavRrrc
SS/Jr
SS/JrHsdMcwi
НИСАГ/Icgn
Tjp2# 1,
249250919
rs198341700 Synonymous variant c.1326G>A p.Thr442Thr 0.537,
tolerated
0.42(5/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
НИСАГ/Icgn
Tjp2# 1,
249259080
rs198995028 Missense variant c.767G>A p.Arg256His 0.391,
tolerated
0.42(5/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
НИСАГ/Icgn
Cyld-ps1-Xkr4 5,
20190727
rs197762208 Intergenic region n.20190727G>A     0.42(5/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
НИСАГ/Icgn
RGD1561149 5,
151142214
rs198649532 Missense variant c.2327C>T p.Ser776Leu 0.593,
tolerated
0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Rbbp4 5,
151240901
rs197189353 Synonymous variant c.873G>A p.Thr291Thr 1.000,
tolerated
0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Zbtb8os 5,
151262942
rs106772412 Synonymous variant c.144C>G p.Thr48Thr 1.000,
tolerated
0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Zbtb8os 5,
151268427
Downstream gene variant c.*413C>T     0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Bsdc1 5,
151395575
Synonymous variant c.618A>C p.Ala206Ala 1.000,
tolerated
0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Bsdc1 5,
151409509
3 prime UTR variant c.*57A>C     0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Bsdc1 5,
151409595
3 prime UTR variant c.*143C>T     0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Bsdc1 5,
151409864
3 prime UTR variant c.*412C>T     0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Bsdc1 5,
151409889
3 prime UTR variant c.*437C>T     0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Fam167b 5,
151512027
Downstream gene variant c.*124A>G     0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Iqcc 5,
151549776
Synonymous variant c.405T>C p.Ser135Ser 0.491,
tolerated
0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Iqcc 5,
151549815
Synonymous variant c.366A>G p.Pro122Pro 0.278,
tolerated
0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Ccdc28b 5,
151553858
Missense variant c.499C>T p.Arg167Cys 0.047,
deleterious
0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Kpna6 5,
151581788
3 prime UTR variant c.*478G>A   NA 0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Zfp317 8,
19967180
Missense variant c.296G>T p.Arg99Leu 0.132,
tolerated
0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Zfp26 8,
21506216
3 prime UTR variant c.*610delA     0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Zfp26 8,
21506513
3 prime UTR variant c.*314G>A     0.50(6/12) SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Fech 18,
59153047
3 prime UTR variant c.*702G>A     0.58(7/12) SBH/Ygl
SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Fech 18,
59153211
3 prime UTR variant c.*538G>A     0.58(7/12) SBH/Ygl
SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Fech 18,
59153450
3 prime UTR variant c.*299A>G     0.58(7/12) SBH/Ygl
SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Col4a3bp 2,
46477897
5 prime UTR variant c.-327delC     0.58(7/12) SBH/Ygl
SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn
Hmgcr# 2,
46599439
Synonymous variant c.1641A>G p.Gly547Gly 1.000,
tolerated
0.58(7/12) SBH/Ygl
SHR/OlaIpcv
SHR/NCrlPrin
SHR/NHsd
SHR/OlaIpcvPrin
SHRSP/Gla
НИСАГ/Icgn

Примечание. ID – идентификационный номер, прочерк обозначает отсутствие ID. # Гены, ассоциированные с гипертонией, согласно базе данных RGD.

Среди генов, представленных в табл. 1, имеются два гена (Tjp2, tight junction protein 2; Hmgcr, 3‑hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase), аннотированных в базе данных RGD как ассоциированные с гипертонией. Однако согласно анализу в программе SIFT встречающиеся в последовательностях этих генов мутации не должны существенно изменять структуру и/или функции кодируемых ими белков.

Единственным геном в табл. 1, имеющим несинонимичную замену (c.499C>T, p.Arg167Cys), которая предположительно может оказывать негативный эффект на структуру и/или функции белка (SIFT score = 0.047), является ген Ccdc28b (coiled-coil domain containing 28B). Этот полиморфизм встречается как у крыс НИСАГ, так и у четырех сублиний крыс со спонтанной гипертонией (SHR/OlaIpcv, SHR/NCrlPrin, SHR/NHsd, SHR/ OlaIpcvPrin), а также у крыс SHRSP/Gla, характеризующихся спонтанной гипертонией и склонностью к инсультам.

Поиск общих SNPs при полногеномном анализе 11 гипертензивных линий/сублиний крыс

Поскольку при сравнении нуклеотидных вариантов, находящихся в геномных локусах, соответствующих локусам, секвенированным при транскриптомном анализе крыс НИСАГ, не было найдено ни одного SNP общего для всех 12 гипертензивных линий/сублиний, возник вопрос о том, существуют ли в полном геноме общие SNPs, свойственные всем без исключения гипертензивным, но не нормотензивным, линиям. Для определения общих SNPs на геномном уровне был проведен сравнительный анализ имеющихся в базе RGSC геномных последовательностей 11 гипертензивных линий/сублиний крыс (FHH/ EurMcwi, LH/MavRrrc, MHS/Gib, SBH/Ygl, SHR/ OlaIpcv, SHRSP/Gla, SHR/NCrlPrin, SHR/NHsd, SHR/OlaIpcvPrin, SS/Jr, SS/JrHsdMcwi), моделирующих различные формы гипертонии. Для проведения этого анализа были отобраны только те нуклеотидные варианты, которые встречались в геномах гипертензивных линий/сублиний (в гомозиготном или в гетерозиготном состоянии), но не встречались у крыс других 31-й линии с нормальным уровнем АД.

Оценка генетического сходства и различий геномов гипертензивных крыс была проведена с использованием многомерного шкалирования (рис. 2 ). Анализ показал существенные различия между линиями и сходство между сублиниями.

Всего было проанализировано 253 950 SNPs, из них 174 585 нуклеотидных вариантов (68.7%) встречались только у одной из проанализированных гипертензивных линий/сублиний, а 79 365 SNPs встречались хотя бы у двух гипертензивных линий/сублиний. Из данных, представленных в табл. 2, видно, что общие SNPs были найдены не более чем у восьми из 11 проанализированных линий/сублиний гипертензивных крыс, т.е. максимальная частота встречаемости SNPs составила 0.73 и обусловлена, в первую очередь, генетическим родством различных сублиний линии SHR. Таким образом, при анализе геномов 11 гипертензивных линий/сублиний крыс, моделирующих разные формы гипертонии, не было найдено ни одного SNP, общего для всех 11 взятых в анализ гипертензивных линий/сублиний крыс.

Таблица 2.  

Встречаемость SNPs в геномах анализируемых линий/сублиний гипертензивных крыс

Число линий/сублиний, имеющих SNPs Число
общих SNPs
Встречаемость SNPs в линиях/сублиниях гипертензивных крыс
FHH/EurMcwi LH/MavRrrc MHS/Gib SBH/Ygl SHR/OlaIpcv SHRSP/Gla SHR/NCrlPrin SHR/NHsd SHR/OlaIpcvPrin SS/Jr SS/JrHsdMcwi
2 9653 801 1077 2575 1907 424 1622 129 113 494 4939 5225
3 6795 39 6054 197 255 146 271 215 244 278 6328 6358
4 9402 10 163 107 53 9153 185 9226 9160 9226 161 164
5 50 612 110 3 7 17 50 602 50 490 50 611 50 605 50 607 3 5
6 2464 88 159 142 2038 2463 2463 2462 2462 2463 19 25
7 264 142 6 5 231 261 264 263 264 263 31 118
8 175 0 165 10 1 174 175 175 175 175 175 175

ОБСУЖДЕНИЕ

Линия крыс НИСАГ является уникальной линией, моделирующей стресс-чувствительную форму АГ, что делает ее ценным дополнением к имеющемуся набору экспериментальных моделей АГ [4, 11, 12]. Ранее нами было показано, что по сумме SNPs, детектированных в транскрибируемых локусах, генотип крыс НИСАГ значительно отличается от генотипов других гипертензивных линий крыс. Тем не менее была найдена группа из 158 SNPs, которые были детектированы только у гипертензивных линий/сублиний крыс, но не встречались у других известных линий крыс, используемых в экспериментах, не связанных с повышенным АД [5]. В настоящей работе мы показали, что среди этих 158 SNPs нет ни одного общего для всех 12 гипертензивных линий/сублиний крыс, взятых в анализ. Были определены нуклеотидные варианты, наиболее часто встречающиеся в транскриптомах крыс НИСАГ и других 11 линий/сублиний гипертензивных крыс, которые в настоящее время исследуются с целью установления генетических основ гипертонической болезни человека.

Среди SNPs, наиболее часто встречающихся у гипертензивных крыс (табл. 1), следует отметить наличие несинонимичной замены в последовательности гена Ccdc28b (coiled-coil domain containing 28B), которая предположительно может оказывать негативный эффект на структуру и/или функции кодируемого этим геном белка. До настоящего времени ген Ccdc28b не был ассоциирован с гипертонией. Однако эта мутация оказалась одной из наиболее часто встречающихся среди тех, которые были обнаружены только у гипертензивных крыс и не встречаются в генотипах линий крыс с нормальным уровнем АД. Кроме крыс НИСАГ данная замена была также найдена у всех сублиний, полученных из линии SHR, включая крыс SHRSP.

О функциях белка, кодируемого геном Ccdc28b, известно мало. Предполагается, что белок CCDC28B участвует в структурном формировании цилий и может оказывать модифицирующий эффект у пациентов с синдромом Барде–Бидля [13]. Цилии (реснички или жгутики) представляют собой эволюционно консервативные органеллы, расположенные на апикальной поверхности эукариотических клеток. В организме человека цилии присутствуют практически на всех типах клеток и обеспечивают как движение одиночных клеток и течение различных тканевых жидкостей, так и сенсорные функции.

Синдром Барде–Бидля является заболеванием, к диагностическим признакам которого относятся такие как ожирение, сердечно-сосудистая патология (гипертрофия межжелудочковой перегородки и дилатационная кардиомиопатия), деградация сетчатки глаза [14], а также гипертония и заболевания почек [15]. Безусловно, следует учитывать то, что синдром Барде–Бидля является генетически гетерогенным заболеванием [16], тем не менее снижение экспрессии Ccdc28b у рыбок данио рерио (zebrafish) приводит к дефектному цилиогенезу и к появлению многочисленных фенотипических дефектов, среди которых отмечают и нарушение функции почек [13]. Наличие функциональной связи между уровнем экспрессии гена Ccdc28b и нарушением функции почек, т.е. признаком, часто сопровождающим развитие АГ, позволяет сделать предположение о том, что найденный SNP в последовательности гена Ccdc28b, присутствующий в генотипах нескольких линий гипертензивных крыс (НИСАГ, SHR и SHRSP), но не встречающийся у крыс с нормальным уровнем АД, может быть потенциально интересным для изучения его влияния на развитие АГ как у модельных животных, так и у человека.

Сравнительный анализ полных геномных последовательностей 11 гипертензивных линий/сублиний крыс, моделирующих разные формы гипертонии, показал, что общие SNPs были найдены не более чем у восьми из 11 проанализированных линий/сублиний гипертензивных крыс. Этот результат позволяет говорить о том, что АГ является генетически гетерогенным заболеванием. Такой вывод, полученный при анализе транскриптомных и геномных данных нескольких линий/сублиний крыс, созданных в результате селекции для изучения молекулярно-генетических механизмов развития разных форм гипертонии, вероятно, может быть верным и для человека.

Известно, что несмотря на существование множества вариантов лечения АГ многие пациенты имеют неподдающийся медикаментозному контролю повышенный уровень АД при использовании схем из трех и более антигипертензивных препаратов разных классов [1, 17]. Распространенность такой резистентной к лечению АГ составляет 13.7% [18]. Таким образом, можно предполагать, что и в человеческой популяции АГ является генетически гетерогенным заболеванием, не имеющим единой этиологической базы. Безусловно, следует согласиться с мнением о том, что потребность в контроле АД у пациентов с резистентной к лечению гипертонией может быть решена путем разработки новых лекарств, которые предназначены для лечения гипертонии и сопутствующих заболеваний, таких как сердечная недостаточность, хронические заболевания почек и сахарный диабет [17]. Однако на основании полученных нами результатов, представленных в настоящей работе, следует согласиться и с ранее высказанным предположением о том, что АГ является генетически гетерогенным расстройством, лечение которого можно улучшить, если подбирать лекарства на основе генодиагностики конкретного пациента [19] или хотя бы с учетом генетической изменчивости в определенной популяции, т.е. для определенной группы населения, что является более реальной задачей [20].

Работа поддержана бюджетными проектами 0324-2019-0041 и 0324-2019-0042. Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП “Центр генетических ресурсов лабораторных животных” ФИЦ ИЦиГ СО РАН, поддержанного Минобрнауки России (Уникальный идентификатор проекта RFMEFI62117X0015). Вычислительный анализ данных проводили с использованием ресурсов ССКЦ ИВМиМГ СО РАН.

Все принятые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Рис. 2.

Анализ генетического сходства геномов 11 гипертензивных линий/сублиний крыс по выявленным SNPs. Оценка расстояний проведена методом многомерного шкалирования с использованием в анализе идентичности аллелей по состоянию.

Список литературы

  1. Ellinor P.T., Lunetta K.L., Glazer N.L. et al. Common variants in KCNN3 are associated with lone atrial fibrillation // Nat. Genet. 2010. V. 42. № 3. P. 240–244. https://doi.org/10.1038/ng.537

  2. Low S.K., Takahashi A., Mushiroda T., Kubo M. Genome-wide association study: a useful tool to identify common genetic variants associated with drug toxicity and efficacy in cancer pharmacogenomics // Clin. Cancer Res. 2014. V. 20. № 10. P. 2541–2552. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-2755

  3. Kingsmore S.F., Lindquist I.E., Mudge J. et al. Genome-wide association studies: progress and potential for drug discovery and development // Nat. Rev. Drug Discov. 2008. V. 7. № 3. P. 221–230. https://doi.org/10.1038/nrd2519

  4. Rapp J.P. Genetic analysis of inherited hypertension in the rat // Physiol. Rev. 2000. V. 80. № 1. P. 135–172. https://doi.org/10.1152/physrev.2000.80.1.135

  5. Ershov N.I., Markel A.L., Redina O.E. Strain-specific single-nucleotide polymorphisms in hypertensive ISIAH rats // Biochemistry (Mosc.). 2017. V. 82. № 2. P. 224–235. https://doi.org/10.1134/S0006297917020146

  6. Kim D., Pertea G., Trapnell C. et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions // Genome Biol. 2013. V. 14. № 4. P. R36. https://doi.org/10.1186/gb-2013-14-4-r36

  7. McKenna A., Hanna M., Banks E. et al. The genome analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data // Genome Res. 2010. V. 20. № 9. P. 1297–1303. https://doi.org/10.1101/gr.107524.110

  8. Hermsen R., de Ligt J., Spee W. et al. Genomic landscape of rat strain and substrain variation // BMC Genomics. 2015. V. 16. № 357. https://doi.org/10.1186/s12864-015-1594-1

  9. Kumar P., Henikoff S., Ng P.C. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm // Nat. Protoc. 2009. V. 4. № 7. P. 1073–1081. https://doi.org/10.1038/nprot.2009.86

  10. Zheng X., Levine D., Shen J. et al. A high-performance computing toolset for relatedness and principal component analysis of SNP data // Bioinformatics. 2012. V. 28. № 24. P. 3326–3328. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts606

  11. Sarikonda K.V., Watson R.E., Opara O.C., Dipette D.J. Experimental animal models of hypertension // J. Am. Soc. Hypertens. 2009. V. 3. № 3. P. 158–165. https://doi.org/10.1016/j.jash.2009.02.003

  12. Bader M. Rat models of cardiovascular diseases // Methods Mol. Biol. 2010. V. 597. P. 403–414. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-389-3_27

  13. Cardenas-Rodriguez M., Osborn D.P., Irigoin F. et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet–Biedl syndrome // Hum. Genet. 2013. V. 132. № 1. P. 91–105. https://doi.org/10.1007/s00439-012-1228-5

  14. Elbedour K., Zucker N., Zalzstein E. et al. Cardiac abnormalities in the Bardet–Biedl syndrome: echocardiographic studies of 22 patients // Am. J. Med. Genet. 1994. V. 52. № 2. P. 164–169. https://doi.org/10.1002/ajmg.1320520208

  15. Croft J.B., Swift M. Obesity, hypertension, and renal disease in relatives of Bardet–Biedl syndrome sibs // Am. J. Med. Genet. 1990. V. 36. № 1. P. 37–42. https://doi.org/10.1002/ajmg.1320360109

  16. Rahmouni K., Fath M.A., Seo S. et al. Leptin resistance contributes to obesity and hypertension in mouse models of Bardet–Biedl syndrome // J. Clin. Invest. 2008. V. 118. № 4. P. 1458–1467. https://doi.org/10.1172/JCI32357

  17. Oparil S., Schmieder R.E. New approaches in the treatment of hypertension // Circ. Res. 2015. V. 116. № 6. P. 1074–1095. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.116.303603

  18. Benjamin E.J., Blaha M.J., Chiuve S.E. et al. Heart disease and stroke statistics-2017 Update: a report from the American heart association // Circulation. 2017. V. 135. № 10. P. e146–e603. https://doi.org/10.1161/CIR.0000000000000485

  19. Mann S.J. Neurogenic essential hypertension revisited: the case for increased clinical and research attention // Am. J. Hypertens. 2003. V. 16. № 10. P. 881–888.

  20. Jazwinska E.C. Exploiting human genetic variation in drug discovery and development // Drug Discov. Today. 2001. V. 6. № 4. P. 198–205. https://doi.org/S1359-6446(00)01642-1

Дополнительные материалы отсутствуют.