Генетика, 2020, T. 56, № 3, стр. 251-259

ИММУНИТЕТ РАСТЕНИЙ

Неспецифический иммунитет основан на рецепторных белках (Pattern Recognition Receptors, PRRs), расположенных в плазматической мембране и в цитоплазме, которые распознают и связываются с PAMPs/MAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns/Microbial-Associated Molecular Patterns), индуцируя развитие первичной, или базальной, защитной реакции, обозначаемой как PTI/MTI (PAMPs-triggered immunity/MAMPs-triggered immunity) [5]. В качестве PAMPs могут выступать компоненты клеточной стенки патогенов, липополисахариды и другие соединения. Существуют два типа PRRs: рецептор-подобные белки (Receptor Like Proteins, RLPs) и рецептор-подобные киназы (Receptor Like Kinases, RLKs). RLKs состоят из внеклеточного богатого лейцином домена (Leucine Reach, LRR), трансмембранного домена и внутриклеточного киназного домена, который может связываться с PAMPs и инициировать сигнальный каскад, активизирующий PTI. LRR-домен является наиболее вариабельной частью PRRs и отвечает за распознавание PAMPs. У RLPs отсутствует киназный домен, что делает их неспособными самим инициировать передачу сигналов и активацию PTI и, следовательно, требует связывания с корецептором [6, 7].

Специфический иммунитет связан с распознаванием растением цитоплазматических эффекторов – белков, которые продуцируются патогеном для того, чтобы избегать распознавания системой неспецифического иммунитета. Эффекторные белки являются продуктами генов вирулентности (Avr) патогена, и распознаются они нуклеотид-связывающими белками растения, содержащими богатые лейцином повторы (nucleotide-binding leucine rich repeat intracellular receptors, NB-LRR). Эти белки кодируются генами устойчивости, или R-генами. Таким образом, узнавание осуществляется за счет прямого или косвенного взаимодействия R-белка и соответствующего эффекторного белка. Ранее считалось, что R-гены взаимодействуют c Avr-генами согласно модели Флора ген-на-ген, однако было показано, что во многих Avr–R парах прямое взаимодействие отсутствует. Эта модель также предполагает, что эффективность белка устойчивости сильно зависит от стабильности и изменчивости соответствующего эффекторного белка. Распознавание Avr-белка R-белком приводит к развитию иммунитета, индуцируемого эффекторами (effector-triggered immunity, ETI) и приводящего к сверхчувствительному ответу (hypersensitive response, HR). Этот ответ заключается в запуске МАРК каскада и активации факторов транскрипции WRKY, что приводит к локальному апоптозу клеток [8] и физически предотвращает дальнейшее распространение патогена. При этом важную роль играют убиквитин-зависимая система протеолиза и E3-лигазы, широко представленные в геномах растений. Размер очага некротизации при HR зависит от генотипа растения и патогена и может варьировать от 1–2 до 29 клеток. Взаимоотношения патогена и растения-хозяина описывают как совместимые, если растение восприимчиво к поражению, и как несовместимые, если растение сохраняет устойчивость [9]. На восприимчивых растениях Avr-белки являются факторами авирулентности. В связи с опасностью распознавания эффекторные гены часто подвергаются быстрым эволюционным изменениям в популяциях патогенов [10]. Это приводит к возникновению мутантных форм эффекторов, которые сохраняют свои функции, но при этом не распознаются генами устойчивости. В коэволюции растение–патоген следующим шагом является эволюция генов устойчивости, которые будут распознавать новые формы эффекторов. Кроме того, взаимоотношения растения и биотрофного патогена в настоящее время рассматривают как компромисс (trade-off), позволяющий колонизируемому растению и патогену выжить и оставить максимальное число потомков. Выдвигаются предположения, что такой механизм реализуется и при взаимодействии P. infestans с картофелем.

Эффекторы – это молекулы, продуцируемые и секретируемые патогенами для подавления защитных реакций растения [10, 11]. Они вмешиваются в физиологические процессы в организме хозяина, способствуя колонизации. Эффекторы могут влиять на метаболизм клетки хозяина, приводить к некрозу или маскировать присутствие патогена. Эти функции могут осуществляться за счет ингибирования протеаз (ингибирование папаин-подобных цистеиновых протеаз) [12], маскирования присутствия (связывание хитиназ) [13], взаимодействия с фитогормонами или структурного сходства с ними (компоненты биосинтеза и восприятия SA и JA являются мишенью для эффекторов различных патогенов) [14], манипулирования везикулярным транспортом и экспрессией генов путем действия на факторы транскрипции [15] (эффектор Pi03192 P. infestans взаимодействует с транскрипционными факторами NAC хозяина, предотвращая их локализацию в ядре, влияя тем самым на их функцию) и подавления механизма сайленсинга (PSR – Phytophthora suppressor of RNA silencing влияет на биогенез малых РНК) [16]. Анализ функций эффекторных белков, особенно так называемых “основных/коровых эффекторов”, имеет решающее значение для понимания механизмов патогенности/симбиоза и стратегий защиты растений, помогает разработать стратегии селекции устойчивых к патогенам сортов, а также повысить урожайность и качество, а также устойчивость к абиотическим стрессам [17].

МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ И РАЗНООБРАЗИЕ ЭФФЕКТОРНЫХ БЕЛКОВ ПАТОГЕНА

Для эффекторных белков разных патогенов характерны небольшие размеры (около 300 аминокислотных остатков) и обилие остатков цистеина, что придает компактную структуру белку [10]. Эффекторы имеют модульное строение [18]. Многие эффекторные белки обладают консервативными мотивами (такими как мотивы RXLR, CRN, LysM, RGD, DELD, EAR, RYWT, Y/F/WXC или CFEM), локализованными в их N- или C‑концевых областях. Эффекторы либо транслоцируются в клетки растения-хозяина через специальные структуры и функционируют в цитоплазме или ядре хозяина, либо находятся в апопласте клеток растения и действуют в межклеточном пространстве [17, 19–22]. Согласно их локализации эффекторы делят на две широкие категории: апопластические, которые накапливаются в межклеточном пространстве растения, и цитоплазматические, которые доставляются в растительную клетку через специальную инфекционную структуру, называемую гаусторией. Апопластические эффекторы включают секретируемые гидролитические ферменты, такие как протеазы, липазы и гликозилазы, разрушающие растительную ткань; ингибиторы ферментов и некротизирующие токсины, такие как NLP (Nep1-like) и SCR (PcF-like small cysteine-rich) белки [11, 21]. Цитоплазматические эффекторы способны перемещаться в ближайшие клетки, возможно через плазмодесмы. К ним относят семейство эффекторов, содержащих RXLR-мотив, и семейство эффекторов CRN (CRinkling and Necrosis-inducing) [23]. Наиболее изученным и многочисленным классом у оомицетов являются RXLR-эффекторы. Этот мотив играет роль в связывании белка на поверхности клетки хозяина с фосфатидилинозит-3-фосфатом (PI3P), после чего эффектор внедряется с помощью везикулярного эндоцитоза [20, 22, 24]. У CRN-белков также присутствует консервативный N-концевой мотив, который предположительно служит для транслокации в цитоплазму клетки-хозяина. У некоторых грибов роль эффекторов могут выполнять sRNA (Small RNA) [17, 25].

Наиболее изученной и многочисленной группой цитоплазматических эффекторов P. infestans, по предварительным оценкам насчитывающей до 563 представителей [11, 21], является семейство генов, содержащее RXLR-мотив. Все эффекторные белки RXLR (где R – аргинин, Х – любой аминокислотный остаток, L – лейцин) характеризуются единым планом строения и имеют сигнальный пептид, необходимый для секреции за пределы гаустория, и RXLR-мотив, за которым на расстоянии 5–25 аминокислотных остатков следует dEER-мотив (где d – аспарагиновая кислота, E – глутаминовая кислота, R – аргинин). Эти два мотива обеспечивают мощный биоинформационный инструмент для идентификации эффекторного состава патогенных оомицетов [1] (рис. 1). Все эти структуры расположены на N-конце эффекторных белков. Консервативный RXLR-мотив необходим для перемещения эффекторных молекул внутри клетки растения-хозяина [26]. С‑концевая часть содержит полиморфные домены и отвечает за эффекторную активность белка и модулирование защитной реакции организма внутри клетки-хозяина [24]. Было показано, что C‑концевые W и Y мотивы участвуют в подавлении запрограммированной клеточной смерти [27]. Согласно анализу протеома, экспрессия RXLR-эффекторов строго ограничена, что объясняется избеганием распознавания растением-хозяином. Увеличение числа RXLR генов, по-видимому, обусловлено неаллельной гомологичной рекомбинацией и тандемной дупликацией [8, 21].

Рис. 1.

Идентификация RXLR и dEER мотивов в последовательностях генов вирулентности P. infestans (http://meme-suite.org/).

Первоначально цитоплазматические эффекторы CRN (CRinkling and Necrosis-inducing) были идентифицированы из транскриптов P. infestans, кодирующих предполагаемые секретируемые пептиды, которые вызывают скручивание и некроз, характерный для врожденного иммунитета растений [28]. Как и RXLR-эффекторы, они широко распространены у оомицетов [29]. До сих пор мало что известно об этих эффекторах. Они повсеместно встречаются в растительных патогенных оомицетах и симбиотических грибах, но их количество в разных микробах сильно различается. Анализ последовательности генома P. infestans обнаружил 196 CRN-генов, в то время как для P. sojae и P. ramorum их число составляет 100 и 19 соответственно. Подобно RXLR CRN представляют собой модульные белки. CRN-белок содержит высококонсервативную N-терминальную часть с LxLFLAK-мотивом, за которым следуют DWL и HVLVVVP мотивы. Считается, что эта последовательность является горячей точкой рекомбинации, С-конец – вариабелен [2]. Большинство генов обладают сигнальным пептидом. Как и RXLR гены, CRN обычно встречаются в повторяющихся областях генов. Источник их разнообразия – рекомбинация. В основном они локализуются в ядре клетки. Было показано, что белок CRN8 обладает киназной активностью и локализуется в ядрах растений; это указывает на то, что он вмешивается в сигнальные пути хозяина во время инфекции. Делеция этого мотива снижает стабильность белка и уменьшает его способность вызывать гибель клеток [30]. Эффекторы CRN грибов и оомицетов, по-видимому, действуют как регуляторы гибели клеток и подавления иммунитета хозяина. В этом контексте эффекторы должны рассматриваться не только как гены вирулентности, но и как молекулы, позволяющие возбудителям осваивать новые экологические ниши путем устранения потенциальных конкурентов [2].

Набор эффекторов у патогенов постоянно видоизменяется в результате эволюции и коэволюции с растением-хозяином [19], иными словами растение-хозяин является важным фактором естественного отбора и эволюции для патогена [11, 31]. Размер генома P. infestans составляет около 240 млн пн, что значительно превышает геномы P. sojae (95 млн пн) и P. ramorum (65 млн пн) – возбудителей фитофторозной корневой гнили сои и внезапной гибели дуба соответственно. Это связывают с большим количеством повторов ДНК, на которые приходится около 74% генома P. infestans [21]. Кроме того, более трети генома составляют мобильные генетические элементы, наиболее распространены gypsy Pi-1 и LTR (new gypsy long terminal repeat). Геном P. infestans содержит гораздо больше мобильных генетических элементов, чем геномы P. sojae и P. ramorum [32]. Увеличение размера генома, не характерное для паразитов, вероятно представляет собой пример эволюционного компромисса, поскольку затраты на поддержание дополнительной ДНК уравновешиваются функциональными преимуществами, которые она предоставляет [11].

P. infestans, P. sojae и P. ramorum – три основные филогенетические клады рода Phytophthora. Их протеом обогащен генами, участвующими в клеточных процессах, таких как репликация ДНК, транскрипция и трансляция белка, в то время как гены, играющие роль в клеточных защитных механизмах, недопредставлены. Различия обнаруживаются в количестве и репертуаре генов вирулентности, специфичных для каждого хозяина. Сравнение трех геномов рода Phytophthora выявило их необычную организацию, они содержат богатые генами домашнего хозяйства (house-keeping) области, в которых плотность генов относительно высока, а повторы отсутствуют, и участки с низкой плотностью генов с большим числом повторов и мобильных элементов. При этом такие участки не отличаются по содержанию GC от остальной части генома, что согласуется с данными о распространении ретротранспозонов в геноме Phytophthora, предшествующем расхождению нескольких видов [11]. Гены вирулентности, как правило, находятся в таких участках. Таким образом, была сформулирована концепция двухскоростной эволюции генома, согласно которой геном P. infestans состоит из двух частей. Одна часть богата генами, кодирующими RXLR-эффекторы, и эволюционирует быстро. Эта повышенная скорость эволюции достигается за счет того, что мобильные элементы создают высокодинамичные геномные области, обеспечивающие формирование разнообразия, а также за счет создания вставок/делеций или дупликаций [10, 11]. Другая часть содержит гены домашнего хозяйства и эволюционирует медленно, что обеспечивает стабильность основного генома [8, 33]. Схожей организацией генома обладают аскомицет Leptosphaeria maculans [34] и Verticillium dahliae [35].

Вопрос происхождения быстро эволюционирующей части генома мицелиальных фитопатогенов, содержащей специфичные гены вирулентности, рассмотрен в научной литературе [11]. Так как растительные патогены постоянно вовлечены в “гонку вооружений” со своими хозяевами, то они используют модифицированные или расширенные наборы эффекторов, чтобы оптимизировать свою вирулентность [11].

Некоторые эффекторы предотвращают активацию путей передачи сигнала после первичного распознавания белков патогена на внешней поверхности клетки-хозяина. Так, RXLR-эффектор Avr3a P. infestans взаимодействует и стабилизирует Е3-убиквитинлигазу CMPG1, деградация которой положительно регулирует активируемый другими эффекторами апоптоз [36]. RXLR-эффектор Pi02860 P. infestans взаимодействует с фактором восприимчивости растений NLR1 (ассоциированная с куллином Е3-убиквитинлигаза) и подавляет гибель клетки-хозяина только тогда, когда является активированным фактором некроза оомицетов INF1 [37]. Эффекторы могут изменять иммунный ответ путем непосредственного воздействия на факторы транскрипции хозяина, например RXLR-эффектор Pi03192 при связывании с факторами транскрипции NAC в эндоплазматической сети блокирует их перемещение в ядро клетки-хозяина [38]. Эффекторный белок IPIO содержит мотив RGD, способный связываться с интегринами, классом трансмембранных рецепторов. Белки, содержащие такой мотив, нарушают адгезию между плазматическими мембранами и стенками растительной клетки [20]. Белок Avr1 обнаружен в небольших количествах в цитоплазме клетки, где он способен подавлять CRN2 индуцированную клеточную смерть [39] (табл. 1).

В свою очередь эволюция защитной системы растений связана с появлением белков-рецепторов, участвующих в специфическом распознавании эффекторных белков патогенов и индуцирующих развитие “вторичного” ответа. Такие рецепторы являются продуктами генов устойчивости (R-генов) и называются R-белками. Большая часть R-белков структурно относится к семейству белков, содержащих нуклеотид-связывающий домен и богатый лейциновыми повторами домен (NB-LRR) [40]. В отличие от PRRs, распознающих PAMPs, R-белки взаимодействуют со специфичными для определенных патогенов эффекторными белками. При этом реализуется взаимодействие по типу “ген-на-ген”, это означает, что каждому рецептору растения соответствует распознаваемый им фактор авирулентности патогена (эффекторный белок) [41]. Активация R-белков в большинстве случаев приводит к развитию программируемой смерти клеток в локальном участке растения, что физически изолирует инфекцию и предотвращает дальнейшее распространение патогена [42].

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ P. infestans С КАРТОФЕЛЕМ НА МОЛЕКУЛЯРНОМ УРОВНЕ

Такой механизм реализуется и при взаимодействии P. infestans с картофелем. У P. infestans были описаны гены, кодирующие эффекторные белки, относящиеся к классу цитоплазматических RXLR-эффекторов, в частности гены Avr1 [39], Avr2 [43], Avr3a [44], Avr3b [45], Avr4 [46], Avr8 = Avr-Smira2 [23], Avr9a [47], Avr-blb1 = ipiO [48, 49], Avr-blb2 [38] и Avr-vnt1 [50]. При этом у картофеля были охарактеризованы гены, кодирующие R-белки, отвечающие за распознавание специфических эффекторных белков P. infestans. Большая часть этих генов была привнесена в геном картофеля путем интрогрессии генетического материала родственного картофелю дикорастущего мексиканского вида Solanum demissum, устойчивого к фитофторозу [51]. Другие дикорастущие виды также послужили источниками R-генов устойчивости к фитофторозу [52]. Гены расоспецифичной устойчивости к фитофторозу, перенесенные из дикорастущих сородичей картофеля, были охарактеризованы фитопатологическими методами и картированы по фенотипу на нескольких группах сцепления [51, 53], а затем некоторые R-гены были клонированы из дикорастущих сородичей и форм картофеля, содержащих их генетический материал [54, 55], и подробно охарактеризованы, благодаря чему удалось установить некоторые пары эффекторный белок–распознающий его R-белок.

Так, эффекторный белок Avr2 распознается соответствующим R2-белком картофеля при посредстве фосфатазы растения BSU-LIKE PROTEIN1 (BSL1) [56]. Авирулентная форма белка Avr3a распознается продуктом гена R3a [44]. Эффекторный белок Avr3b распознается соответствующей рецепторной киназой R3b [20, 45]. Авирулентный белок IPIO1 взаимодействует с CC-доменом RB киназы и обеспечивает димеризацию двух молекул киназы, необходимую для ее активации [57]. В то же время механизм распознавания белка Avr1 остается неизвестным, отсутствуют доказательства прямого взаимодействия R1 и Avr1, хотя и было показано, что для развития сверхчувствительного ответа необходимо присутствие обоих белков в ядре клетки [39]. Аналогичным образом не известен механизм распознавания эффекторного белка Avr4, так как не известна первичная структура соответствующего гена R4 и кодируемого им рецептора (табл. 2).

Существуют несколько гипотез, объясняющих непрямое распознавание эффектора. Согласно “сторожевой” гипотезе (guard hypothesis) R-белки ассоциированы с белками-мишенями Avr-генов. Взаимодействие эффекторного белка с белком-мишенью приводит к изменению структуры последнего, что распознается R-белком и приводит к запуску иммунного ответа. Такой механизм взаимодействия был показан для Avr2 и R2. “Обманная модель” (decoy model) предполагает, что белок-посредник не является мишенью эффектора, а является его структурным аналогом, который конкурирует за связывание с эффектором. Согласно “модели приманки” (bait-and-switch model) белки устойчивости могут связывать эффекторы только после того, как они образуют комплекс с белком-посредником. При этом может резко возрастать сродство комплекса растительный белок-посредник/эффектор к R-белку [58].

Распознавание эффекторных белков приводит к узнаванию патогена, в результате он не способен заразить растение. Поэтому в ходе эволюции в геноме P. infestans появились мутантные формы генов вирулентности, продукты которых избегают распознавания защитной системой хозяина. Например, вирулентный гомолог эффектора Avr2 – Avr2-like также взаимодействует с BSL1, однако ассоциации комплекса Avr2-like BSL1 с R2-киназой не происходит, что приводит к развитию заболевания [56, 59]. Вирулентная форма белка Avr3a – Avr3a_EM не распознается продуктом гена R3a и отличается от авирулентной формы Avr3a_KI аминокислотными заменами в эффекторном домене [44]. Для гена Avr4 характерен сдвиг рамки считывания, приводящий к образованию укороченных белков, которые не распознаются продуктом соответствующего гена устойчивости, но при этом остаются вирулентными. Штаммы P. infestans, содержащие полноразмерный белок Avr4, всегда являются авирулентными на растениях, содержащих R4 [60, 61]. В случае генов ipiO расы P. infestans, экспрессирующие эффектор IPI-O4, преодолевают устойчивость растений, несущих ген RB/Rpi-blb1, так как IPIO4 блокирует димеризацию молекул киназы RB и тем самым препятствует узнаванию патогена [57].

Таким образом, выявление молекулярно-генетических основ взаимодействия патогена и хозяина привело к лучшему пониманию механизмов микроэволюционных процессов, протекающих в популяциях P. infestans. В практическом отношении эти исследования оказались очень важны потому, что от набора генов вирулентности зависит степень поражения растений в посадках картофеля и, соответственно, размер потерь урожая. Изучение механизмов изменчивости у P. infestans на молекулярном уровне в дальнейшем может способствовать разработке мер борьбы с фитофторозом картофеля.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 18-016-00144 А.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.