Генетика, 2020, T. 56, № 3, стр. 361-365

По объему производства картофель Solanum tuberosum является важнейшей незерновой крахмалоносной культурой в мире. После уборки клубни картофеля хранят при температуре 2–4°С для предотвращения прорастания, сохранения процента влажности и снижения патогенеза. Однако воздействие низких температур приводит к холодовому осахариванию клубней (cold-induced sweetening, CIS), что заключается в накоплении редуцирующих сахаров в результате гидролиза крахмала и сахарозы [1, 2].

Крахмал в растениях накапливается в пластидах: запасной – в амилопластах гетеротрофных органов; транзиентный – в хлоропластах фотосинтезирующих листьев [3, 4]. Гидролитический путь деградации крахмала считается основным, что подтверждается ростом активности крахмал-гидролизующих ферментов [5], прежде всего α-амилаз (AMY, EC 3.2.1.1) и β-амилаз (BAM, EC 3.2.1.2) [6, 7]. В геноме картофеля идентифицировано десять генов BAM и пять AMY, активность продуктов которых специфична к различным субстратам и клеточным структурам (хлоропласты, амилопласты и др.) [8, 9]. Показано, что в ответ на низкие температуры в клубнях картофеля происходит активация транскрипции генов StAmy23, StBAM1 и StBAM9 [8, 10]. Продукты этих генов, α-амилаза StAmy23 и β-амилазы StBAM1 и StBAM9, участвуют в индуцированной холодом деградации крахмала в амилопластах клубней [8]. StBAM9 непосредственно связывается с крахмальными зернами, обеспечивая высвобождение растворимых глюканов, гидролиз которых продолжается в амилопластах под действием StBAM1 и завершается в цитозоле при участии StAmy23 [8].

В свою очередь, активность амилаз регулируется на посттрансляционном уровне ингибитором амилаз (Amylase Inhibitor, AI) [11, 12]. Пространственная структура белков AI высоко консервативна среди различных видов растений [13]. Показано, что AI способен связываться с амилазой либо блокируя активный сайт фермента, либо изменяя его конформацию, тем самым снижая каталитическую активность [14, 15]. У картофеля ген, кодирующий ингибитор амилаз, впервые клонирован у вида S. berthaultii (SbAI) [16]. Экспериментально подтверждено, что белок SbAI взаимодействует с каждой из амилаз – StAmy23, StBAM1 и StBAM9 [16].

Показано, что в клубнях CIS-устойчивых растений картофеля экспрессия гена SbAI выше в сравнении с CIS-чувствительными, что подтверждает наличие негативной корреляции между количеством транскриптов SbAI и содержанием редуцирующих сахаров [16]. При этом показано, что сверхэкспрессия гена SbAI в клубнях CIS-чувствительного картофеля, хранящихся при низких температурах, сопровождается снижением уровня транскрипции генов амилаз (в том числе StBAM1, StBAM9 и StAmy23) и степени деградации крахмала [16]. Подавление экспрессии гена SbAI в клубнях CIS-устойчивого картофеля оказывает незначительное положительное влияние на уровень экспрессии генов амилаз, при этом наблюдается существенный рост содержания редуцирующих сахаров [16]. Таким образом, можно говорить об обратной корреляции между уровнями экспрессии гена ингибитора и генов амилаз. Учитывая посттрансляционный характер ингибирования амилаз белком SbAI, предполагается, что возможным сигналом, запускающим экспрессию амилазных генов в клубнях картофеля, являются концентрации редуцирующих сахаров [16]. Учитывая вышесказанное, подавление каталитической активности амилаз, индуцируемых низкими температурами, – одна из функций SbAI картофеля.

Целью данной работы стало определение профиля экспрессии гомологов гена ингибитора амилаз SbAI при длительном низкотемпературном хранении в клубнях различных сортов S. tuberosum, а также при кратковременном холодовом стрессе в листьях разных видов картофеля (род Solanum, секция Petota).

Профиль экспрессии гена SbAI определяли в клубнях картофеля (S. tuberosum) пяти сортов российской селекции: Барин, Красавчик, Надежда, Северное сияние и Утро. Растения выращивали в 2017 г. в полевых условиях (ВНИИКХ им. А.Г. Лорха). В сентябре клубни были собраны и заложены на хранение в картофелехранилище при температуре 4^оС. Экспрессионный анализ был проведен методом РВ-ПЦР в двух биологических повторах в трех временных точках: в сентябре (сразу после сбора урожая), в феврале (спустя пять месяцев хранения) и в апреле (спустя семь месяцев хранения). Таким образом, представленный анализ экспрессии отражает сезонные изменения, происходящие в клубнях с момента сбора урожая до момента начала прорастания.

Профиль экспрессии гена SbAI в ответ на кратковременный холодовой стресс определяли в листьях S. tuberosum (сорт Надежда) и четырех дикорастущих видов картофеля – S. demissum (CGN 20568), S. kurtzianum (ВИГРР K-11969), S. chacoense (ВИГРР K-3678) и S. vernei (ВИГРР K-20832). Данные виды были выбраны, так как обладают различной степенью устойчивости к холодовому стрессу [17]. Растения были выращены при нормальных температурных условиях (23/25°С, 16/8 ч – день/ночь, теплица) и подвергнуты холодовому стрессу (4°С, 72 ч, 16/8 ч – день/ночь, климокамера). Также в листьях определяли содержание общего крахмала. Для этого 500 мг листового материала гомогенизировали в 4.5 мл раствора (33% v/v DMSO; 0.44 мМ HCl), инкубировали при 60°С 30 мин и охлаждали до 25°С. Смесь разводили 1 : 5 водой (mQ), доводили pH до 4.5 и фильтровали. Содержание крахмала в фильтрате определяли спектрофотометрически с использованием набора Starch (R-Biopharm, Швейцария).

На основе последовательности SbAI S. tuberosum (XM_006355976.2) были разработаны специфичные праймеры для определения экспрессии гена методом количественной ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) (SbAIrtF: 5'-TTGTAACATGGCTCGCGTTC-3' и SbAIrtR: 5'-TGTTGGTGAAGCACTTGGAG-3'). Суммарную РНК из клубней и листьев и синтезированную на ее основе кДНК (GoScript, Promega, США) использовали для определения экспрессии гена SbAI. РВ-ПЦР проводили с применением набора “Реакционная смесь для проведения РВ-ПЦР в присутствии SYBR GreenI и ROX” (ЗАО “Синтол”, Россия) в следующих условиях: 95°C – 5 мин; 40 циклов (95°C – 15 с, 60°C – 50 с). Для оценки уровня относительной экспрессии в качестве референсных использовали гены ef1α и sec3 с использованием праймеров: ef1αF (5'-ATTGGAAACGGATATGCTCCA-3') и ef1αR (5'-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3') [18]; sec3F (5'-GCTTGCACACGCCATATCAAT-3') и sec3R (5'-TGGATTTTACCACCTTCCGCA-3') [19]. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPadPrism 7.02 (https://www.graphpad.com).

Проведенный анализ экспрессии SbAI показал, что у всех исследованных сортов картофеля в процессе хранения происходит снижение уровня транскрипции данного гена (рис. 1 ,а). В свежесобранных клубнях (сентябрь) уровни экспрессии SbAI существенно различались. Максимальная экспрессия SbAI была детектирована в клубнях сорта Северное сияние, минимальная экспрессия была характерна для сортов Красавчик и Надежда. После пяти месяцев хранения при 4°С (февраль) у сортов Красавчик и Северное сияние произошло наиболее резкое снижение экспрессии SbAI в клубнях, тогда как у сортов Барин и Утро – более плавное, а у сорта Надежда экспрессия SbAI практически не изменилась. После семи месяцев хранения (апрель) у всех исследуемых сортов картофеля были детектированы лишь следовые количества транскриптов гена ингибитора амилаз SbAI.

Полученные данные соотносятся с тем фактом, что при долгосрочном хранении в условиях пониженной температуры в картофелехранилище клубни переходят в состояние физиологического покоя, и биохимические процессы в клетках замедляются. Распад крахмала – основного источника энергии в клубнях происходит с низкой интенсивностью, главным образом для дыхания. Так, показано, что за 2–3 нед. хранения при 10°С клубни теряют около 1 г крахмала при интенсивности дыхания 3–5 мг CO₂ кг^–1 ч^–1 [4]. В зависимости от генотипа и внешних условий стадия физиологического покоя клубней картофеля длится, как правило, 6–12 нед., но для ряда сортов может достигать и 27 нед. [4]. Переход от стадии покоя к прорастанию сопровождается увеличением интенсивности дыхания, потерей воды, повышением содержания гликоалкалоидов, а также накоплением редуцирующих сахаров [4]. Редуцирующие сахара образуются в результате гидролиза крахмала при повышении экспрессии генов амилаз [10, 20] и подавлении экспрессии гена ингибитора амилаз SbAI, что показано в настоящей работе для всех пяти исследуемых сортов S. tuberosum (рис. 1 ,а).

Таким образом, нами было показано снижение уровня экспрессии гена SbAI в процессе длительного хранения клубней при низких температурах в течение семи месяцев. Клубень картофеля – это специализированный запасающий орган, в результате эволюционной адаптации приобретший способность выдерживать длительное воздействие пониженных температур в покоящемся состоянии. Поэтому мы считаем, что полученные результаты в большей мере отражают характер поведения SbAI в ответ на состояние физиологического покоя клубней, нежели на холодовой стресс. В связи с этим для оценки ответа SbAI на воздействие низких температур следующий эксперимент был проведен на листьях растений картофеля, для которых в отличие от клубней температура 4°С является стрессовой.

Ранее экспрессия гена ингибитора амилаз в листьях картофеля в условиях холодового стресса не изучалась. Поэтому в настоящей работе была определена динамика экспрессии гена ингибитора амилаз SbAI в листьях одного из исследуемых сортов S. tuberosum – Надежда до и после воздействия холодового стресса. Одновременно было измерено содержание крахмала в листьях. Как видно из рис. 1 ,б, в ответ на стресс происходит резкое (в 7–8 раз) повышение транскрипции гена SbAI, что сопровождается полным распадом крахмала (от 2.2 до 0 мг/г).

Представлялось интересным сравнить полученные нами данные для S. tuberosum с ответом гена SbAI на холодовой стресс у других видов картофеля, чтобы понять является ли характер экспрессии гена SbAI видоспецифичным или же универсальным для видов картофеля секции Petota [17]. Для этого растения четырех видов картофеля (S. demissum, S. kurtzianum, S. chacoense и S. vernei) с различной степенью устойчивости к низким температурам [17] были проанализированы на предмет изменения профиля экспрессии гена SbAI и содержания крахмала в листьях до и после холодового стресса (рис. 1 ,б).

В результате было выявлено, что у всех анализируемых образцов четырех видов картофеля, как и у S. tuberosum, уровень экспрессии гена ингибитора амилаз SbAI в ответ на холодовой стресс увеличивался (рис. 1 ,б). Как и у S. tuberosum, у остальных четырех видов увеличение уровня экспрессии SbAI сопровождалось резким уменьшением содержания крахмала в листьях: S. demissum – с 0.07 до 0 мг/г, S. kurtzianum – с 1.34 до 0.44 мг/г, S. chacoense – с 2.68 до 0 мг/г; S. vernei – с 1.49 до 0.14 мг/г.

Надо отметить, что анализируемые виды довольно сильно различались как по исходной концентрации крахмала в листьях, так и по степени уменьшения его количества после стресса. Так, у S. tuberosum и S. chacoense после стресса крахмал распался полностью, тогда как исходное его количество было практически одинаковым у данных видов и при этом максимальным среди анализируемых образцов. Уровни экспрессии гена SbAI в листьях S. tuberosum и S. chacoense после стресса были статистически сопоставимы и также характеризовались максимальными значениями. У S. demissum, S. kurtzianum и S. vernei наблюдалась другая динамика. Транскрипция гена SbAI в листьях этих видов также выросла в ответ на стресс, но существенно меньше, чем у S. tuberosum и S. chacoense (рис. 1 ,б). Минимальный рост экспрессии наблюдался у S. demissum, что очевидно соотносится с наименьшим исходным количеством крахмала в листьях среди анализируемых образцов четырех видов. Таким образом, прослеживается корреляция между исходным количеством крахмала в листе и уровнем экспрессии гена ингибитора амилаз в ответ на холодовой стресс. Можно предположить, что воздействие низких температур стимулирует накопление и активность амилаз и, как следствие, усиленную деградацию крахмала. Это согласуется с ранее показанным ростом экспрессии генов амилаз и активности соответствующих ферментов в ответ на воздействие низких температур в листьях картофеля, Arabidopsis thaliana и других видов растений [21–23]. При этом высвобождающиеся сахара могут, в свою очередь, служить сигналом для повышения транскрипции гена ингибитора амилаз SbAI, продукт которого способен предотвращать распад крахмала и/или регулировать данный процесс, и чем больше сахаров, тем выше экспрессия SbAI.

Представленные результаты в совокупности с ранее полученными [2, 12, 22] будут способствовать более глубокому пониманию молекулярно-генетических механизмов ответа картофеля на низкие температуры как при длительном хранении клубней (состояние физиологического покоя), так и при холодовом стрессе.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №17-29-08017) и Министерства науки и высшего образования РФ и ФНТП развития сельского хозяйства РФ на 2017- 2025 годы (подпрограмма “Развитие селекции и семеноводства картофеля в Российской Федерации”). Растения выра щивались с использованием эксперимен- тальной установки искусственного климата ЭУИК (Институт биоинженерии ФИЦ Биотехнологии РАН).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Рис. 1.

Изменение экспрессии гена ингибитора амилаз SbAI: а – в процессе низкотемпературного долговременного хранения клубней культивируемого картофеля (С – сентябрь, Ф – февраль, А – апрель); б – в листьях различных видов картофеля в нормальных условиях (н. у.) и в ответ на холодовой стресс (хол.).