1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 56, № 4, 2020

Генетика, 2020, T. 56, № 4, стр. 433-439

Генетическая однородность подвидов каменного глухаря Tetrao parvirostris parvirostris Bonaparte, 1856 и T. p. kamtschaticus Kittlitz, 1858 (Tetraonidae, Aves) по митохондриальной и ядерной ДНК

Л. Н. Спиридонова 1, *, Е. Г. Лобков 2, С. В. Шедько 1, А. П. Крюков 1

1 Федеральный научный центр биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии Дальневосточного отделения Российской академии наук
690022 Владивосток, Россия

2 Камчатский государственный технический университет
683003 Петропавловск-Камчатский, Россия

* E-mail: spiridonova@biosoil.ru

Поступила в редакцию 22.04.2019
После доработки 04.06.2019
Принята к публикации 24.06.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Впервые проведено секвенирование полного митохондриального генома четырех особей двух подвидов каменного глухаря Tetrao parvirostris parvirostris (материковая популяция) и T. p. kamtschaticus (п-ов Камчатка), сем. Tetraonidae. Генетическая дивергенция между материковым и камчатским подвидами составила 0.1% и находится на уровне индивидуальной изменчивости. На фоне высокого гаплотипического разнообразия выявлен низкий нуклеотидный полиморфизм мтДНК и показано отсутствие межподвидовой генетической дифференциации, что может отражать молодость камчатского изолята и консервативность митохондриального генома для вида в целом. Анализ фрагмента ядерного гена OCA2, связанного с окраской и кодирующего транс-мембранный P-белок, выявил идентичность материкового и камчатского подвидов. Такое отсутствие дивергенции по митохондриальному и ядерному маркерам между материковой и камчатской популяциями каменного глухаря противоречит их морфологическим отличиям. Появление изолированной популяции каменного глухаря на Камчатке – вероятно следствие сокращения ранее большого ареала материковой популяции с образованием настоящего разрыва либо недавней инвазии с материка.

Ключевые слова: каменный глухарь, Tetrao parvirostris, митохондриальный геном, ген OCA2, внутривидовая изменчивость.

Каменный глухарь представлен на Камчатке эндемичным для полуострова подвидом Tetrao parvirоstris kamtschaticus Kittlitz, 1858. Он хорошо отличается морфологически от других подвидов, независимо от того, сколько и где в границах видового ареала их выделять. Эти отличия сводятся, прежде всего, к более светлой окраске оперения камчатских птиц: белые партии в их оперении более обширные и развиты в наибольшей степени. Даже с учетом индивидуальной изменчивости если окраска оперения птиц, принадлежащих T. p. kamtschaticus и другим подвидам, оказывается сходной на одних перьях или участках тела, то всегда сильно отличается на других именно редукцией пигментов у камчатских особей. Кроме того, у камчатских птиц заметна тенденция к более крупным размерам тела [1].

Ареал камчатского каменного глухаря представлен географическим изолятом в границах п‑ова Камчатка (рис. 1). Он регулярно населяет высокоствольные леса к северу до широты рек Карага и Шаманка [1, 2]. Еще севернее известны единичные встречи в бассейне Тымлата, а ранее указывалось на возможность встречи даже в бассейне Вывенки [3], хотя уже многие годы подтверждения тому нет.

Рис. 1.

Ареал подвидов каменного глухаря (по интернет-ресурсу http://www.birds-online.ru/ с авторскими исправлениями): 1 – T. p. parvirоstris (фото, http://xn–80afahik1bacv9b3i.xn–p1ai/taxon/380/kamennyj_gluhar/); 2 – T. p. kamtschaticus (фото Е. Говоровой; Природный парк “Налычево”, Камчатка); 3 – T. p. stegmanni.

Как известно [4, 5], каменный глухарь – таежный вид, ареал которого в общих чертах совпадает с распространением, главным образом, светлохвойных, прежде всего лиственничных и смешанных с лиственницей лесов. В границах п-ова Камчатка каменный глухарь гнездится в лесах разного облика. В бассейне р. Камчатка он населяет в основном хвойные и смешанные леса из лиственницы Каяндера (Larix cajanderi) и ели аянской (Picea ajanensis), сформировавшиеся здесь относительно недавно, буквально за последние несколько тысяч лет в форме “хвойного острова” [6], а по современным данным [7] даже менее того – около полутысячи лет назад. В восточных и западных районах полуострова он населяет только леса из каменной (Betula еrmanii) и плосколистной (Betula platyphylla) берез, так как хвойных древостоев в этой части Камчатки просто нет (за исключением крошечной рощи пихты камчатской Abies gracilis площадью 23 га в низовье р. Новый Семячик). Пойменных лесов, всегда влажных, камчатский каменный глухарь на Камчатке избегает.

Корякское нагорье, Парапольский дол и Пенжинский хребет, лежащие к северу от п-ова Камчатка, образуют область дизъюнкции ареала. Далее к северо-западу каменный глухарь появляется только в верхней части бассейна р. Пенжины, где произрастают лиственничники из Larix dahurica, заходящие сюда со стороны бассейнов Колымы и Анадыря. Эти леса образуют на Пенжине восточную границу лиственничных редколесий, характерных для обширных регионов Восточной Сибири. Здешняя популяция каменного глухаря принадлежит уже номинативному подвиду Tetrao parvirostris рarvirostris Bonaparte, 1856 [8], область распространения которого лежит к западу от Камчатки и занимает большую часть ареала вида на континенте. Основная часть популяции каменного глухаря в бассейне Пенжины сосредоточена именно в границах произрастания лиственничных и смешанных с лиственницей лесов. За их пределами есть информация о возможных встречах с глухарями в долине р. Белой [8].

Учитывая вышесказанное, представляет большой интерес определение генетических различий между камчатским каменным глухарем и его номинативной формой. Это важно, прежде всего, для понимания генетических основ известного в орнитологии феномена, называемого “подвидовым эндемизмом в авифауне Камчатки” [1, 2, 9–13 и др.], суть которого в том, что большинство эндемичных камчатских подвидов отличаются той или иной степенью депигментации оперения [1]. Кроме того, это позволило бы уточнить молекулярными методами таксономический статус верхнепенжинской популяции вида, принадлежность которой к номинативной расе по морфологическим признакам не вызывает сомнений. Поставленные задачи решались молекулярно-генетическими методами с применением маркеров митохондриальной и ядерной ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор образцов тканей камчатского каменного глухаря проводился в разных районах п-ова Камчатка и бассейна Пенжины. Для анализа полных митохондриальных геномов и ядерного гена OCA2 двух подвидов каменного глухаря использованы по две особи каждого подвида: T. p. parvirostris (верховья р. Пенжины, № 2318, 2528); T. p. kamtschaticus (долина р. Камчатки, № 1-1; юг Камчатки, Елизовский р-н, № 2317). ДНК выделяли из образцов мышечной ткани, фиксированной в 96%-ном этаноле, с помощью набора QIAgenDNeasy® TissueKit (Qiagen, Inc.) по методике производителя.

Секвенирование митохондриальных геномов проведено методом пиросеквенирования на Roche GS Junior. Приготовление быстрой библиотеки с лигированными адаптерами, проведение эмульсионной ПЦР, секвенирование с реагентами GS Junior Titanium Series выполнялись согласно инструкциям фирмы-изготовителя прибора и реактивов – 454 Life Science Corp., Roche Company, Branford, CT 06405, США. Все митогеномы были прочитаны со средним покрытием ×300. Нуклеотидные последовательности собирали с помощью программы GS De Novo Assembler (http://454.com/products/analysis-software/index.asp).

В дополнение к митохондриальной ДНК использован ядерный ген OCA2, отвечающий за синтез интегрального мембранного Р-белка, который переносит тирозин в меланосомы и может влиять на окраску оперения. Синтез фрагмента ядерного гена OCA2 длиной около 1100 пн проводился с праймерами OCA21470-Fw (5'-TTATGGTTACTGGAGTAAAGAGCAG-3') и OCA21659-Rv (5'-CCATATTTTCAGAGACTGGATTCT-3') в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 20 нг ДНК, 1× Taq M green Master mix (АлкорБио) и пять пикомолей каждого праймера. Программа амплификации: 95°C – 15 мин; 35 циклов синтеза фрагмента: 95°C – 30 с, 54°C – 20 с, 72°C – 60 с; 72°C – 30 мин. Продукты амплификации были использованы для циклического секвенирования с набором реагентов ABI PRISM®BigDyeTM Terminator v. 3.1. Реакцию присоединения метки проводили с теми же праймерами. Результаты прочитывали на автоматическом лазерном секвенаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США/Hitachi, Япония). Секвенирование по обоим маркерам выполнено на приборной базе ЦКП “Биотехнология и генетическая инженерия” ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН, г. Владивосток. Полученные последовательности митохондриальной ДНК и гена OCA2 депонированы в базу данных GenBank NCBI (№ 2318 – MK820675, MK881595; 2528 – MK820678, MK881596; 1-1 – MK820676, MK881593; 2317 – MK820677, MK881594 соответственно).

Прямые и обратные последовательности фрагмента гена OCA2 были собраны в пакете программ Staden 1.53 [14] и выровнены в программе ClustalW, предложенной в MEGA7 [15]. Для анализа гаплотипического (H) и нуклеотидного (π) разнообразия [16] митохондриальной ДНК использовали программу DnaSP 5.0 [17]. Количество нуклеотидных замен определено по методу MCL (Maximum Composite Likelihood) по всем позициям кодонов, включающим транзиции и трансверсии. Нуклеотидные замены и скорость замещения были посчитаны по модели GTR-G-I (General Time Reversible + G + I) (BIC = 174252.067), реализованной в MEGA7. Генетические связи гаплотипов анализировали методом ML. Достоверность ветвей филогенетического дерева тестировали при 500 репликациях. Для сравнительного анализа из Генбанка были взяты полные митогеномы следующих представителей сем. Тетеревиные: Tetrao urogallus aquitanicus MG583885; Lyrurus tetrix KF955638; Lagopus lagopus KX609784; Lagopus muta KX609785; в качестве внешней группы использованы Bonasa (Tetrastes) bonasia FJ752435 и Tetrastes sewerzowi NC_025318. Кроме того, дополнительно из Генбанка были использованы последовательности контрольного региона трех образцов каменного глухаря (AF532462 T. p. kamtschaticus (Камчатка), T. p. parvirostris AF532463 (Магадан) и AF532464 (Хабаровск)) и 10 образцов шести подвидов близкородственного обыкновенного глухаря Tetrao urogallus из разных мест обитания (AF532465 T. u. uralensis (Урал); AF532466 T. u. lonnbergi (Мурманск); AF532467 T. u. pleskei (Тверь); AJ297154 T. u. urogallus (Швеция); AY750945, AY750947, AY750948, MG583885 T. u. aquitanicus (Испания, Пиренеи); AY750939, AY750940 T. u. cantabricus (Испания, Кантабрийские горы)). Подвидовая принадлежность некоторых образцов была определена по местам сбора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного секвенирования впервые получены полные митогеномы (16 685–16 696 пар нуклеотидов) для двух подвидов T. parvirostris. Структура (количество и расположение кодирующих генов) митогенома каменного глухаря соответствует данным для видов семейства Tetraonidae, хранящимся в Генбанке. Анализ митогеномов parvirostris и kamtschaticus выявил низкую нуклеотидную изменчивость, а обнаруженные полиморфные сайты (всего 32 замены, из которых 29 уникальные и 3 парсимони-информативные) у этих подвидов перекрываются (табл. 1). Все особи несут уникальные гаплотипы (Hd = 1 ± 0.177), однако их нуклеотидное разнообразие имеет низкое значение (π = 0.00114 ± 0.00027), что указывает на близкородственные связи исследованных птиц материковой и камчатской популяций. Необходимо отметить, что индивидуальные различия исследованных птиц превышают межподвидовые значения.

Таблица 1.  

Полиморфные сайты митогеномов T. parvirostris с указанием позиций в геноме

Наличие в Генбанке последовательностей контрольного региона мтДНК для обыкновенного глухаря Tetrao urogallus позволило провести сравнение двух видов глухарей и их внутривидовой изменчивости. В табл. 2 представлены попарные генетические дистанции между каменным глухарем, обыкновенным глухарем и родами семейства Tetraonidae. Межподвидовые дистанции каменного глухаря оказались на уровне индивидуальных отличий с минимальными значениями (0.1–0.2%). Такая же ситуация наблюдается между подвидами обыкновенного глухаря uralensis, pleskei и lonngbergi (0–0.2%), за исключением двух испанских изолятов aquitanicus и cantabricus, которые дифференцированы от других подвидов глухаря (0.7–1.3%). Несмотря на это, различия между гаплотипами мтДНК птиц из этих изолятов близки к вышеприведенным межподвидовым значениям (0.3%). Дивергенция между двумя видами глухарей (3.2–3.7%) оказалась на порядок выше межподвидовых значений. Филогенетический анализ митохондриальных геномов обнаружил более близкую связь каменного глухаря с тетеревом-косачем L. tetrix (4.7%), чем последнего с обыкновенным глухарем (5.7–6.2%). Такая же ситуация оказалась по различиям митогеномов T. parvirostris и T. urogallus с родом Lagopus (куропатки) (8.5 и 8.9% соответственно). Наибольшие отличия выявлены для митогеномов родов Tetrao и Tetrastes, генетическая дистанция между ними составила в среднем 12–14%. Эти соотношения соответствуют общепринятым в орнитологии представлениям по систематике семейства Tetraonidae.

Таблица 2.  

Попарные генетические р-дистанции между видами и подвидами тетеревиных птиц по данным полной последовательности и контрольному региону митохондриальной ДНК

Вид/подвид 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1. T. p. parvirostris –                      
2. T. p. kamtschaticus 0.002 –                    
3. T. u. aquitanicus 0.032 0.033 –                  
4. T. u. uralensis 0.036 0.036 0.011 –                
5. T. u. pleskei 0.037 0.037 0.013 0.002 –              
6. T. u. lonngbergi 0.036 0.036 0.011 0.002 0.000 –            
7. T. u. urogallus 0.037 0.037 0.007 0.016 0.018 0.016 –          
8. T. u. cantabricus 0.032 0.033 0.003 0.01 0.012 0.01 0.007 –        
9. L. tetrix 0.047 0.047 0.058 0.061 0.062 0.061 0.061 0.057 –      
10. L. lagopus 0.086 0.086 0.086 0.088 0.087 0.088 0.089 0.085 0.09 –    
11. L. muta 0.084 0.084 0.089 0.092 0.091 0.092 0.093 0.089 0.094 0.046 –  
12. T. bonasia 0.122 0.121 0.136 0.133 0.135 0.133 0.138 0.135 0.122 0.13 0.131 –
13. T. sewerzowi 0.12 0.119 0.134 0.135 0.137 0.135 0.138 0.134 0.123 0.131 0.132 0.045

Для реконструкции филогенетических отношений использованы образцы с полными митохондриальными геномами совместно с образцами, для которых прочитан только контрольный регион (CR) (рис. 2). Представленное дерево показывает, что этот митохондриальный маркер так же хорошо, как и полный митохондриальный геном, во всех случаях достоверно (100%) разделяет все проанализированные виды тетеревиных. Реконструкция связей иллюстрирует обособление всех представленных видов. Образцы каменного глухаря образуют единый кластер гаплотипов с высокой статистической поддержкой (100%). Этот кластер объединяет не только образцы из Камчатки и Пенжины, но и более южные материковые образцы из Магадана и Хабаровска. Различия между гаплотипами минимальны и обусловлены единичными мутациями.

Рис. 2.

Филогенетические отношения некоторых представителей семейства Tetraonidae, реконструированные по данным полных митогеномов (*) и контрольных регионов (CR) методом максимального правдоподобия. В узлах ветвлений приведены значения бутстреп-поддержки более 95%.

Несколько иная ситуация наблюдается у обыкновенного глухаря, у которого выделяется филогеографическая структура с двумя филогенетическими линиями: западно-европейской (aquitanicus–cantabricus–urogallus) и восточно-европейской (uralensis–pleskei–lonngbergi). Первая филогруппа представлена почти не различающимися образцами от двух изолированных подвидов из Испании и образцом от номинативного подвида из Швеции, дивергировавшим несколько сильнее. Вторая филогруппа гомогенна и соответствует трем подвидам из северной и восточной Европы. В целом этот вид демонстрирует разные уровни внутривидовой дифференциации, что соответствует более обширному ареалу и предположительно более длительному времени его формирования, чем для камчатского подвида каменного глухаря. Необходимо также отметить, что наличие изолятов и обширные ареалы у этих видов обнаружили разную картину становления видовых ареалов, но, несмотря на это, межподвидовые генетические дистанции в филогруппах обоих видов имеют одинаково низкие значения.

Тетерев L. tetrix образует сестринский таксон по отношению к глухарям. Представители родов Tetrastes и Lagopus формируют обособленные монофилетические кластеры. Более подробное рассмотрение филогенетических связей в семействе тетеревиных не входило в задачи настоящей работы.

Полные митохондриальные геномы каменного глухаря ранее не были описаны, а его часть — контрольный регион — использован в нескольких работах по филогении тетеревиных. В них попутно не выявлено различий между теми же двумя подвидами по образцам из Камчатки, Магадана и Хабаровска [18]. Лишь межвидовые сопоставления для построения филогений проведены по трем [19] и пяти митохондриальным генам [20].

В дополнение к анализу митохондриальной ДНК нами проанализированы последовательности фрагмента ядерного гена OCA2 (1097 пн), участвующего в переносе меланина в меланосому, у четырех образцов каменного глухаря. Анализ фрагмента ядерного гена OCA2 не выявил подвидоспецифичных признаков у исследованных образцов. Обе птицы с верховьев р. Пенжины и одна с юга Камчатки по этому маркеру оказались идентичными гетерозиготами, на одном из аллелей выявлена только одна транзиция T/C. Особь с долины р. Камчатка (№ 1-1) оказалась гомозиготой по этому фрагменту. Это свидетельствует о высокой консервативности выбранного фрагмента гена OCA2, несмотря на то что в его состав входят как кодирующие, так и некодирующие участки.

Митохондриальная ДНК издавна служит надежным маркером для решения разнообразных популяционно-генетических и таксономических задач на уровне от подвидового до родового. Благодаря быстрому накоплению мутаций в мтДНК их количество часто служит показателем дивергенции и свидетельством предшествующей изоляции. До недавних пор в анализах использовались один или несколько генов либо участков мтДНК, но в последнее время совершенствование методик молекулярной генетики позволяет получать и сопоставлять полные последовательности митогеномов. При этом разрешающая способность маркера существенно увеличилась. Поэтому даже единичные образцы от каждого подвида, проанализированные нами, дают достоверную оценку сходства или различия геномов. В данном случае различий между камчатским и номинативным материковым подвидами каменного глухаря не обнаружено. Оба подвида образуют единый кластер на филогенетическом дереве (рис. 2) и не имеют подвидоспецифических признаков. Сопоставление двух видов глухарей по анализу отдельного участка мтДНК (CR) подтверждает их монофилетическое происхождение, но демонстрирует разную внутривидовую структуру, отражающую пути микроэволюции. Использованный дополнительно к мтДНК ядерный ген OCA2 также не обнаружил различий между подвидами каменного глухаря. Полученные результаты свидетельствуют о их несомненной близости и относительной молодости камчатского подвида каменного глухаря, что подтверждает приведенные в статье палеогеографические и палеоботанические данные по недавнему формированию камчатских лесов.

Выражаем глубокую признательность камчатским охотникам В.В. Смирнову, П.П. Сычеву и Ю.Ф. Муляру за сбор и доставку образцов глухарей с п-ова Камчатка и бассейна р. Пенжина. Результаты получены с использованием оборудования ЦКП “Дальневосточный вычислительный ресурс” ИАПУ ДВО РАН (https://www.cc.dvo.ru).

Работа выполнена при поддержке программы Дальний Восток Президиума ДВО РАН, грант № 18-4-031.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Лобков Е.Г. Камчатка как локальный центр формообразования у птиц // Биология и охрана птиц Камчатки. М.: Диалог – МГУ, 1999. Вып. 1. С. 5–23.

  2. Лобков Е.Г. Гнездящиеся птицы Камчатки. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1986. 292 с.

  3. Куренцов А.И. Зоогеография Камчатки // Фауна Камчатской области: Тр. Камчатской комплексной экспедиции. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1963. С. 4–60.

  4. Потапов Р.Л. Отряд Курообразные (Galliformes). Семейство тетеревиные (Tetraonidae). Л.: Наука, 1985. 638 с.

  5. Потапов Р.Л. Каменный глухарь – Tetrao urogalloides Middendorff, 1851 // Птицы СССР. Курообразные, журавлеобразные. Л.: Наука, 1987. С. 186–197.

  6. Хотинский Н.А. Голоцен Северной Евразии: опыт трансконтинентальной корреляции этапов развития растительности и климата: к X Конгрессу INQUA (Великобритания, 1977): моногр. / Под ред. Хотинского Н.А. М.: Наука, 1977. 198 с.

  7. Dirksen V., Dirksen O., Diekmann B. Holocene vegetation dynamics and climate change in Kamchatka Peninsula, Russian Far East // Rev. Palaeobotany and Palynology. 2013. V. 190. P. 48–65. https://doi.org/10.1016/j.revpalbo.2012.11.010

  8. Лобков Е.Г. Птицы бассейна реки Пенжины // Орнитология. М.: МГУ, 2011. Вып. 36. С. 39–102.

  9. Stejneger L. Results of ornithological explorations in the Commander Islands and in Kamchatka // Bull. U. S. Nat. Museum. 1885. 29. 382 p.

  10. Бианки В.В. Отчет о командировке в Камчатку в 1908 году // Изв. Импер. акад. наук. 1909. 1(6). С. 23–52.

  11. Аверин Ю.В. Птицы Камчатского полуострова: Автореф. дис. … докт. биол. наук. Л.: ЗИН АН СССР, 1958. 22 с.

  12. Портенко Л.А. Очерк фауны птиц Корякского нагорья // Проблемы орнитологии. Львов, 1964. С. 57–66.

  13. Лобков Е.Г. Птицы Камчатки (география, экология, стратегия охраны): Докт. дис. М.: МПГУ, 2003. 60 с.

  14. Bonfield J.K., Smith K.F., Staden R. A New DNA Sequence Assembly Program // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 4992–4999.

  15. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetic analysis version 7.0 for bigger datasets // Mol. Biol. Evol. 2016. V. 33. P. 1870–1874. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054

  16. Nei M. Molecular Evolutionary Genetics. N.Y.: Columbia Univ. Press, 1987. 512 p.

  17. Librado P., Rozas J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data // Bioinformatics. 2009. V. 25. P. 1451–1452. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp187

  18. Drovetski S.V. Molecular phylogeny of grouse: individual and combined performance of W-linked, autosomal, and mitochondrial loci // Syst. Biol. 2002. V. 51. № 6. P. 930–945. https://doi.org/10.1080/10635150290156033

  19. Dimcheff D.E., Drovetski S.V., Mindell D.P. Phylogeny of Tetraonidae and other galliform birds using mitochondrial 12S and ND2 genes // Mol. Phyl. Evol. 2002. V. 24. P. 203–215. https://doi.org/10.1016/S1055-7903(02)00230-0

  20. Lucchini V., Hoglund J., Klaus S. et al. Historical biogeography and a mitochondrial DNA phylogeny of grouse and ptarmigan // Mol. Phyl. Evol. 2001. V. 20. № 1. P. 149–162. https://doi.org/10.1006/mpev.2001.0943

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал