Генетика, 2020, T. 56, № 4, стр. 440-450

Применение ПЦР в реальном времени для выявления kdr-мутации F1534C в гене потенциал-зависимого натриевого канала (vgsc) Aedes aegypti и Aedes albopictus в популяциях Северного и Центрального Вьетнама

Т. Х. Ву 2, Б. В. Андрианов 1*, Д. Ч. Ву 3, И. И. Горячева 1

1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
119991 Москва, Россия

2 Московский государственный областной университет
141014 Москва, Россия

3 Национальный институт маляриологии, паразитологии и энтомологии
ВС10200 Ханой, Вьетнам

* E-mail: andrianovb@mail.ru

Поступила в редакцию 26.04.2019
После доработки 31.05.2019
Принята к публикации 24.06.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Пиретроидные инсектициды – основной инструмент контроля численности комаров-переносчиков арбовирусных лихорадок Aedes aegypti и Ae. albopictus. Широкое использование инсектицидов привело к распространению мутаций устойчивости (или kdr-мутаций) к ним в популяциях комаров. Популяционно-генетическое изучение kdr-мутаций позволяет получить информацию об изменениях генетической структуры популяций комаров в результате антропогенного воздействия и может быть полезно для составления эпидемиологического прогноза распространенности лихорадок Денге и Чикунгунья. Для идентификации kdr-мутаций традиционно используется мультиплексная ПЦР в сочетании с секвенированием ПЦР-фрагментов. Нами разработан более производительный метод для идентификации kdr-мутаций на основе анализа SNP в гене vgsc и ПЦР в реальном времени. Выявлена kdr-мутация F1534C у Ae. aegypti и Ae. albopictus в провинции Хатинг. У Ae. albopictus данная мутация на территории Вьетнама выявлена впервые.

Ключевые слова: лихорадка Денге, Aedes aegypti, Aedes albopictus, устойчивость к инсектицидам, пиретроиды, kdr-мутации, SNP.

Комары рода Aedes являются переносчиками арбовирусных геморрагических лихорадок человека: Денге, Зика, Чикунгунья и Желтой лихорадки. Особенно распространена в Юго-Восточной Азии лихорадка Денге [1]. Вспышки лихорадки Денге на территории Вьетнама впервые описаны в 60-е гг. ХХ столетия [2] и с тех пор борьба с данным заболеванием остается актуальной задачей. Основным методом борьбы с распространением эпидемий с самого начала было выбрано подавление популяций комаров с помощью химических инсектицидов. После запрета применения ДДТ на территории Вьетнама в 1995 г. в основном применялись инсектициды из группы пиретроидов [3, 4]. Пиретроиды являются нейротоксинами для насекомых, у которых они вызывают деполяризацию мембран нейронов, что приводит насекомое к гибели [5]. Устойчивость комаров к пиретроидным инсектицидам объясняется несколькими биохимическими механизмами. Уровень ферментативной активности моноаминоксидазы при участии цитохрома P450, глутатион-S-трансферазы и ацетилхолинэстеразы положительно коррелирует с устойчивостью к пиретроидам [68]. Но основное влияние на уровень устойчивости оказывают мутации в гене потенциал-чувствительного трансмебранного натриевого канала (vgsc). Ген vgsc кодирует трансмембранный белок, образующий ионные каналы в аксонах нейронов. Белок состоит из четырех гомологичных субъединиц (I–IV), каждая из которых содержит шесть гидрофобных доменов (S1–S6) [9]. Комары Ae. aegypti и Ae. albopictus приобретают устойчивость к пиретроидам благодаря единичной мутации или нескольким точковым нуклеотидным заменам, приводящим к аминокислотным заменам в гене vgsc. Такие мутации объединяют общим названием kdr-мутации. Разные kdr-мутации и их комбинации обеспечивают разный уровень резистентности. У Ae. aegypti kdr-мутации выявлены в положениях аминокислотной последовательности 989, 1011 и 1016 (домен S6 II субъединицы), а также в положении 1534 (домен S6 III субъединицы). У Ae. albopictus kdr-мутаций выявлено гораздо меньше. Мутации найдены в положении 1534 (домен S6 III субъединицы). Все найденные на территории Юго-Восточной Азии kdr-мутации перечислены в табл. 1.

Таблица 1.  

Выявленные kdr-мутации в популяциях комаров рода Aedes на территории Юго-Восточной Азии

Страна Вид комара Мутации Источник
Вьетнам Aedes aegypti V1016I, I1011V, F1534C, V1016G [10, 11]
Сингапур Aedes albopictus F1534C [12]
Китай То же F1534C, F1534L, F1534S [1315]
Индонезия Ae. aegypti V1016G, F1534C, S989P, V1016G/S989P [1621]
Камбоджа То же F1534C, V1016G [19, 22]
Малайзия » V1016G, F1534C [23]
Мьянма » V1016G, S989P, F1534C, V1016G/S989P, V1016G/F1534C, V1016G/F1534C/S989P [19, 24]
Сингапур » F1534C, V1016G [2527]
Таиланд » I1011V, F1534C, S989P/V1016G, V1016G, V1016G/F1534C/S989P [17, 19, 22, 26, 2831]

На территории Вьетнама устойчивые к инсектицидам комары впервые найдены в Центральном нагорье [32], а затем в Северном, Центральном и Южном Вьетнаме [33]. С использованием нокдаун-теста на личинках четвертого возраста показано, что устойчивость популяций Ae. aegypti Вьетнама увеличивается по географическому клину с севера на юг [34]. Устойчивость комаров Ae. aegypti Вьетнама объясняется в основном распространением kdr-мутации F1534C и в гораздо меньшей степени мутаций V1016G, V1016I и I1011V [10, 11]. Состояние устойчивости комаров к инсектицидам требует постоянного мониторинга. Схема выявления kdr-мутаций у Ae. aegypti и Ae. albopictus на основе секвенирования нескольких ПЦР-фрагментов, включающих вариабельные области гена vgsc, была предложена в работе [12]. Впоследствии были предложены более быстрые и более дешевые методы скрининга популяций комаров на конкретные kdr-мутации. Аллель-специфичный ПЦР-тест предложен для обнаружения мутации V1016G [35]. Для обнаружения мутации F1534C в перметрин-резистентной популяции Ae. aegypti были разработаны методы на основе зондов TaqMan и аллель-специфичный ПЦР-тест [29]. Для обнаружения мутаций V1016G и F1534C разработан мультиплексный ПЦР-тест [19]. Разработка таких упрощенных методов поиска kdr-мутаций имеет смысл, так как число этих мутаций в популяциях определенного региона очень ограничено. Особенно это верно для Ae. albopictus.

В настоящей работе мы разработали метод выявления SNP в сайте 1534 гена vgsc на основе ПЦР в реальном времени и применили его для характеристики уровня резистентности популяций комаров рода Aedes в пяти провинциях Северного и Центрального Вьетнама. Kdr-мутация F1534C у Ae. albopictus на территории Вьетнама выявлена нами впервые.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сборы комаров

Характеристика сборов личинок комаров рода Aedes приведена в табл. 2. Комаров собирали индивидуально в ходе маршрутных учетов на расстоянии точек сбора не менее 10 м друг от друга для репрезентативного представления их изменчивости в данной местности. Места сборов комаров во Вьетнаме приведены на рис. 1.

Таблица 2.  

Места сборов личинок комаров и объем проанализированных выборок

Название провинции Вьетнама и дата сбора Географические координаты места сбора Экологическая характеристика места сбора Число проанализированных личинок
Хатинг, 2017 18.40 N 105.97 E Временные водоемы антропогенного происхождения с твердыми стенками 33
ТханьХоа, 2017 19.85 N 105.85 E То же 34
Шонла, 2016 21.29 N 103.97 E » 30
Йенбай, 2016 21.88 N 104.68 E » 30
Куаньнинь, 2016 21.07 N 106.60 E » 27
      Ʃ = 154
Рис. 1.

Провинции Вьетнама, где были собраны проанализированные в работе выборки личинок комаров. Й – Йенбай, К – Куаньнинь, Ш – Шонла,Т – ТханьХоа, Х – Хатинг. Географические координаты мест сборов приведены в табл. 2.

Выделение ДНК и ПЦР

Тотальную ДНК из личинок выделяли фенол-хлороформным методом [36]. После очистки ДНК растворяли в деионизованной воде. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрическим методом с использованием Implen NanoPhotometer NP80. Чистоту препарата ДНК тестировали по величине отношения 260/280 нм. Концентрацию ДНК в препаратах выравнивали до 4 нг/мкл. ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл с использованием наборов для амплификации EncycloPlus PCR Kit в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Подбор праймеров проводили в программе Primer 3 [37]. Использованные в работе праймеры приведены в табл. 3.

Таблица 3.  

Характеристика праймеров, использованных в данной работе

Специфичность праймера Длина ПЦР-фрагмента с праймерами, пн Праймер Нуклеотидная последовательность праймера: 5'–3' Температура плавления праймера (Tm) Источник
Фрагмент митохондриального гена cox1 Aedes albopictus. Для подбора праймеров использована последовательность MF148292
cox1 228 Alb-spf CCCCTCTTTAACACTGCTGC 65°C Данная работа
Alb-spr GGTAGTCGATCAAGAGTAATACCAGC 65°C
Фрагмент ядерного гена потенциал-зависимого натриевого канала (vgsc). Для подбора праймеров использована последовательность NW_017857054
vgsc 163 U1534f GACTCGCGGGAGGTAAGTT 65°C Данная работа
C1534r GGTGAAGAACGACCCGC 65°C
Фрагмент ядерного гена потенциал-зависимого натриевого канала (vgsc)
vgsc 748 aegSCF7 GAGAACTCGCCGATGAACTT 60°C [12]
aegSCR7 GACGACGAAATCGAACAGGT 60°C
413 aegSCF7 GAGAACTCGCCGATGAACTT 60°C [12]
  aegSCR8 TAGCTTTCAGCGGCTTCTTC 60°C

Условия ПЦР для амплификации фрагмента митохондриального гена cox1 длиной 228 пн: первичная денатурация 95°С 5 мин, затем 35 циклов: денатурация 30 с 95°С, отжиг 30 с 65°С, синтез 60 с 72°С, терминальный синтез 5 мин 72°С.

Условия ПЦР для амплификации фрагмента гена vgsc длиной 163 пн: первичная денатурация 95°С 5 мин, затем 36 циклов: денатурация 30 с 95°С, отжиг 10 с 65°С, синтез 30 с 72°С, терминальный синтез 5 мин 72°С. Условия ПЦР для амплификации фрагментов гена vgsc длиной 748 и 413 пн, отмеченных в табл. 3, взяты из оригинальной работы [12].

Стратегия идентификации kdr-мутации F1534C в гене vgsc Ae. albopictus и Ae. aegypti приведена на рис. 2. С целью предотвращения паразитной амплификации с последовательностей псевдогенов vgsc, существование которых вероятно, праймер U1534f локализован частично в интроне гена vgsc, что исключает возможность амплификации последовательностей псевдогенов. Амплификация только одного ПЦР-продукта ожидаемого размера была проверена экспериментально на электрофорезе.

Рис. 2.

Схема расположения праймеров для мультиплексной ПЦР. Широкие стрелки обозначают экзоны гена vgsc. Тонкими стрелками показано расположение праймеров. Отсутствие комплементарности на 3'-конце праймера C1534r с kdr-аллелем дикого типа обозначено изгибом стрелки вниз. Последовательность кодона 1534 выделена заглавными буквами. Тонкие линии внизу обозначают длины ПЦР-фрагментов вместе с праймерами.

BOLD-фрагмент митохондриального гена cox1 для определения вида комара получали с помощью стандартных фолмеровских праймеров: LCO1490 и HCO2198 [38]. Полученный фрагмент секвенировали и определяли вид комара, сравнивая полученную последовательность с зарегистрированными в базе данных GenBank последовательностями.

Секвенирование

Фрагменты, полученные в результате амплификации, очищали в 1.5%-ном агарозном геле. Элюцию фрагментов из геля проводили с использованием набора для элюции Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Нуклеотидную последовательность ПЦР-фрагментов определяли с прямого и обратного праймеров на приборе ABI PRISM 3500 с использованием реагентов BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя.

ПЦР в режиме реального времени

Идентификацию kdr-аллелей проводили с помощью ПЦР-амплификатора ANK-32 real-time PCR system (Syntol, Россия). При наличии тотальной ДНК хорошего качества у всех комаров выборки ПЦР на идентификацию kdr-аллелей может быть поставлена с тотальной ДНК, растворенной в воде до одинаковой концентрации. В случае ДНК невысокого качества из заспиртованных или засушенных комаров необходим предварительный этап получения ПЦР-фрагмента с праймеров aegSCF7 и aegSCR7 длиной 748 пн, включающего анализируемую область гена vgsc. Использование этого ПЦР-фрагмента в качестве матрицы для анализа SNP позволяет осуществить выравнивание качества и концентрации ДНК матрицы перед проведением ПЦР на идентификацию kdr-аллелей.

Тотальная ДНК комаров использовалась для получения ПЦР-фрагмента гена vgsc длиной 748 пн, включающего область предполагаемой мутации, как показано на рис. 2. Полученный ПЦР-фрагмент элюировали из агарозного геля и концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре. Затем концентрация всех препаратов была нормализована до величины 4 нг/мкл и аликвота каждого препарата была разбавлена в 2000 раз перед проведением второй реакции ПЦР с праймерами U1534f и C1534r для получения аллель-специфичного фрагмента длиной 163 пн.

ПЦР проводили в объеме 25 мкл с добавлением к стандартной ПЦР-смеси красителя SYBR Green I (Invitrogen). Концентрация каждого из праймеров 0.5 мкM. Первичная денатурация 95°С 5 мин, затем 36 циклов: денатурация 30 с 95°С, отжиг 10 с Tm = 65°С, синтез 30 с 72°С, терминальный синтез 5 мин 72°С. Оптимальная концентрация красителя SYBR Green I в реакционной смеси для разных партий красителя может отличаться и ее следует подбирать до опыта в серии контрольных ПЦР.

Амплификации с препаратов ДНК, содержащих kdr-мутацию F1534C в гомозиготном или гетерозиготном состоянии или только аллели дикого типа, различаются по величине контрольного цикла (Ct). По этой причине для надежной идентификации kdr-аллелей в популяционных выборках необходимо иметь контрольные образцы, достоверно содержащие и не содержащие изучаемую мутацию.

Биоинформационный анализ

Анализ хроматограмм проводили с помощью программы Chromas-Pro 13.3 (Technelysium, Австралия). Выравнивание последовательностей, полученных в результате секвенирования, с последовательностями, размещенными в базах данных, было выполнено с использованием ресурсов NCBI (http://www.nc-bi.nlm.nih.gov).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для тестирования новых ускоренных методов идентификации kdr-мутации F1534C в популяциях Ae. aegypti и Ae. albopictus мы провели изучение одной выборки комаров из провинции Хатинг как классическими методами согласно [12], так и новыми методами и провели сравнение полученных результатов (табл. 4).

Таблица 4.  

Соответствие результатов видовой идентификации комаров и идентификации kdr-мутации F1534C в выборке комаров из провинции Хатинг с помощью традиционного и упрощенного методов

Шифр личинки комара Идентификация вида комара Результат идентификации мутации с помощью ПЦР в реальном времени Результат идентификации мутации с помощью секвенирования
идентификация вида по сиквенсу BOLD-фрагмента митохондриального гена CO1 наличие видоспецифичного для Ae. albopictus ПЦР-фрагмента митохондриального гена CO1 длиной 228 пн замена F1534C генотип комара
1 G1 Ae. albopictus
KU738429, Китай
Да   F//F
2 G2 То же Да   F//F
3 G3 Ae. albopictus
KU738429, Китай
Да Есть F//C
4 G4 Ae. albopictus
KU738429, Китай
Да   F//F
5 G5 Ae. aegypti
HQ688292, Вьетнам 99.4%
  Есть C//C
6 G6 Ae. albopictus
KU738429, Китай
Да   F//F
7 G7 Ae. albopictus
HQ398900, Вьетнам
Да   F//F
8 G8 То же Да   F//F
9 G9 Ae. aegypti
HQ688292, Вьетнам 99.4%
    F//F
10 G10 Ae. albopictus
KU138047, Китай
Да   F//F
11 G11 Ae. aegypti
HQ688292, Вьетнам 99.4%
  Есть F//C
12 G12 Ae. albopictus
HQ398900, Вьетнам
Да   F//F
13 G13 Ae. albopictus
KU738429, Китай
Да   F//F
14 G14 То же Да   F//F
15 G15 » Да   F//F
16 G16 » Да   F//F
17 G17 » Да   F//F
18 G18 » Да   F//F
19 G19 Ae. albopictus
HQ398900, Вьетнам
Да   F//F
20 G20 То же Да   F//F
21 G21 » Да   F//F
22 G22 » Да   F//F
23 G23 » Да   F//F
24 G24 Ae. albopictus
KU738429, Китай
Да   F//F
25 G25 Ae. albopictus
HQ398900, Вьетнам
Да   F//F
26 G26 То же Да   F//F
27 G30 » Да   F//F
28 G32 Ae. albopictus
KU738429, Китай
Да   F//F
29 G33 Ae. albopictus
HQ398900, Вьетнам 99.7%
Да   F//F
30 G35 Ae. albopictus
HQ398900, Вьетнам
Да Есть F//C
31 G40 Ae. albopictus
HQ398900, Вьетнам
Да   F//F
32 G41 То же Да   F//F
33 G44 » Да   F//F

Примечание. Строки, соответствующие комарам, у которых выявлена мутация, выделены полужирным шрифтом. Да – обозначает наличие видоспецифичного для Ae. albopictus ПЦР-фрагмента митохондриального гена CO1 длиной 228 пн. Есть – положительный результат теста ПЦР в режиме реального времени.

Из 33 личинок комаров, собранных в провинции Хатинг, три определены как Ae. aegypti и 30 как Ae. albopictus на основании анализа BOLD-фрагмента митохондриального гена cox1.

Мы предлагаем ускоренный метод определения вида комаров по наличию или отсутствию видоспецифичного для Ae. albopictus ПЦР-фрагмента длиной 228 пн (табл. 3). Специфический фрагмент можно обнаружить электрофорезом или с помощью ПЦР в реальном времени. Ускоренный и стандартный методы показали идентичные результаты. Доля Ae. albopictus в выборке из провинции Хатинг составила 91%, в выборке из Тханьхоа – 100%, в выборке из Шонла – 60%. В этих провинциях сборы проводили в сельскохозяйственных районах, граничащих с лесом. Сборы на территории поселков дали меньший процент Ae. albopictus: в выборке из Куаньнинь – 48% и из Йенбай – 7%. Мутацию kdr F1534C в выборке из провинции Хатинг выявляли стандартным методом секвенирования участка гена vgsc с праймера aegSCR8 по [12]. Мутация выявлена у двух комаров из трех, относящихся к Ae. aegypti, причем в одном из этих случаев мутация была в гомозиготном состоянии. Из 30 комаров, относящихся к Ae. albopictus, мутация была найдена в двух случаях в гетерозиготном состоянии. Это первый случай идентификации kdr-мутации у Ae. albopictus на территории Вьетнама. Мы предлагаем ускоренный метод выявления данной мутации у комаров Ae. aegypti и Ae. albopictus. На рис. 3 показан результат ПЦР в реальном времени по амплификации аллель-специфичного фрагмента 163 пн на той же выборке. Ускоренный и стандартный методы показали идентичные результаты. Ускоренный метод не позволяет различать гомозиготное и гетерозиготное состояние мутации. Интересно, что kdr-мутации обнаружены нами у комаров только в провинции Хатинг, граничащей с Лаосом (рис. 1). Это одновременно и самая южная точка проведенных сборов. В остальных четырех выборках комаров из Северного Вьетнама kdr-мутации не обнаружены.

Рис. 3.

Результат ПЦР в реальном времени с праймерами U1534f и C1534r на выборке комаров из провинции Хатинг. Каждая кривая роста флуоресценции соответствует одному препарату ДНК комара. Указаны шифры комаров, давших положительный сигнал. Перечень всех проанализированных комаров выборки из провинции Хатинг дан в табл. 4.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе предложен и тестирован новый метод определения видов комаров Ae. albopictus и Ae. aegypti на стадии личинки и метод скрининга kdr-мутаций на основе метода ПЦР в реальном времени. Предложенный метод генотипирования kdr-мутаций быстрее и дешевле классической схемы, но в отличие от классической схемы не позволяет различать гомозиготное и гетерозиготное состояние мутации. Мы впервые выявили kdr-мутацию F1534C у Ae. albopictus на территории Вьетнама. Ранее эти мутации были выявлены в Китае (табл. 1). Можно сделать вывод о незначительном распространении kdr-мутаций у комаров Ae. albopictus и Ae. aegypti на территории Вьетнама. Вопрос о происхождении этих мутаций и связанный с ним вопрос о происхождении устойчивых к инсектицидам форм комаров пока не может быть решен. Распространение kdr-мутаций в популяциях комаров рода Aedes связывают с широким применением пиретроидных инсектицидов. Хотя это утверждение бесспорно, происхождение комаров-носителей kdr-мутаций на территории Вьетнама остается неизвестным. kdr-мутации могут появляться в популяции благодаря миграции и благодаря новым мутациям. Дальнейшие популяционно-генетические исследования необходимы для определения относительного вклада этих процессов в формирование резистентности к инсектицидам. Можно утверждать, что комары рода Aedes полиморфны и могут формировать ряд локальных популяций, частично изолированных репродуктивно, благодаря географическим, поведенческим и биохимическим барьерам с различным уровнем устойчивости к инсектицидам. Особый интерес представляет выявление синантропных популяций комаров, наиболее опасных с точки зрения распространения геморрагических лихорадок. Мутантные формы Ae. albopictus Вьетнама и Китая могут иметь общее происхождение, возможно и независимое возникновение kdr-мутаций в разных популяциях Ae. albopictus. Для решения этих вопросов необходимы исследования популяционной структуры вида. Выявленные kdr-мутации имеют низкую частоту, следовательно популяции Ae. albopictus Вьетнама в настоящее время чувствительны к пиретроидным инсектицидам. Выводы о чувствительности или резистентности популяций комаров, сделанные на основе генетических данных, имеют важные преимущества по сравнению с выводами, которые можно сделать на основе физиологических тестов на устойчивость, принятых в настоящее время Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) [39]. Преимущества связаны с тем, что распространение kdr-мутаций может быть связано только с давлением отбора на резистентность к инсектицидам или отбора, приводящего к изменению генетической структуры популяции, тогда как суммарная резистентность комаров к инсектицидам может колебаться от случайных физиологических причин в широких пределах. Генетический мониторинг частот kdr-мутаций – несомненно лучший из тестов, позволяющих оценить результаты мероприятий по контролю численности комаров.

Применение инсектицидов и профилактические мероприятия, направленные на устранение мест развития личинок комаров, являются основными методами контроля численности комаров рода Aedes. Теоретически возможны и другие подходы. Наиболее обещающее направление связано с контролем над микрофлорой комаров. Экспериментальная инфекция комаров внутриклеточной бактерией Wolbachia, которая в настоящее время отсутствует в природных популяциях Ae. aegypti [40], может блокировать способность комаров к передаче вируса, хотя первые опыты в этом направлении пока не привели к существенным результатам [41, 42].

Работа выполнена в рамках государственного задания (№ 0112-2019-0002) по теме “Изучение изменчивости автономных генетических элементов насекомых и разработка маркеров нестабильности генома” (АААА-А16-116111610180-3).

Авторы работы внесли равный вклад в исследование.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Lee J.S., Mogasale V., Lim J. et al. A multi-country study of the economic burden of dengue fever: Vietnam, Thailand, and Colombia // PLoS Negl. Trop. Dis. 2017. V. 11. № 10. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006037

  2. Halstead S.B., Voulgaropoulos E., Tien N.H. et al. Dengue hemorrhagic fever in South Vietnam: report of the 1963 outbreak // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1965. V. 14. P. 819–830. https://doi.org/10.4269/ajtmh.1965.14.819

  3. Nguyen V.-D., Ngueyn M.-H., Pham T.-K. et al. Insecticide susceptibility of Aedes aegypti and Aedes albopictus in Ha Noi and QuangNinh, 2011 // J. Preventive Med. 2012. V. 4. P. 63–70. https://doi.org/10.1186/1756-3305-4-79

  4. Tran T.-D., Nguyen V.-D., Vu D.-C., Do H.-T. Mapping insecticide resistance in dengue vectors in the Northern Viet Nam, 2010–2013 // Vector Biol. J. 2016. V. 1. P. 1. https://doi.org/10.4172/2473-4810.1000105

  5. Narahashi T. Nerve membrane ion channels as the target site of insecticides // Mini Rev. Med. Chem. 2002. V. 2. P. 419–432. https://doi.org/10.2174/1389557023405927

  6. Chareonviriyaphap T., Bangs M.J., Suwonkerd W. et al. Review of insecticide resistance and behavioral avoidance of vectors of human diseases in Thailand // Parasites and Vectors. 2013. V. 6. P. 280. https://doi.org/10.1186/1756-3305-6-280

  7. Hemingway J., Ranson H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease // Annu. Rev. Entomol. 2010. V. 45. P. 371–391. https://doi.org/10.1146/annurev.ento.45.1.371

  8. Ishak I.H., Kamgang B., Ibrahim S.S. et al. Pyrethroid resistance in Malaysian populations of dengue vector Aedes aegypti is mediated by CYP9 family of cytochrome P450 genes // PLoS Negl. Trop. Dis. 2017. V. 11. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005302

  9. Catterall W.A. From ionic currents to molecular mechanisms: The structure and function of voltage-gated sodium channels // Neuron. 2000. V. 26. № 1. P. 13–25. https://doi.org/10.1016/S0896-6273(00)81133-2

  10. Bingham G., Strode C., Tran L. et al. Can piperonyl butoxide enhance the efficacy of pyrethroids against pyrethroid-resistant Aedes aegypti? // Trop. Med. Int. Health. 2011. V. 16. P. 492–500. https://doi.org/10.1111/j.1365-3156.2010.02717.x

  11. Kawada H., Higa Y., Komagata O. et al. Widespread distribution of a newly found point mutation in voltage-gated sodium channel in pyrethroid-resistant Aedes aegypti populations in Vietnam // PLoS Negl. Trop. Dis. 2009. V. 3. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000527

  12. Kasai S., Ng L., Lam-Phua S. et al. First detection of a putative knockdown resistance gene in major mosquito vector, Aedes albopictus // Jap. J. Infect. Dis. 2011. V. 64. № 3. P. 217–221.

  13. Chen H., Li K., Wang X. et al. First identification of kdr allele F1534S in VGSC gene and its association with resistance to pyrethroid insecticides in Aedes albopictus populations from Haikou City, Hainan Island, China // Infect. Dis. Poverty. 2016. V. 5. № 31. P. 8. https://doi.org/10.1186/s40249-016-0125-x

  14. Xu J., Bonizzoni M., Zhong D. et al. Multi-country survey revealed prevalent and novel F1534S mutation in voltage-gated sodium channel (VGSC) gene in Aedes albopictus // PLoS Negl. Trop. Dis. 2016. V. 10. № 5. e0004696. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004696

  15. Li Y., Xu J., Zhong D. et al. Evidence for multiple-insecticide resistance in urban Aedes albopictus populations in southern China // Parasites Vectors. 2018. V. 11. № 1. P. 4. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2581-y

  16. Wuliandari J.R., Lee S.F., White V.L. et al. Association between three mutations, F1565C, V1023G and S996P, in the voltage-sensitive sodium channel gene and knockdown resistance in Aedes aegypti from Yogyakarta, Indonesia // Insects. 2015. V. 6. P. 658–685. https://doi.org/10.3390/insects6030658

  17. Brengues C., Hawkes N.J., Chandre F et al. Pyrethroid and DDT cross-resistance in Aedes aegypti is correlated with novel mutations in the voltage-gated sodium channel gene // Med. Vet. Entomol. 2003. V. 17. P. 87–94. https://doi.org/10.1046/j.1365-2915.2003.00412.x

  18. Hamid P.H., Prastowo J., Ghiffari A. et al. Aedes aegypti resistance development to commonly used insecticides in Jakarta // Indonesia. PLoS One. 2017. V. 12. № 12. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189680

  19. Saingamsook J., Saeung A., Yanola J. et al. A multiplex PCR for detection of knockdown resistance mutations, V1016G and F1534C, in pyrethroid-resistant Aedes aegypti // Parasites and Vectors. 2017. V. 10. P. 465. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2416-x

  20. Sayono S., Hidayati A.P.N., Fahri S. et al. Distribution of voltage-gated sodium channel (Nav) alleles among the Aedes aegypti populations in central Java province and its association with resistance to pyrethroid insecticides // PLoS One. 2016. V. 11. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0150577

  21. Hamid P.H., Prastowo J., Widyasari A. et al. Knockdown resistance (kdr) of the voltage-gated sodium channel gene of Aedes aegypti population in Denpasar, Bali, Indonesia // Parasites and Vectors. 2017. V. 10. P. 283. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2215-4

  22. Yanola J., Somboon P., Walton C. et al. High-throughput assays for detection of the F1534C mutation in the voltage-gated sodium channel gene in permethrin-resistant Aedes aegypti and the distribution of this mutation throughout Thailand // Trop. Med. Int. Health. 2011. V. 16. P. 501–509. https://doi.org/10.1111/j.1365-3156.2011.02725.x

  23. Ishak I.H., Jaal Z., Ranson H. et al. Contrasting patterns of insecticide resistance and knockdown resistance (kdr) in the dengue vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus from Malaysia // Parasites and Vectors. 2015. V. 8. P. 181. https://doi.org/10.1186/s13071-015-0797-2

  24. Kawada H., Oo S.Z.M., Thaung S. et al. Co-occurrence of point mutations in the voltage-gated sodium channel of pyrethroid-resistant Aedes aegypti populations in Myanmar // PLoS Negl. Trop. Dis. 2014. V. 8. № 7. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003032

  25. Kasai S., Komagata O., Itokawa K. et al. Mechanisms of pyrethroid resistance in the dengue mosquito vector, Aedes aegypti: target site insensitivity, penetration, and metabolism // PLoS Negl. Trop. Dis. 2014. V. 8. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002948

  26. Rajatileka S., Black W.C., Saavedra-Rodriguez K. et al. Development and application of a simple colorimetric assay reveals widespread distribution of sodium channel mutations in Thai populations of Aedes aegypti // Acta Trop. 2008. V. 108. P. 54–57. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2008.08.004

  27. Pang S.C., Chiang L.P., Tan C.H. et al. Low efficacy of delthamethrin-treated net against Singapore Aedes aegypti is associated with kdr-type resistance // Trop. Biomed. 2015. V. 32. P. 140–150.

  28. Srisawat R., Komalamisra N., Eshita Y. et al. Point mutations in domain II of the voltage-gated sodium channel gene in deltamethrin-resistant Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) // Appl. Entomol. Zool. 2010. V. 45. № 2. P. 275–282. https://doi.org/10.1303/aez.2010.275

  29. Yanola J., Somboon P., Walton C. et al. A novel F1552/C1552 point mutation in the Aedes aegypti voltage-gated sodium channel gene associated with permethrin resistance // Pestic Biochem. Phys. 2010. V. 96. P. 127. https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2009.10.005

  30. Plernsub S., Saingamsook J., Yanola J. et al. Additive effect of knockdown resistance mutations, S989P, V1016G and F1534C, in a heterozygous genotype conferring pyrethroid resistance in Aedes aegypti in Thailand // Parasites and Vectors. 2016. V. 9. P. 417. https://doi.org/10.1186/s13071-016-1713-0

  31. Srisawat R., Komalamisra N., Apiwathnasorn C. et al. Field-collected permethrin-resistant Aedes aegypti from central Thailand contain point mutations in the domain IIS6 of the sodium channel gene (kdr) // Southeast Asian J. Trop. Med. Pub. Health. 2012. V. 43. P. 1380–1386.

  32. Huong V.D., Ngoc N.T.B. Susceptibility of Aedes aegypti to insecticides in South Vietnam // Dengue Bull. 1999. V. 23. P. 85–88.

  33. Huong V.D., Ngoc N.T.B., Hien D.T. et al. Susceptibility of Aedes aegypti to insecticides in Vietnam // Dengue Bull. 2004. V. 28. P. 179–183.

  34. Kawada H., Higa Y., Nguyen Y.T. et al. Nationwide investigation of the pyrethroid susceptibility of mosquito larvae collected from used tires in Vietnam // PLoS Negl. Trop Dis. 2009. V. 3. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000391

  35. Stenhouse S.A., Plernsub S., Yanola J. et al. Detection of the V1016G mutation in the voltage-gated sodium channel gene of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) by allele-specific PCR assay, and its distribution and effect on deltamethrin resistance in Thailand // Parasites and Vectors. 2013. V. 6. P. 253. https://doi.org/10.1186/1756-3305-6-253

  36. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. N.Y., 1989.

  37. Untergasser A., Cutcutache I., Koressaar T. et al. Primer3 – new capabilities and interfaces // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. № 15. e115. https://doi.org/10.1093/nar/gks596

  38. Folmer O., Black M., Hoeh W. et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1994. V. 3. P. 294–297.

  39. World Health Organization. Monitoring and Managing Insecticide Resistance in Aedes mosquito Populations: Interim Guidance for Entomologists. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 2016.

  40. Jeyaprakash A., Hoy M.A. Long PCR improves Wolbachia DNA amplification: wsp sequences found in 76% of sixty-three arthropod species // Insect. Mol. Biol. 2000. V. 9. P. 393–405. https://doi.org/10.1046/j.1365-2583.2000.00203.x

  41. Hoffmann A.A., Montgomery B.L., Popovici J. et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission // Nature. 2011. V. 476. № 7361. P. 454–457. https://doi.org/10.1038/nature10356

  42. Nguyen T.H., Le Nguyen H., Nguyen T.Y. et al. Field evaluation of the establishment potential of w MelPop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control // Parasites and Vectors. 2015. V. 8. P. 563. https://doi.org/10.1186/s13071-015-1174-x

Дополнительные материалы отсутствуют.