1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 56, № 8, 2020

Генетика, 2020, T. 56, № 8, стр. 893-903

Изменчивость нуклеотидных последовательностей в районе ITS1–5.8S рРНК–ITS2а–2S рРНК–ITS2 кластера генов рРНК у видов семейства Chironomidae

Л. И. Гундерина 1, *, А. В. Катохин 1

1 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
630090 Новосибирск, Россия

* E-mail: gund@bionet.nsc.ru

Поступила в редакцию 31.07.2019
После доработки 13.02.2020
Принята к публикации 07.03.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изучали изменчивость нуклеотидных последовательностей рибосомных генов и внутренних транскрибируемых спейсеров, расположенных в районе ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2, разделяющем гены 18S и 28S рРНК в кластере генов рРНК, с целью оценить возможность использования этих последовательностей в качестве молекулярных маркеров для идентификации видов и реконструкции филогении семейства Chironomidae. Установили, что у видов семейства Chironomidae доля АТ пар нуклеотидов в последовательностях генов 5.8S рРНК и 2S рРНК ниже (50–57%), чем в последовательностях внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2 (64–71%). Размеры нуклеотидных последовательностей генов 5.8S рРНК (123 пн) и 2S рРНК (30 пн) у видов семейства Chironomidae консервативны, а размеры внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2 варьируют как внутри вида, так и между видами. В последовательностях гена 2S рРНК у 27 видов из пяти родов семейства Chironomidae не обнаружено ни внутривидовых, ни межвидовых, ни межродовых различий нуклеотидов. Нуклеотидные последовательности гена 5.8S рРНК идентичны у большинства изученных видов рода Chironomus. Фиксированные межвидовые замены нуклеотидов найдены только в двух сайтах последовательности этого гена у трех видов: C. piger, C. riparius (473С>T) и C. annularius (474A>G). Число инсерций, делеций и замен нуклеотидов в последовательностях внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2a, ITS2 и всего района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 в целом низкое внутри видов, увеличивается в 5–6 раз у видов-двойников и более чем в 10 раз – у морфологически различимых видов, то есть растет в соответствии с ростом таксономического статуса видов семейства Chironomidae. Полученные данные свидетельствуют о том, что нуклеотидные последовательности рибосомных генов и внутренних транскрибируемых спейсеров из района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 кластера генов рРНК, могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров для идентификации видов и реконструкции филогении семейства Chironomidae.

Ключевые слова: Chironomidae, Chironomus, 2S рРНК, 5.8S рРНК, ITS1, ITS2a, ITS2, нуклеотидная изменчивость.

Комары-звонцы (Chironomidae, Diptera) – процветающее семейство насекомых, насчитывающее несколько тысяч видов и населяющее все континенты земного шара [1]. В составе семейства Chironomidae выделено 11 подсемейств [2]. Подсемейство Chironominae включает более 64 родов [3]. Род Chironomus насчитывает около 200 видов [4]. Изучение эволюции рода Chironomus традиционными методами с использованием морфологических признаков личинок, куколок и имаго затруднено и малоэффективно из-за большого морфологического сходства разных видов [5]. Поэтому не ослабевает поиск других подходов к идентификации этих видов и реконструкции филогенетических связей между ними.

Анализ кариотипов показал видоспецифичность рисунка дисков политенных хромосом в клетках слюнных желез личинок и стал наиболее надежным методом идентификации видов рода Chironomus [6, 7]. К настоящему времени описаны кариотипы и охарактеризованы кариофонды большинства видов этого рода [8, 9]. Сравнение последовательностей дисков в хромосомных плечах позволило установить филогенетические связи между видами рода Chironomus [6, 10–13]. Сохраняя топологию, эти филогенетические деревья варьируют в деталях, в зависимости от набора видов, числа и набора хромосомных плеч, а также от метода оценки различий последовательностей дисков в хромосомах. Необходимо отметить, что эти филогенетические деревья нельзя укоренить, поскольку в настоящее время невозможно установить гомологию дисков и их последовательностей в хромосомах видов рода Chironomus и видов из других родов подсемейства Chironominae, которые могли бы составить внешнюю группу при построении деревьев. Поэтому они отражают только филогенетические связи между видами, а не общее направление эволюции видов в роде Chironomus.

В последние годы для идентификации видов рода Chironomus используются нуклеотидные последовательности митохондриальных и ядерных генов. Наиболее часто с этой целью используют митохондриальные гены – ген 1-ой субъединицы цитохрома С оксидазы (COI) и ген цитохрома b (Cytb) [14–16]. Гены ядерного генома: глобина 2b (gb2b) [14–16], а также районы внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 из семейства генов рибосомных РНК [17–19] используются для этой цели намного реже. Между тем, митохондриальные гены не всегда надежно идентифицируют виды [15, 16], поскольку для них характерен материнский тип наследования, и потомство от межвидовых скрещиваний имеет материнский тип митохондриальной ДНК независимо от генотипа ядерной ДНК.

Из генов ядерного генома для идентификации видов и реконструкции филогении многочисленных групп растений и животных наиболее широко используются гены, кодирующие рибосомные РНК. Эукариотический геном содержит несколько сотен тандемно расположенных копий генов рРНК, образующих мультигенное семейство. Каждый тандем включает три рибосомных гена – 18S рРНК, 5.8S рРНК и 28S рРНК, разделенных внутренними транскрибируемыми спейсерами ITS1 и ITS2. В некоторых семействах насекомых в районе ITS2 расположен дополнительный ген 2S рРНК, отделенный от 5.8S рРНК внутренним транскрибируемым спейсером ITS2a (рис. 1). Гены 5.8S рРНК и 2S рРНК консервативны, а районы спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2 полиморфны и используются как филогенетические маркеры [20–26].

Рис. 1.

Схема мономерной единицы кластера генов рРНК видов семейства Chironomidae. 18S, 5.8S, 2S, 28S – гены рибосомной РНК, ITS1, ITS2a, ITS2 – внутренние транскрибируемые спейсеры, ETS – внешний транскрибируемый спейсер, IGS – межгенный спейсер. Скобкой отмечен район ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2, изученный в настоящей работе. Черные стрелки обозначают расположение участков, комплементарных праймерам chir5F и chir5R, серые – chir9F и chir9R.

Наиболее часто, по сравнению с другими районами кластера генов рРНК, в филогенетических исследованиях используется внутренний транскрибируемый спейсер ITS2. Его популярность обусловлена тем, что наряду с высокой вариабельностью и межвидовой дивергенцией, нуклеотидные последовательности ITS2 проявляют значительный консерватизм вторичной структуры, специфичной для эукариот. Консервативные районы являются реперами, существенно повышающими точность выравнивания последовательностей ITS2, и увеличивают тем самым надежность идентификации видов и филогенетических реконструкций [27, 28]. Вместе с тем, как показывают результаты специальных сравнительных исследований, эффективность диагностики видов при использовании нуклеотидных последовательностей ITS1 не ниже, чем при использовании ITS2 [29].

Цель настоящей работы – оценить эффективность использования нуклеотидных последовательностей рибосомных генов 5.8S рРНК и 2S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2, локализованных в районе ITS1–5.8S рРНК–ITS2а–2S рРНК–ITS2, разделяющем гены 18S рРНК и 28S рРНК в кластере генов рРНК, в качестве молекулярных маркеров для диагностики видов и реконструкции филогении семейства Chironomidae. В настоящем сообщении представлены результаты анализа изменчивости нуклеотидных последовательностей генов 5.8S рРНК, 2S рРНК и спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2 у видов семейства Chironomidae.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали личинок IV возраста двадцати двух видов рода Chironomus из подродов Chironomus и Camptochironomus, собранных в водоемах Западной Сибири (Россия) и Северной Америки (табл. 1).

Таблица 1.

Виды из семейств Chironomidae и Simuliidae, использованные в работе, их принадлежность к цитокомплексам и группам видов-двойников, а также номера последовательностей в базе данных GenBank

Вид Цитокомплекс
[8, 9] 		Группа видов-двойников [8, 9] Число последова-тельностей Номер последовательности в базе данных GenBank
Chironomus agilis Schobanov et Djomin, 19881 thummi (thu)
AB CD EF G 		Группа С. plumosus (plu) 2 GU053584 + HQ656579,
GU053585 + HQ656580
Chironomus “annularius” sensu Strenzke, 19591 То же Группа UO species
(uo) 		6 MK45020
AJ296767– AJ296770,
AJ296821
Chironomus balatonicus Devai, Wuelker et Scholl, 19831 » Группа С. plumosus (plu) 2 GU053586 + HQ656581,
GU053587 + HQ656582
Chironomus borokensis Kerkis, Filippova, Shobanov, Gunderina et Kiknadze, 19881 » Группа С. plumosus (plu) 3 MK450121–MK450123
Chironomus cingulatus Meigen, 18301 » Группа UO species
(uo) 		6 MK450124, MK450125
AJ296771–AJ296774
Chironomus dilutus Shobanov, Kiknadze et Butler, 19991 camptochironomus (cam)
AB CF ED G 		Группа С. camptochironomus (cam) 1 MK450126
Chironomus “dorsalis” sensu Strenzke, 19591 pseudothummi (pst)
AE BF CD G 		  2 GU053590 + HQ656594,
GU053591 + HQ656595
Chironomus luridus Strenzke, 19591 То же   3 GU053594 + HQ656596
AJ296778, AJ296779
Chironomus melanescens Keyl, 19611 »   2 MK450127, MK450128
Chironomus melanotus Keyl, 19611 thummi (thu)
AB CD EF G 		Группа UO species
(uo) 		2 AJ296780, AJ296781
Chironomus muratensis Ryser, Scholl et Wuelker, 19831 То же Группа C. plumosus (plu) 2 GU053605 + HQ656584,
MK450129
Chironomus nudiventris Ryser, Scholl et Wuelker, 19831 » Группа С. plumosus (plu) 2 GU053595 + HQ656586,
GU053596 + HQ656587
Chironomus nuditarsis Keyl, 19611 » Группа UO species
(uo) 		4 MK450130, MK450131
AJ296782, AJ296783
Camptochironomus “pallidivittatus” sensu Beermann, 19551 camptochironomus (cam)
AB CF ED G 		Группа С. camptochironomus (cam) 1 AJ296805
Chironomus plumosus (Linnaeus, 1758)1 thummi (thu)
AB CD EF G 		Группа С. plumosus (plu) 10 GU053598 + HQ656589,
GU053597 + HQ656588
AJ296784–AJ296790,
AJ296822
Chironomus piger Strenzke, 19591 thummi (thu) AB CD EF G Группа С. piger
(pig) 		11 GU053599 + HQ656591,
MK450132, MK450133
AJ296806,
AJ296808–AJ296813
Chironomus pseudothummi Strenzke, 19591 pseudothummi (pst)
AE BF CD G 		  4 GU053601 + HQ656597,
GU053602 + HQ656598
AJ296791, AJ296792
Chironomus riparius Meigen, 18041 thummi (thu)
AB CD EF G 		Группа С. piger
(pig) 		10 GU053599 + HQ656591,
MK450132
AJ296806,
AJ296808–AJ296814
Chironomus setivalva Shilova, 19571 camptochironomus (cam)
AB CF ED G 		Группа С. camptochironomus (cam) 2 MK450136, MK450137
Chironomus sororius Wuelker, 19731 thummi (thu)
AB CD EF G 		Группа C. aberratus (abe) 2 MK450138,
MK450139
Chironomus staegeri Lundbeck, 18981 То же Группа C. staegeri (sta) 2 MK450140,
MK450141
Chironomus tentans Fabricius, 18051 camptochironomus (cam)
AB CF ED G 		Группа С. camptochironomus (cam) 1 X99212
Dicrotendipes fumidus Johanssen, 19052     1 AY821866
Glyptotendipes salinus Michailova, 19873     3 AJ296802–AJ296804
Glyptotendipes barbipes Staeger, 18393     5 AJ296793–AJ296797
Acricotopus lucens Zetterstedt, 18504     1 AJ586563
Ablabesmyia rhamphe Sublette, 19645     1 U48384
Simulium trifasciatum Curtis, 18396     1 EU429933
Simulium ornatum Meigen, 18186     1 EU429812
Simulium aureum Fries, 18246     1 FJ437565
Simulium pictipes Hagen, 18806     1 FJ436351

Примечание. GU – последовательности включают районы 18S рРНК, ITS1, 5.8S рРНК кластера генов рРНК, HQ – последовательности включают районы 5.8S рРНК, ITS2a, 2S рРНК, ITS2, 28S рРНК кластера генов рРНК. MK – последовательности включают районы 18S рРНК, ITS1, 5.8S рРНК, ITS2a, 2S рРНК, ITS2, 28S рРНК кластера генов рРНК. 1 – семейство Chironomidae, подсемейство Chironominae, род Chironomus, 2 – семейство Chironomidae, подсемейство Chironominae, род Dicrotendipes, 3 – семейство Chironomidae, подсемейство Chironominae, род Glyptotendipes, 4 – семейство Chironomidae, подсемейство Orthocladiinae, род Acricotopus, 5 – семейство Chironomidae, подсемейство Tanypodinae, род Ablabesmyia, 6 – семейство Simuliidae, род Simulium.

Личинок фиксировали в 96%-ном этаноле для последующего выделения ДНК и хранили при ‒20°С. Идентификацию видов проводили как по морфологии личинок, так и цитогенетически, по рисунку дисков в политенных хромосомах клеток слюнных желез [6, 7]. Принадлежность видов рода Chironomus к цитокомплексам и группам видов-двойников определяли по структуре кариотипов [8, 9].

Геномную ДНК выделяли из индивидуальных личинок с использованием набора QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit по прописи производителя. Для амплификации последовательности ДНК из района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 кластера генов рРНК сконструировали две пары праймеров, используя программу “Primer3” [30]. C помощью первой пары праймеров (5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3' (chir5F) и 5'-CGACACTCAACCATATGTACC-3' (chir5R)) амплифицировали район 18S рРНК–2S рРНК. Вторую пару праймеров (5'-GACATGTTGAACGCATATTG-3' (chir9F) и 5'-TGCTTAAATTCAGGGGGTAG-3' (chir9R)) использовали для амплификации района 5.8S рРНК–28S рРНК (рис. 1). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплификаторе BIS в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 65 мМ Трис-HCl (pH 8.9), 16 мM (NH4)2SO4, 0.05% твин-20, 1.5 мМ MgCl2, по 0.2 мМ dNTP каждого, 25–50 нг ДНК матрицы, по 0.5 мкМ каждого из праймеров и 1 ед. Taq-полимеразы. ПЦР проходила в следующих условиях: денатурация – 1 мин при 94°С, затем 25 циклов: денатурация – 30 с при 94°С, отжиг – 30 с при 57°С, элонгация – 45 с при 72°С. Продукты амплификации были очищены с помощью набора MinElute® Gel Extraction Kit (QIAGEN) по прописи производителя. Очищенные продукты были секвенированы в обоих направлениях с использованием набора Big Dye Terminators v. 3.1 и анализатора ABI PRISM 3100 (Центр коллективного пользования “Геномика” СО РАН, Новосибирск, www.niboch.nsc.ru). Нуклеотидные последовательности редактировали с помощью программы ChromasLite_2.0 (Technelysium Pty. Ltd.). Последовательности видов рода Chironomus, секвенированные нами, помещены в базу данных GenBank под номерами GU053584–GU053605, HQ656579–HQ656601, KP985230–KP985232, MK450120–MK450141 (табл. 1). Наряду с этим использовали нуклеотидные последовательности из изучаемого района у видов рода Chironomus и некоторых других родов семейства Chironomidae (Ablabesmyia, Acricotopus, Dicrotendipes и Glyptotendipes), а также видов из рода Simulium семейства Simuliidae, представленные в базе данных GenBank (табл. 1).

Последовательности выравнивали с использованием программы MUSCLE [31], после чего выравнивание дополнительно редактировали вручную. Молекулярно-генетический анализ последовательностей (определение нуклеотидного состава и изменчивости нуклеотидных последовательностей) осуществляли с помощью пакета программ MEGA 6 [32].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Нуклеотидный состав и размеры нуклеотидных последовательностей

В кластере рибосомных генов в районе, разделяющем гены 18S рРНК и 28S рРНК, расположены гены 5.8S рРНК, 2S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1, ITS2a и ITS2 (рис. 1). У видов из родов Chironomus, Dicrotendipes, Glyptotendipes и Acricotopus последовательности генов 5.8S рРНК и 2S рРНК и спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2 существенно различаются по нуклеотидному составу. Тогда как в последовательностях этих генов количество АТ и GC пар нуклеотидов примерно одинаково (50.0–57.0%), последовательности ITS1, ITS2a и ITS2 обогащены AT-парами нуклеотидов: их доля (63.0–75.0%) в два–три раза превышает долю GC-пар (табл. 2). Вместе с тем у вида A. rhamphe из рода Ablabesmyia (подсемейство Tanypodinae, семейство Chironomidae) в отличие от других видов семейства Chironomidae, доли AT и GC пар нуклеотидов были близки к 0.5 не только в последовательностях генов 5.8S рРНК и 2S рРНК, но и в последовательностях спейсеров ITS1 и ITS2 (табл. 2). Размеры нуклеотидных последовательностей генов 5.8S рРНК (123 пн) и 2S рРНК (30 пн) не проявляют ни внутривидовой, ни межвидовой изменчивости и у всех изученных видов рода Chironomus одинаковы по длине (табл. 2).

Таблица 2.  

Размеры и нуклеотидный состав последовательностей генов 5.8S рРНК, 2S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2 в районе ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 кластера генов рРНК у видов семейства Chironomidae

Подсе-мейство Род Nsp Nseq Район
ITS1 5.8S рРНК ITS2a 2S рРНК ITS2 ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2
L AT L AT L AT L AT L AT L AT
Chironominae Chironomus 22 79 250.8
(208–327) 		68.0 123.0 49.8 41.1
(38–45) 		71.1 30.0 56.7 392.0
(345–437) 		66.1 839.6
(762–899) 		64.5
Dicrotendipes 1 1 199.0 74.7 121.0 49.6 19.0 52.6 30.0 56.7 354.0 64.1 726.0 62.6
Glyptotendipes 2 8 269.3
(259–275) 		68.8 123.1
(123–124) 		49.1 23.0 69.6 30.0 56.7 371.1
(368–376) 		74.0 816.5
(804–824) 		70.0
Orthocladiinae Acricotopus 1 1 252.0 73.8 123.0 50.4 24.0 70.8 30.0 56.7 275.0 73.5 704.0 69.0
Tanypodinae Ablabesmyia 1 1 191.0 57.6 123.0 51.2 39.0 61.5 30.0 56.7 345.0 52.8 728.0 54.7

Примечание. Nsp – число видов, Nseq – число последовательностей, L – средняя длина последовательности (пн), в скобках min–max значения, AT – доля АТ нуклеотидов (в %).

Вместе с тем длина района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 у видов рода Chironomus варьирует в широких пределах, свидетельствуя о существовании как внутривидовой, так и межвидовой изменчивости этого района. Минимальная его длина наблюдается у C. luridus (762 пн), максимальная – у C. staegeri (899 пн). Внутривидовая изменчивость размеров изучаемого района характерна для всех видов хирономид. У разных особей C. luridus его длина варьирует от 759 до 765 пн. У C. piger район ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 существенно длиннее, чем у C. luridus, и его длина варьирует в более широких пределах – от 820 до 842 пн. В среднем длина изученного района у 22 изученных видов рода Chironomus составляет 839.6 пн (табл. 2).

Поскольку длины последовательностей генов 5.8S рРНК и 2S рРНК консервативны, разнообразие размеров района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 у хирономид обусловлено изменчивостью длин спейсеров ITS1, ITS2 и ITS2a. Длина ITS1 у видов рода Chironomus варьирует от 208 пн у C. luridus до 327 пн у C. staegeri, составляя в среднем 250.8 пн. Минимальная длина спейсера ITS2 наблюдается у C. melanescens (345 пн), максимальная (437 пн) – у C. sororius, при среднем значении длины этого района у изученных видов хирономид – 392.0 пн. Самый короткий спейсер – ITS2a (его длина составляет в среднем 41.1 пн) варьирует по длине от 38 пн (C. balatonicus, C. plumosus, C. сingulatus, C. staegeri) до 45 пн (C. piger, C. sororius).

Нуклеотидные последовательности района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 у видов семейства Chironomidae из родов Dicrotendipes, Glyptotendipes (подсемейство Chironominae), Ablabesmyia (подсемейство Tanypodinae) и Acricotopus (подсемейство Orthocladiinae) несколько короче, чем у видов рода Chironomus (табл. 2). Тем не менее, длина выравнивания 90 последовательностей 27 видов из пяти родов семейства Chironomidae составляет 1191 пн и существенно превышает длину последовательностей ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 каждого из изученных видов (табл. 2). Это свидетельствует о значительных внутривидовых, межвидовых и межродовых различиях последовательностей ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 у видов семейства Chironomidae, которые приводят к появлению инсерций и делеций (инделов) и увеличению общей длины этого района при выравнивании последовательностей.

Инсерции и делеции нуклеотидов (инделы)

Внутривидовые инсерции и делеции нуклеотидов (инделы) наблюдались в последовательностях из района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 у четырнадцати из двадцати двух изученных видов рода Chironomus (C. staegeri, C. sororius, C. annularius, C. cingulatus, C. melanotus, C. nuditarsis, C. agilis, C. balatonicus, C. plumosus, C. setivalva, C. riparius, C. luridus, C. pseudothummi, C. melanescens). Число инделов в последовательностях этих видов варьирует от одной до сорока одной пары нуклеотидов, составляя в среднем 10.9 ± 12.4 пн. C увеличением ранга таксономических групп в роде Chironomus число инделов в нуклеотидных последовательностях изучаемого района растет, достигая 62.4 ± 29.3 пн у видов-двойников и 138.3 ± 37.1 пн у морфологически различимых видов рода Chironomus.

Нуклеотидные последовательности генов 5.8S рРНК, 2S рРНК и спейсеров ITS1, ITS2a, ITS2 неодинаковы по длине (табл. 2, 3). Поэтому, чтобы исключить зависимость числа инделов от длины последовательности, рассчитывали число инделов на сайт (табл. 3). В последовательностях генов рРНК внутри вида инделы встречаются редко. Делеция 524delС наблюдалась только в одной из двух изученных последовательностей гена 5.8S рРНК C. balatonicus. И только в одной из десяти последовательностей гена 2S рРНК C. plumosus была обнаружена инсерция 612insC. При этом необходимо отметить, что в таксонах более высокого ранга – у видов-двойников и морфологически различимых видов, инделы в последовательностях этих генов не были найдены (табл. 3).

Таблица 3.

Изменчивость числа индел на сайт в нуклеотидных последовательностях генов 5.8S рРНК, 2S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2 в районе ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 кластера генов рРНК у видов рода Chironomus из разных таксономических групп

Район L, пн Среднее число и стандартное отклонение индел на сайт
внутри видов внутри групп видов-двойников между морфологически различимыми видами
ITS1 407 0.012 ± 0.015 0.069 ± 0.035 0.148 ± 0.040
5.8S рРНК 124 0.0004 ± 0.002 0 0
ITS2a 49 0 0.023 ± 0.022 0.082 ± 0.044
2S рРНК 31 0.002 ± 0.007 0 0
ITS2 580 0.010 ± 0.016 0.058 ± 0.032 0.136 ± 0.052
ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 1191 0.009 ± 0.010 0.052 ± 0.025 0.116 ± 0.031

Примечание. L – длина нуклеотидной последовательности после выравнивания (пн – пары нуклеотидов).

В последовательностях спейсера ITS2a внутривидовые инделы не были найдены ни у одного из изученных видов хирономид. Однако у видов-двойников и морфологически различимых видов инделы в последовательностях этого спейсера встречались в значительном количестве (табл. 3). В последовательностях спейсеров ITS1, ITS2 и всего района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 в целом, число инделов на сайт у видов-двойников увеличилось в пять–шесть раз, а у морфологически различимых видов – более чем в десять раз по сравнению с их частотой внутри вида (табл. 3), т.е. оно растет с ростом таксономического статуса сравниваемых видов.

Замены нуклеотидов

Наряду с инсерциями и делециями, в нуклеотидных последовательностях генов 2S рРНК, 5.8S рРНК и спейсеров ITS1, ITS2а и ITS2 в районе ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 у видов рода Chironomus широко распространены замены нуклеотидов. Число замен нуклеотидов на сайт низкое в последовательностях внутри вида, нарастает у видов-двойников и у морфологически различимых видов рода Chironomus (табл. 4). Внутривидовые различия нуклеотидных последовательностей гена 2S рРНК наблюдались лишь у одного вида рода Chironomus – C. nuditarsis. Замена 593A>G произошла в одной из четырех последовательностей этого вида (AJ 296783). Других различий нуклеотидов, межвидовых или межродовых, в последовательностях этого гена у видов семейства Chironomidae не обнаружено. Это означает, что различить виды рода Chironomus и других родов этого семейства, используя последовательности гена 2S рРНК, невозможно.

Таблица 4.

Изменчивость числа замен нуклеотидов на сайт в последовательностях генов 5.8S рРНК, 2S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2 в районе ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 кластера генов рРНК у видов рода Chironomus из разных таксономических групп

Район L, пн Среднее число замен нуклеотидов на сайт
внутри видов внутри групп видов-двойников между морфологически различимыми видами
ts tv R ts tv R ts tv R
ITS1 407 0.004 ± 0.005 0.007 ± 0.012 0.6 0.021 ± 0.010 0.016 ± 0.004 1.3 0.045 ± 0.016 0.055 ± 0.027 0.8
5.8S рРНК 124 0.002 ± 0.005 0 – 0.001 ± 0.003 0 – 0.006 ± 0.006 0 –
ITS2a 49 0 0 – 0.006 ± 0.010 0.003 ± 0.008 2.0 0.008 ± 0.011 0.008 ± 0.011 1.0
2S рРНК 31 0.002 ± 0.007 0 – 0 0 – 0 0 –
ITS2 580 0.004 ± 0.006 0.005 ± 0.010 0.8 0.030 ± 0.017 0.025 ± 0.013 1.2 0.058 ± 0.023 0.067 ± 0.029 0.9
ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 1191 0.003 ± 0.004 0.005 ± 0.007 0.7 0.023 ± 0.011 0.017 ± 0.008 1.4 0.043 ± 0.010 0.047 ± 0.014 0.9

Примечание. L – длина нуклеотидной последовательности после выравнивания (пн – пары нуклеотидов), ts – среднее число и стандартное отклонение транзиций на сайт, tv – среднее число и стандартное отклонение трансверсий на сайт, R – отношение числа транзиций к числу трансверсий.

Последовательности гена 5.8S рРНК более изменчивы. Замены нуклеотидов в этих последовательностях обнаружены и внутри видов, и у морфологически различимых видов рода Chironomus, и у видов из других родов семейства Chironomidae. Однако число замен нуклеотидов у видов рода Chironomus невелико, и представлены они только транзициями. Фиксированные межвидовые различия найдены в двух сайтах последовательности гена 5.8S рРНК: консервативная замена 473С>T произошла у C. riparius и C. piger из группы видов-двойников C. piger, а консервативная замена 474A>G – у C. annularius (род Chironomus) и видов рода Glyptotendipes. Таким образом, различия нуклеотидов в двух сайтах последовательности гена 5.8S рРНК позволяют дифференцировать три вида рода Chironomus (C. riparius, C. piger и C. annularius).

Последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2a, и ITS2 у видов рода Chironomus намного более полиморфны, чем последовательности генов 2S рРНК и 5.8S рРНК. Число замен нуклеотидов на сайт в последовательностях спейсеров ITS1, ITS2a, ITS2 и всего района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 (в целом) растет с увеличением таксономического статуса видов рода Chironomus. Наименьшее число замен нуклеотидов наблюдается в этих последовательностях внутри вида – ts = 0.003–0.004 (т.е. 3–4 замены нуклеотидов на сайт в последовательности длиной 1000 нуклеотидов). У видов-двойников число замен нуклеотидов в последовательностях спейсеров увеличивается в 6–7 раз (ts = 0.021–0.030), а у морфологически различимых видов – более, чем в 10 раз (ts = 0.043–0.058) по сравнению с числом замен нуклеотидов на сайт внутри вида (табл. 4). Замены нуклеотидов в последовательностях спейсеров у видов рода Chironomus представлены как транзициями, так и трансверсиями. Причем, если в последовательностях спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2 внутри вида и у морфологически различимых видов частоты транзиций ниже чем частоты трансверсий, то у видов-двойников транзиции преобладают (табл. 4).

Суммарная длина последовательностей генов 5.8S рРНК и 2S рРНК составляет 155 пн (13% от общей длины изучаемого района) – значительно меньше суммарной длины внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1, ITS2a, и ITS2 – (1036 пн, 87% от общей длины). Это позволяет полагать, что закономерности нуклеотидной изменчивости всего района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 определяются в основном изменчивостью спейсеров ITS1, ITS2a и ITS2, входящих в его состав, а низкополиморфные и консервативные последовательности генов 5.8S рРНК и 2S рРНК вносят свой вклад, снижая общую изменчивость этого района и увеличивая его консервативную часть (табл. 4). Внутривидовая и межвидовая изменчивости нуклеотидных последовательностей спейсеров ITS1, ITS2a, ITS2 и всего района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 в целом, а также закономерное увеличение изменчивости этих районов с ростом таксономического статуса групп видов рода Chironomus, показывают, что эти последовательности могут рассматриваться в качестве перспективных молекулярных маркеров для идентификации видов и реконструкции филогении семейства Chironomidae.

ОБСУЖДЕНИЕ

У видов семейства Chironomidae рибосомные гены 5.8S рРНК и 2S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1, ITS2a и ITS2, разделяющие их, существенно различаются по нуклеотидному составу: в последовательностях рибосомных генов количество нуклеотидов AT и GC примерно равно, в то время как последовательности спейсеров обогащены AT нуклеотидами. Такое же соотношение нуклеотидов в районах рибосомных генов и спейсеров наблюдается и у многих видов Diptera [17, 21–29].

Значительный вклад в изменчивость последовательностей изучаемого района у видов семейства Chironomidae вносят делеции и инсерции нуклеотидов, которые приводят к вариациям длины этого района. Такой тип изменчивости широко распространен и наблюдается не только у хирономид, но и в других группах живых организмов [23–26].

У 25 видов рода Culicoides длины последовательностей ITS1 варьируют от 279 до 585 пн [24]. В зависимости от длины этого района виды разделяются на две дискретные группы: с короткими и длинными последовательностями ITS1. Различие этих групп обусловлено количеством инделов, образующих в последовательностях ITS1 треки разной длины. У видов подрода Avarita в последовательностях ITS1 содержатся многочисленные инделы, и потому они относятся к группе видов с коротким ITS1. Напротив, виды из подродов Beltranmyia и Trithecoides относятся к группе видов с длинным ITS1, поскольку инделы в последовательностях ITS1 у них малочисленны, и соответственно длины ITS1 больше, чем у других видов. Длины последовательностей ITS2 у видов рода Culicoides (188–267 пн) также варьируют из-за различного содержания инделов. Однако инделы в этих последовательностях не образуют видоспецифических треков как в последовательностях ITS1 [24]. Такие же значительные различия длин ITS1 (95–492 пн) обнаружены и у видов семейства Simuliidae. Однако разнообразие длин последовательностей ITS1 у этих видов обусловлено не только количеством инделов, но и длиной и количеством повторов [25].

Наиболее распространенным типом изменчивости района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 у видов рода Chironomus является замена нуклеотидов. Число замен нуклеотидов на сайт характеризует степень дивергенции нуклеотидных последовательностей. Анализ показал, что изучаемый район у видов семейства Chironomidae неоднороден по степени изменчивости нуклеотидных последовательностей: высокополиморфные спейсеры ITS1, ITS2a и ITS2 чередуются с низкополиморфными и консервативными последовательностями генов 5.8S рРНК и 2S рРНК. В ходе дивергенции видов хирономид замены нуклеотидов приводят к появлению и закреплению видоспецифических последовательностей в высокополиморных районах ITS1 и ITS2. Существование видоспецифических и консервативных последовательностей в районе ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 создает предпосылки для идентификации видов семейства Chironomidae путем конструирования видоспецифических и универсальных ПЦР-праймеров, продуцирующих ампликоны только с ДНК видов-мишеней. Применение такого подхода позволило создать видоспецифические праймеры для идентификации пяти видов рода Chironomus – C. plumosus, C. balatonicus, C. piger, C. dorsalis и C. pseudothummi [33, 34], и продемонстрировало тем самым перспективность этого метода для идентификации видов рода Chironomus.

Полученные результаты показали, что нуклеотидные последовательности гена 2S рРНК видов семейства Chironomidae не проявляют межвидовых и межродовых различий и следовательно не могут использоваться для идентификации видов и родов этого семейства. Вместе с тем количество инделов и замен нуклеотидов в последовательностях внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 и всего района ITS1–5.8S рРНК–ITS2a–2S рРНК–ITS2 в целом закономерно возрастает с увеличением ранга таксонов в семействе Chironomidae. Поэтому высокополиморфные последовательности спейсеров ITS1, ITS2a, ITS2 и всего изученного района в целом могут рассматриваться в качестве перспективных молекулярных маркеров для идентификации видов и реконструкции филогении семейства Chironomidae.

Работа выполнена при финансовой поддержке бюджетного проекта 0324-2019-0042.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Ferrington L.C. Global diversity of non-biting midges (Chironomidae; Insecta-Diptera) in freshwater // Hydrobiologia. 2008. V. 595. № 1. P. 447–455. https://doi.org/10.1007/s10750-007-9130-1

  2. Saether O.A. Phylogeny of the subfamilies of Chironomidae (Diptera) // Syst. Entomol. 2000. V. 25. № 3. P. 393–403. https://doi.org/10.1046/j.1365-3113.2000.00111.x

  3. Wiederholm T. Chironomidae of the Holarctic region. Keys and diagnoses. Part 1. Larvae // Ent. Scand. Suppl. 1983. V. 19. 457 p.

  4. Шобанов Н.А., Шилова А.И., Белянина С.И. Объем и структура рода Chironomus Meig. (Diptera, Chironomidae): обзор мировой фауны // Экология, эволюция и систематика хирономид. Тольятти, Борок: ИБВВ и ИЭВБ РАН, 1996. С. 44–96.

  5. Lindeberg B., Wiederholm T. Notes on the taxonomy of European species of Chironomus (Diptera Chironomidae) // Ent. Scand. Suppl. 1979. V. 10. P. 99–116.

  6. Keyl H.-G. Chromosomenevolution bei Chironomus. II. Chromosomenumbauten und phylogenetische Beziehungen der Arten // Chromosoma. 1962. B. 13. № 4. S. 464–514. https://doi.org/10.1007/BF00327342

  7. Кикнадзе И.И., Шилова А.И., Керкис И.Е. и др. // Кариотипы и морфология личинок трибы Chironomini. Атлас. Новосибирск: Наука, Сиб. отд‑ние, 1991. 115 с.

  8. Kiknadze I., Istomina A., Golygina V., Gunderina L. Karyotypes of Palearctic and Holarctic species of the genus Chironomus [Electronic resource] / Russian Academy of Sciences, Siberian Branch, Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics. Novosibirsk: Academic Publishing House “GEO”, 2016. 489 p.

  9. Martin J. Australian, North American, New Zealand and Oriental Chironomus species. Available from: http://www.chironomidae.net/Martin/JMRes.html (Updated 22 March–11 May 2019).

  10. Wuelker W., Devai Gy., Devai I. Computer assisted studies of chromosome evolution in the genus Chironomus (Dipt.) comparative and integrated analysis of chromosome arms A, E and F // Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 1989. F. 2. P. 373–387.

  11. Гундерина Л.И., Кикнадзе И.И., Истомина А.Г. и др. Дивергенция последовательностей дисков политенных хромосом как отражение эволюционных преобразований линейной структуры генома // Генетика. 2005. Т. 41. № 2. С. 187–195.

  12. Шобанов Н.А. Эволюция рода Chironomus (Diptera, Chironomidae). 2. Филогенетическая модель // Зоол. журн. 2002. Т. 81. С. 711–718.

  13. Kiknadze I.I., Gunderina L.I., Butler M.G. et al. Chromosomes and Continents / Eds Dobretsov N. et al. Biosphere Origin and Evolution, Springer, 2008. P. 349–369.

  14. Guryev V., Makarevitch I., Blinov A., Martin J. Phylogeny of the genus Chironomus (Diptera) inferred from DNA sequences of mitochondrial Cytochrome b and Cytochrome oxidase I // Mol. Phylogenet. Evol. 2001. V. 19. № 1. P. 9–21. https://doi.org/10.1006/mpev.2001.0898

  15. Martin J., Guryev V., Blinov A. Population variability in Chironomus (Camptochironomus) species (Diptera, Nematocera) with a Holarctic distribution: Evidence of mitochondrial gene flow // Insect Mol. Biol. 2002. V. 11. P. 387–397. https://doi.org/10.1046/j.1365-2583.2002.00348.x27

  16. Proulx I., Martin J., Carew M., Hare L. Using various lines of evidence to identify Chironomus species (Diptera: Chironomidae) in eastern Canadian lakes // Zootaxa. 2013. V. 3741. P. 401–458. https://doi.org/10.11646/zootaxa.3741.4.1

  17. Gunderina L.I., Katokhin A.V. Variation and divergence of the rDNA ITS-1 region in species of the genus Chironomus (Diptera: Chironomidae) // Contemporary Chironomid Studies 2011. Proceedings of the XVII International Symposium on Chironomidae. July 6–9. 2009, Nankai University. Nankai University Press, China. P. 22–35.

  18. Asari H., Kasuya S., Kobayashi T. et al. Identification of closely related Hydrobaenus species (Diptera: Chironomidae) using the second internal transcribed spacer (ITS2) region of ribosomal DNA // Aquatic Insects. 2004. V. 26. №3/4. P. 207–213. https://doi.org/10.1080/01650420412331327295

  19. Kaga K., Kasuya S., Kobayashi T., Ohtaka A. Identification of chironomid species by DNA sequence – Especially genus Hydrobaenus including H. sp. “Tsugaru”// Contemporary Chironomid Studies. Proceedings of the XVII International Symposium on Chironomidae. July 6–9. 2009. Nankai University, Nankai University Press, China. 2011. P. 36–40.

  20. Schlötterer Ch., Hauser M.-T., von Haeseler A., Tautz D. Comparative evolutionary analysis of rDNA ITS regions in Drosophila // Mol. Biol. Evol. 1994. V. 11. № 3. P. 513–522.

  21. Tautz D., Hancock J.M., Webb D.A. et al. Complete sequences of the rRNA genes of Drosophila melanogaster // Mol. Biol. Evol. 1988. V. 5. № 4. P. 366–376.

  22. Friedrich M., Tautz D. An episodic change of rDNA nucleotide substitution rate has occurred during the emergence of the insect order Diptera // Mol. Biol. Evol. 1997. V. 14. № 6. P. 644–653.

  23. Stage D.E., Eickbush T.H. Sequence variation within the rRNA gene loci of 12 Drosophila species // Genome Research. 2007. V. 17. № 12. P. 1888–1897. https://doi.org/10.1101/gr.6376807

  24. Matsumoto Y., Yanase T., Tsuda T., Noda H. Characterization of internal transcribed spacer (ITS1)–ITS2 region of ribosomal RNA gene from 25 species of Culicoides biting midges (Diptera: Ceratopogonidae) in Japan // J. Med. Entomol. 2009. V. 46. № 5. P. 1099–1108. https://doi.org/10.1603/033.046.0517

  25. LaRue B., Gaudreau C., Bagre H.O., Charpentier G. Generalized structure and evolution of ITS1 and ITS2 rDNA in black flies (Diptera: Simuliidae) // Mol. Phylogenet. Evol. 2009. V. 53. № 3. P. 749–757. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2009.07.032

  26. Tatonova Y.V., Chelomina G.N., Besprosvannykh V.V. Genetic diversity of nuclear ITS1–5.8S–ITS2 rDNA sequence in Clonorchis sinensis Cobbold, 1875 (Trematoda: Opisthorchidae) from the Russian Far East // Parasitology International. 2012. V. 61. P. 664–674. https://doi.org/10.1016/j.parint.2012.07.005

  27. Coleman A.W. ITS2 is a double-edged tool for eukaryote evolutionary comparisons // Trends in Genet. 2003. V. 19. № 7. P. 370–375. https://doi.org/10/1016/S0168-9525(03)00118-5

  28. Coleman A.W. Pan-eukaryote ITS2 homologies revealed by RNA secondary structure // Nucl. Ac. Res. 2007. V. 35. P. 3322–3329. https://doi.org/10.1093/nar/gkm233

  29. Wang X.C., Liu C., Huang L. et al. ITS1: A DNA barcode better than ITS2 in eukaryotes? // Mol. Ecol. Resources. 2015. V. 15. P. 573–586. https://doi.org/10.1111/1755-0998.12325

  30. Rozen S., Skaletsky H.J. Primer 3 on the WWW for general users and for biologist programmers // Methods in Mol. Biol. 2000. V. 132. P. 365–386.

  31. Edgar R.C. MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput // Nucl. Ac. Res. 2004. V. 32. № 5. P. 1792–1797. https://doi.org/10.1093/nar/gkh340

  32. Tamura K., Stecher G., Peterson D. et al. MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 // Mol. Biol. Evol. 2013. V. 30. № 12. P. 2725–2729. https://doi.org/10.1093/molbev/mst197

  33. Gunderina L.I. Species-specific PCR primers for identification of the sibling species Chironomus plumosus (Linnaeus, 1758) and Chironomus balatonicus (Devai, Wuelker et Scholl, 1983) (Chironomidae, Diptera) // Fauna Norvegica. 2012. V. 32. P. 151–157. https://doi.org/10.5324/fn.v31i0.1381

  34. Гундерина Л.И. Конструирование молекулярных маркеров для идентификации видов рода Chironomus (Diptera, Chironomidae) // Зоол. журн. 2013. Т. 92. № 7. С. 849–858. https://doi.org/10.7868/S0044513413070064

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал