Генетика, 2020, T. 56, № 8, стр. 915-921
Генетическая изменчивость и структурированность кавказской бурозубки Sorex satunini на Северном Кавказе по данным изменчивости микросателлитных локусов
В. В. Стахеев 1, *, М. А. Махоткин 1, С. А. Корниенко 2, А. А. Макариков 2, Н. В. Панасюк 1, В. Н. Орлов 3
1 Федеральный исследовательский центр Южный научный центр
Российской академии наук
344006 Ростов-на-Дону, Россия
2 Институт систематики и экологии животных Сибирского отделения
Российской академии наук
630091 Новосибирск, Россия
3 Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова
Российской академии наук
119071 Москва, Россия
* E-mail: stvaleriy@yandex.ru
Поступила в редакцию 09.08.2019
После доработки 30.09.2019
Принята к публикации 31.10.2019
Аннотация
Проведена оценка изменчивости микросателлитных локусов кавказской бурозубки Sorex satunini на Северном Кавказе. Показано, что этот вид на этой территории представлен двумя дискретными генетическими линиями, связанными с бассейнами рек Кубань и Терек. Генетическое разнообразие первой из упомянутых линий отличается значительно более высоким полиморфизмом по сравнению со второй, что связано, как с современными условиями обитания, так и с историей вида на Западном и Центральном Кавказе.
Кавказская бурозубка Sorex satunini Ogn. – один из краевых видов группы обыкновенных бурозубок S. araneus, распространенный в Западном Предкавказье, Кавказе, Закавказье, Иранском нагорье и в Малой Азии. Внутривидовая изменчивость кавказской бурозубки, в том числе ее генетический полиморфизм и структурированность, изучены слабо. Известную изменчивость гена цитохрома b, наличие двух независимых митохондриальных линий у этого вида [1–3] в настоящее время невозможно использовать для оценки популяционно-генетической дифференциации.
Анализ полиморфизма микросателлитных локусов хорошо показал себя при характеристике метапопуляционной структуры отдельных таксонов, их генетической подразделенности. Наиболее показательно это прослежено на примере анадромных видов рыб [4, 5], но с успехом используется и при изучении млекопитающих [6, 7].
В представленной работе мы попытались на материале изменчивости микросателлитных локусов дать оценку уровня и характер генетического полиморфизма кавказской бурозубки в пределах центральной и западной частей северного макросклона Кавказа и в Западном Предкавказье.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом исследования послужили ткани печени 46 особей кавказской бурозубки, отловленных в девяти локалитетах степного Западного Предкавказья и Северного Кавказа (табл. 1, рис. 1).
Таблица 1.
№ | Географический локалитет | Характеристика биотопа | Количество изученных особей |
---|---|---|---|
1 | Республика Северная Осетия–Алания, окр. г. Владикавказ | Опушка широколиственного леса | 4 |
2 | Республика Северная Осетия–Алания, окр. г. Моздок | Луг в пойменном лесу | 3 |
3 | Республика Северная Осетия–Алания, Цейское ущелье | Берег реки, субальпийский луг | 6 |
4 | Карачаево-Черкесская Республика, ущелье Гоначхир, низовья р. Клухор | Субальпийский луг | 8 |
5 | Карачаево-Черкесская Республика, низовья р. Джамагат | Берег реки | 2 |
6 | Карачаево-Черкесская Республика, окр. пос. Маруха | Пойменный луг | 2 |
7 | Окр. г. Ставрополя, берег р. Егорлык | Прибрежная растительность | 1 |
8 | Краснодарский край, Темрюкский район, окр. пос. Сенной | Лесополоса | 1 |
9 | Краснодарский край, окр. ст. Кущевской, берег р. Куго-Ея | Прибрежная растительность | 19 |
Суммарную геномную ДНК выделяли стандартным методом солевой экстракции с разрушением белков протеиназой К в присутствии SDS [8]. Содержание суммарной ДНК в полученных препаратах оценивали на флуориметре Qubit v. 2.0 (Life Technologies, США), качество выделенных нуклеиновых кислот оценивали с помощью электрофореза на 0.8% агарозе с окраской бромидом этидия. Концентрацию ДНК в растворах доводили до 10 нг/мкл разбавлением 10 мМ буфером Трис-ЭДТА (рН 8.0).
Генотипирование бурозубок проводили по микросателлитным локусам B30, D106, D107, L16, L62 и L67 [9, 10] с использованием праймеров, приведенным в табл. 2. Реакционная смесь для проведения ПЦР-реакции в конечном объеме 20 мкл состояла из следующих компонентов (табл. 3).
Таблица 2.
Локус | Название | Последовательность, 5'–3' | Метка |
---|---|---|---|
B30 | B30F | TCT-CCC-TTA-TCC-CGC-TGT-C | FAM |
B30R | ACG-AAA-GGC-TGC-AAC-TCA-AC | – | |
D106 | D106F | ATT-TCT-CCC-TTC-AAT-CTG-GT | FAM |
D106R | AGG-AGT-ACC-TCT-GGG-TGT-G | – | |
D107 | D107F | AGG-AAG-ACT-GGG-GGT-ATG-TT | FAM |
D107R | TAG-GTC-TGC-TGC-CTG-CAT | – | |
L16 | L16F | TCA-GAG-TCA-GAA-TTT-CTA-ATT-TGG-C | TAMRA |
L16R | TTA-GTG-TAT-TAT-GAC-AGA-TGC-GGG | – | |
L62 | L62F | CAG-TCT-CTC-ACT-GTG-GCA-CTA-TG | R6G |
L62R | GTC-ATT-CTG-GAT-AAG-AAC-CAT-ATG-C | – | |
L67 | L67F | GAA-GTG-ATA-CAT-GAG-TGC-ATG-AG | FAM |
L67R | GTT-GTT-AAC-AAG-AGA-GGT-ATT-ACA-CC | – |
Таблица 3.
Компонент | Объем, мкл | |
---|---|---|
локусы D106, D107 | локусы B30, L16, L62 и L67 | |
10× ПЦР буфер | 2.0 | 2.0 |
MgCl2, 25 мМ | 1.6 | 1.2 |
dNTP, 2.5 мМ | 1.6 | 1.6 |
Смесь прямых праймеров (D106F, D107F, по 5 пкмоль/мкл), меченные флуоресцентными метками (FAM) | 1.0 | 0.0 |
Смесь обратных праймеров (D106R, D107R, по 5 пкмоль/мкл) | 2.0 | 0.0 |
Смесь прямых праймеров (B30F, L16F, L62F и L67F, по 5 пкмоль/мкл), меченные флуоресцентными метками (FAM, R6G и TAMRA) | 0.0 | 2.0 |
Смесь обратных праймеров (B30F, L16F, L62F и L67F, по 5 пкмоль/мкл) | 0.0 | 4.0 |
Taq ДНК-полимераза, 5 Е/мкл | 0.5 | 0.5 |
H2O | 10.7 | 7.7 |
Образец ДНК | 1.0 | 1.0 |
Для проведения реакции энзиматической амплификации использовали термоциклер T100 (Bio-Rad). Скорость нагрева/охлаждения блока термоциклера составляла 1°С/с. Перед началом циклов амплификации смесь однократно прогревали при 95°С в течение 3 мин.
Затем проводили восемь циклов предварительной амплификации, которые состояли из денатурации в течение 30 с при температуре 95°С, отжига праймеров в течение 30 с при от 58.5°С в первом, до 55°С в восьмом цикле, со снижением 0.5°С за цикл и последующим удлинением цепи при 65°С в течение 30 с. Последующие 22 цикла амплификации состояли из денатурации в течение 20 с при температуре 95°С, отжига праймеров при 55°С в течение 25 с и удлинения цепи при 65°С в течение 40 с. По завершении амплификационную смесь инкубировали при 65°С в течение 10 мин.
Электрофорез образцов проводили с помощью ДНК-анализатора ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems) с использованием полимера NanoPOP7 (Nimagen). В качестве размерного стандарта использовали СД-450 (Синтол). Идентификацию аллелей проводили с помощью программы GeneMapper (версия 4.1) с алгоритмом аппроксимации длины неизвестного фрагмента “Local Southern Method”. Для определения истинной длины аллелей для каждого локуса были определены последовательности.
Данные анализировали с использованием пакета генетического анализа GenAlEx v. 6.5 [11]. По каждому локусу подсчитывали число аллелей (Na) и наблюдаемую гетерозиготность (Ho). Для отображения на диаграмме генетических расстояний между особями по исследованным микросателлитным локусам использовали реализованный в пакете GenAlEx анализ главных координат (principal coordinates analysis, PCoA), иначе называемый многомерным шкалированием.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Кавказская бурозубка по большинству изученных нами маркеров демонстрирует довольно высокий уровень генетической изменчивости (табл. 4). Количество аллелей, приходящихся на один локус колеблется от 2 до 11, в среднем – 7. Эти значения заметно превышают таковые у обыкновенной бурозубки в Европейской части России, где подобные характеристики изменялись в пределах 2–5 [12].
Таблица 4.
Локус | N | Na | Ne | I | Ho | He | uHe | F |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
B30 | 46 | 11 | 6.298 | 2.019 | 0.630 | 0.841 | 0.850 | 0.251 |
D106 | 46 | 6 | 2.685 | 1.162 | 0.609 | 0.628 | 0.634 | 0.030 |
D107 | 46 | 7 | 4.575 | 1.709 | 0.826 | 0.781 | 0.790 | –0.057 |
L16 | 46 | 2 | 1.682 | 0.595 | 0.435 | 0.405 | 0.410 | –0.072 |
L62 | 46 | 9 | 4.488 | 1.743 | 0.652 | 0.777 | 0.786 | 0.161 |
L67 | 46 | 7 | 3.151 | 1.372 | 0.500 | 0.683 | 0.690 | 0.268 |
Среднее | 46 | 7.0 | 3.813 | 1.433 | 0.609 | 0.686 | 0.693 | 0.097 |
Довольно высоких значений достигают и показатели ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности. Как и частота аллелей на локус, эта характеристика у S. satunini также заметно превышает таковые у S. araneus [12]. Обращает на себя внимание факт, что по целому ряду локусов уровень наблюдаемой гетерозиготности выше ожидаемой. Это говорит не только о равновесных процессах в популяциях кавказской бурозубки на Северном Кавказе, но и о процессах, направленных на отбор гетерозигот.
Анализ расстояний в пространстве первых двух измерений главных координат демонстрирует, что изученные нами особи группируются в две отчетливо отделенные группы популяций (рис. 2). Первая включает бурозубок из степной зоны Западного Предкавказья и окрестностей Ставрополя, бассейна Кубани в Краснодарском крае и Карачаево-Черкесии (кубанский вариант лесостепного пояса) (рис. 1, 4–9). Вторая – более компактная, объединяет бурозубок из бассейна Терека в полупустынной зоне (Моздокский р-н), терском варианте поясности широколиственных лесов (Владикавказ) и субальпики (Цейское ущелье) в Северной Осетии (рис. 1, 1–3) (зоогеографические зоны даны по А.К. Темботову, В.Е. Соколову [13]). Условно мы назвали эти группы популяций “западнокавказской” и “центральнокавказской”.
Анализ генетической изменчивости полученных внутривидовых группировок показывает результаты, представленные в табл. 5. Западнокавказская группа проявляет более высокие показатели генетического разнообразия по сравнению с центральнокавказской. Так количество аллелей у кавказской бурозубки на Западном Кавказе и в Предкавказье в среднем находится на уровне 6.5, а на Центральном Кавказе – 3.8. Информационный индекс Шеннона в первой из анализируемых группировок практически в полтора раза выше, чем во второй. Такая картина отражает историю таксона на Кавказе. При развитии оледенений в Предкавказье, на черноморском побережье сохранялось большее количество рефугиумов, чем на Центральном Кавказе, что и обеспечило более высокое генетическое разнообразие в этом районе [14].
Таблица 5.
Локус | N | Na | Ne | I | Ho | He | uHe | F |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Западнокавказская | ||||||||
B30 | 33 | 8 | 4.427 | 1.689 | 0.667 | 0.774 | 0.786 | 0.139 |
D106 | 33 | 6 | 2.420 | 1.105 | 0.727 | 0.587 | 0.596 | –0.239 |
D107 | 33 | 7 | 4.481 | 1.701 | 0.788 | 0.777 | 0.789 | –0.014 |
L16 | 33 | 2 | 1.424 | 0.474 | 0.364 | 0.298 | 0.302 | –0.222 |
L62 | 33 | 9 | 3.063 | 1.519 | 0.606 | 0.674 | 0.684 | 0.100 |
L67 | 33 | 7 | 3.698 | 1.506 | 0.697 | 0.730 | 0.741 | 0.045 |
Среднее | 33 | 6.5 | 3.252 | 1.332 | 0.641 | 0.640 | 0.650 | –0.032 |
Центральнокавказская | ||||||||
B30 | 13 | 7 | 3.674 | 1.591 | 0.538 | 0.728 | 0.757 | 0.260 |
D106 | 13 | 2 | 1.550 | 0.540 | 0.308 | 0.355 | 0.369 | 0.133 |
D107 | 13 | 5 | 4.173 | 1.501 | 0.923 | 0.760 | 0.791 | –0.214 |
L16 | 13 | 2 | 1.988 | 0.690 | 0.615 | 0.497 | 0.517 | –0.238 |
L62 | 13 | 6 | 4.829 | 1.654 | 0.769 | 0.793 | 0.825 | 0.030 |
L67 | 13 | 1 | 1.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | |
Среднее | 13 | 3.8 | 2.9 | 0.996 | 0.526 | 0.522 | 0.543 | –0.006 |
Примечание как к табл. 4.
Обращает на себя внимание довольно близкие уровни наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности в обеих изученных группировках S. satunini, что по-видимому говорит о протекании в них равновесных генетических процессов, отсутствии факторов, способствующих развитию изоляции отдельных популяций внутри них. Нельзя обойти вниманием изменчивость локуса L67. Этот фрагмент в западной части ареала кавказской бурозубки обладает высоким уровнем изменчивости, а на Центральном Кавказе был зафиксирован лишь один из его вариантов.
Кавказская бурозубка широко распространена как в бассейне р. Кубань (от степей Западного Предкавказья до субальпийского пояса), так и в бассейнах рек Терек и Аргунь (терский вариант поясности). В связи с этим в настоящее время невозможно с уверенностью очертить границы двух выделенных нами групп популяций, но вероятнее всего, что популяционно-генетическая структура этого вида на Северном Кавказе сформировалась под влиянием изоляции популяций бассейнов рек Кубани и Терека.
Пограничные районы между бассейнами этих главных рек Северного Кавказа выделяют в эльбрусский вариант восточно-северокавказского типа поясности. В этой области по площади доминирует субальпийский пояс, для которого характерно нарастание сухости, остепнения горных лугов и сокращение числа видов и плотности населения мезофильных видов, в том числе и кавказской бурозубки [13].
На северных склонах Большого Кавказского Хребта в направлении с запада на восток резко (в пять раз) возрастает сухость климата, поэтому терский вариант поясности оказывается в целом более сухим по сравнению с кубанским. В условиях более сухого климата популяции мезофильных видов сокращаются и образуют ленточные поселения в прибрежных биотопах. Поэтому, на первый взгляд снижение изменчивости микросателлитных локусов может быть следствием изоляции современных малых популяций.
Но следует обратить внимание, что в популяциях центральнокавказской группы, по сравнению с западнокавказской, крайне резко снижена изменчивость двух микросателлитных локусов – D106 и L67, тогда как изменчивость других локусов понижена незначительно. Объяснить резкое снижение изменчивости только этих двух локусов можно длительной изоляцией мезофильных популяций бассейнов Терека и Кубани. Возможно, что пониженная изменчивость этих двух локусов первична. И мутации, возникавшие в разных регионах Кавказа, не могли проникнуть в бассейн Терека. Если в плейстоцене сохранялся современный тип климата на Кавказе, резкое нарастание сухости с запада на восток, то в центральных и восточных частях Кавказа уменьшались и рефугиумы мезофильных видов в холодные периоды плейстоцена.
Ранее было показано, что популяция кавказской бурозубки в пойме р. Бейсуг (степная часть Западного Предкавказья) характеризуется крайне низким генетическим полиморфизмом: Na = 2.0, Ho = 0.171 и He = 0.188 [15]. В Западном Предкавказье распространение кавказской бурозубки ограничено прибрежной растительностью малых рек, впадающих в Азовское море и лесополосами среди полей. В таких фрагментированных поселениях может резко понижаться генетическая изменчивость [16, 17]. По всей видимости, популяция из поймы р. Бейсуг представляет собой изолят из группы западнокавказских популяций, прошедший через “бутылочное горлышко”. В этой популяции снижается изменчивость всех микросателлитных локусов, в отличие от популяций центральнокавказской группы.
Исследованная нами выборка кавказской бурозубки из степей Западного Предкавказья, долины р. Куго-Ея (рис. 1, 9) характеризуется высокими показателями генетической изменчивости, соизмеримыми с таковыми с территории всего Западного Кавказа. Географическая изменчивость размеров и окраски кавказской бурозубки изучена слабо. На Северном Кавказе и в Предкавказье описаны два подвида, S. s. stavropolica [13] – вариант окраски из изолированной популяции в окрестностях Ставрополя и S. s. tembotovi [2] – мелкая форма из Западного Предкавказья. Судя по результатам данного исследования, оба таксона относятся к западнокавказской группе популяций с высокой изменчивостью микросателлитных локусов.
Таким образом, на Северном Кавказе и в Предкавказье кавказская бурозубка представлена двумя дискретными генетическими линиями, связанными с бассейнами рек Кубань и Терек. Генетическое разнообразие первой из упомянутых линий отличается значительно более высоким полиморфизмом по сравнению со второй, что вероятно связано как с современными условиями обитания так и с историей вида на Западном и Центральном Кавказе.
Полевые работы выполнены при поддержке РФФИ (грант № 17-04-00227), лабораторные исследования и анализ данных с привлечением базового финансирования ЮНЦ РАН (№ гр. проекта AAAA-A19-119011190176-7) и Программы Президиума РАН “Биоразнообразие природных систем и биологические ресурсы России”, раздел “Генофонды живой природы и их сохранение” (№ 0256-2018-0032).
Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Список литературы
Банникова А.А., Лебедев В.С. Молекулярно-генетическая неоднородность кавказской землеройки-бурозубки Sorex satunini (Mammalia, Lipotyphla, Soricidae) по маркерам мтДНК как вероятное последствие древней гибридизации // Мол. биол. 2010. Т. 44. № 4. С. 658–662.
Орлов В.Н., Балакирев А.Е., Борисов Ю.М. Новый подвид кавказской бурозубки Sorex satunini (Mammalia) и филогенетические связи вида по мтДНК последовательностям и хромосомным маркерам // Поволжский экол. журн. 2010. № 1. С. 111–114.
Орлов В.Н., Балакирев А.Е., Борисов Ю.М. Филогенетические связи кавказской бурозубки Sorex satunini Ogn. (Mammalia) в надвиде Sorex araneus по данным кариологического анализа и секвенирования гена cyt b мтДНК // Генетика. 2011. Т. 47. № 6. С. 805–813.
Павлов С.Д., Семенова А.В., Рубцова Г.А., Афанасьев К.И. Анализ изменчивости микросателлитных локусов у камчатской микижи (Parasalmo (Oncorhynchus) mykiss) // Генетика. 2011. Т. 47. № 10. С. 1346–1356.
Салменкова Е.А., Омельченко В.Т., Рубцова Г.А. и др. Популяционно-генетическая дифференциация кунджи Salvelinus leucomaenis (Pallas) российского Дальнего Востока // Генетика. 2014. Т. 50. № 1. С. 52–61.
Melosik I., Ziomek J., Winnicka K. et al. The genetic characterization of an isolated remnant population of an endangered rodent (Cricetus cricetus L.) using comparative data: implications for conservation // Conservation Genet. 2017. V. 18. Iss. 4. P. 759–775. https://doi.org/10.1007/s10592-017-0925-y
Czarnomska S.D., Niedziałkowska M., Borowik T., Jędrzejewska B. Regional and local patterns of genetic variation and structure in yellow-necked mice – the roles of geographic distance, population abundance, and winter severity // Ecol. and Evol. 2018. V. 8. Iss. 16. P. 8171–8186. https://doi.org/10.1002/ece3.4291
Aljanabi S.M., Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques // Nucl. Ac. Res. 1997. V. 25. P. 4692–4693.
Wyttenbach A., Narain Y., Fredga K. Genetic structuring and gene flow in a hybrid zone between two chromosome races of the common shrew (Sorex araneus, Insectivora) revealed by microsatellites // Heredity. 1999. V. 82. P. 79–88.
Basset P., Yannic G., Yang F. et al. Chromosome localization of microsatellite markers in the shrews of the Sorex araneus group // Chromosome Res. 2006. V. 14. P. 253–262. https://doi.org/10.1007/s10577-006-1041-x
Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6.5: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research – an update // Bioinformatics. 2012. V. 28. Iss. 19. P. 2537–2539. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts460
Григорьева О.О., Шестак А.Г., Сычёва В.Б. и др. Изолирующий эффект узких гибридных зон хромосомных рас обыкновенной бурозубки Sorex araneus (Mammalia) // Докл. акад. наук. 2011. Т. 436. № 6. С. 830–833.
Соколов В.Е., Темботов А.К. Позвоночные Кавказа. Млекопитающие: насекомоядные. М.: Наука, 1989. 548 с.
Туниев Б.С., Орлов Н.Л., Ананьева Н.Б., Агасян А.А. Змеи Кавказа: таксономическое разнообразие, распространение, охрана. СПб–М.: Т-во научных изданий КМК, 2009. 223 с.
Григорьева О.О., Сычева В.Б. Генетическая и морфологическая изменчивость частично изолированной популяции кавказской бурозубки, Sorex satunini (Маmmаlia) // Генетика. 2011. Т. 47. № 9. С. 1271–1274.
Dixo M., Metzger J.P., Morgante J.S., Zamudio K.R. Habitat fragmentation reduces genetic diversity and connectivity among toad populations in the Brazilian Atlantic Coastal Forest // Biol. Conservation. 2009. V. 142. Iss. 8. P. 1560–1569. https://doi.org/10.1016/j.biocon.2008.11.016
Wan H.Y., Cushman S.A., Ganey J.L. Habitat fragmentation reduces genetic diversity and connectivity of the mexican spotted owl: A simulation study using empirical resistance models // Genes. 2018. V. 9. Iss. 8: 403. https://doi.org/10.3390/genes9080403
Дополнительные материалы отсутствуют.