Генетика, 2020, T. 56, № 9, стр. 1054-1064

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Биологические образцы. В исследование были включены следующие группы: 150 образцов биологического материала дикого кабана и 200 образцов ДНК домашней свиньи (30 – для породы белорусская крупная белая, 30 – белорусская мясная, 20 – белорусская черно-пестрая, 30 – дюрок, 30 – ландрас, 30 – йоркшир, 30 – пьетрен). Образцы диких животных были отобраны в осенне-зимний охотничий сезон 2010–2011 гг., представляли собой фрагменты мяса или ушной раковины и поступали засыпанными поваренной солью в отдельных пакетах, снабженных бирками с описанием убитого животного. Образцы ДНК домашних свиней были предоставлены Научно-практическим центром по животноводству НАН Беларуси (г. Жодино, Беларусь).

Выделение ДНК. ДНК из образцов мышечной и хрящевой ткани выделяли с использованием методики, основанной на высвобождении ДНК в ходе инкубирования образцов биологического материала в лизирующем буфере, содержащем 2% додецилсульфата натрия (SDS), 20 мM Tris-HCl, 100 мM NaCl, 20 мM EDTA (pH 8.0) и протеиназу К. При наличии фрагментов, которые подверглись лизису не полностью, осадок отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 3000 об./мин, а супернатант переносили в новую пробирку. К супернатанту добавили 6.3 М раствор гуанидинхлорида в объеме 1/2 от объема исходной смеси, далее помещали пробирки в холодильник при 0–5°С на 10–15 мин, осадок комплекса продуктов расщепления белков с SDS удаляли центрифугированием в течение 8 мин (5000 об./мин). Далее использовали коммерческую смесь Roti®-Phenol (Германия) согласно рекомендациям производителя.

Концентрацию ДНК измеряли с использованием спектрофотометра NanoDrop-1000 (Peqlab, Германия). Среднее значение концентрации ДНК составило 89.4 ± 15.3 нг/мкл (260/280 – 1.89 ± 0.14, 260/230 – 1.82 ± 0.16).

ПЦР-ПДРФ анализ. ПЦР для генотипирования по SNP H3GA0051814 (ген HEPH) проводили в объеме 15 мкл. Количество вносимой ДНК на реакцию составляло 1.0–100.0 нг. В состав реакционной смеси входили: SynTaq-полимераза (ООО “Синтол”, РФ); 10× ПЦР-буфер (100 мМ Трис-HCl, 500 мМ KCl, 0.8% Nonidet P40, pH 8.8), 50 мМ раствора MgCl₂ (финальная концентрация ионов Mg²⁺– 3.0 мМ); 2.0 мМ раствора смеси дНТФ; смесь прямого и обратного праймеров в концентрации 5.0 мкМ (F 5'-GGTAGATGTGGGTGGGATGGA-3'; R 5'-AACTATTGGATCTGCATCCGCT-3'). В результате ПЦР синтезировался ампликон длиной 360 пн. Полиморфизм H3GA0051814 (ген HEPH) исследовали с применением эндонуклеазы рестрикции NdeI (NEB, США). Протоколы генотипирования и результаты молекулярно-генетического анализа SNP c.367G>A (ген MC1R) и g.299084751C>T (ген NR6A1) с использованием ПЦР-ПДРФ представлены в работе В.Н. Кипень с соавт. [11].

KASP-генотипирование. Для подтверждения результатов генотипирования полиморфизма H3GA0051814 (ген HEPH), проведенных с использованием ПЦР-ПДРФ, была использована технология, основанная на конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP, kompetitive allele specific PCR). Генотипирование проводилось для 45 образцов с использованием KASP Assay mix (KASP by Design, KBD) и KASP Master mix (ООО “Максим Медикал”, РФ, LGC Biosearch Technologies, Великобритания) в трехкратной повторности согласно рекомендациям производителя. Концентрация ДНК для всех образцов была стандартизирована до 30 нг/мкл. Для определения нижнего предела детектируемого количества генетического материала в реакции ПЦР была использована серия разведений ДНК для девяти образцов с известным генотипом. Диапазон тестируемого количества ДНК в реакции ПЦР составил 1.0–50.0 нг/реакцию – концентрации 1.0, 2.0, 5.0, 10, 20, 50 нг/мкл.

HRM-анализ. Генотипирование SNP H3GA0051814 (ген HEPH), c.367G>A (ген MC1R) и g.299084751C>T (ген NR6A1) проводилось с использованием Precision Melt Supermix for High Resolution Melt (HRM) Analysis (Bio-Rad, США) в трехкратной повторности согласно рекомендации производителя. Результаты аллельной кластеризации были проанализированы с использованием Precision Melt Analysis™ Software v. 1.3 (Bio-Rad, США). Концентрация ДНК для всех образцов была стандартизирована до 30 нг/мкл. Протокол амплификации соответствовал рекомендуемым Bio-Rad. Для HRM-анализа были использованы оригинальные праймеры: для SNP H3GA0051814 (ген HEPH) – F 5'-TTCTGTTGTACAGCAAAGTGACCC-3' и R 5'-TATATTTGGAAGAGATAGGCAATGGG-3', для SNP c.367G>A (ген MC1R) – F 5'-GACACCATGGAGCCGCAGATG-3' и R 5'-CGTGGTGCAGCAGCTGGAC-3', для SNP g.299084751C>T (ген NR6A1) – F 5'-GGAACAGGGCTTCAGAGAGC-3' и R 5'-GCTCACCTGGAGGACAGTGTGG-3' (ЗАО “Евроген” и ООО “Биотех-Индустрия”, РФ).

Определение генотипа in silico. Генотипы in silico для животных, геномы которых были представлены в открытом доступе в NCBI (National Center for Biotechnology Information), определяли с использованием on-line алгоритма SRA-Blast (файлы в формате *.sam) и программы Unipro UGENE v. 1.31.1 [12]. Определение генотипа для трех SNP в генах HEPH, MC1R и NR6A1 с использованием алгоритма BLAST было проведено для 70 особей домашней свиньи, “сырые” данные полных геномов которых расположены в Sequence Read Archive (SRA, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra). В табл. 1 суммирована информация для образцов с указанием “Sample ID” и генотипами. Используемые настройки поиска генотипа in silico отражены в работе Е.В. Ивановой [13].

Статистический анализ данных. Оценку дифференцирующего потенциала для SNP или их совокупности проводили с использованием программы MDR v. 3.0.2 (http://www.multifactordimensionalityreduction.org/). В процессе моделирования нами были использованы высоко консервативные настройки поиска конфигурации модели, которые позволили однозначно дифференцировать наличие/отсутствие статистически значимых эффектов, а именно: количество атрибутов (attribute count range) – от 1 до n (где n – количество переменных в модели); воспроизводимость модели (cross-validation count) – 100; анализ топ-моделей (track top models) – 1000; поиск конфигурации модели (search method configuration) – всесторонний (exhaustive); метод сравнения (ambiguous cell analysis) – точный тест Фишера (Fisher’s exact test); классификация ячеек (ambiguous cell assignment) – неклассифицированные (unclassified).

Вклад конкретного генотипа определялся величиной энтропии Н (выраженной в %). При H = 100% генотип способен однозначно дифференцировать, к какой группе (дикий кабан или домашняя свинья) относится неизвестный образец. В программе MDR в результате множественных перестановок (пермутаций) первичных данных определяется наиболее оптимальная модель дифференциации. Корректность модели оценивали по значению сбалансированной точность (Balanced Accuracy), которая зависит от чувствительности и специфичности модели [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате генотипирования 150 образцов из выборки дикого кабана по полиморфизму H3GA0051814 гена HEPH были получены следующие результаты: генотип TT выявлен в 84.0% (126/150) случаев, генотип СТ – в 12.7% (19/150) случаев и генотип СС – в 3.3% (5/150) случаев. Таким образом, для включенных в исследование образцов дикого кабана показано наличие трех генотипов для полиморфизма H3GA0051814, при этом аллель Т распространен в данной выборке с частотой 90.3 ± 2.4%, т.е. является мажорным. Результаты электрофоретического разделения рестриктов представлены на рис. 1. Для всех животных пород домашних свиней в рамках данного исследования (n = 200) определен генотип СС, аллель С распространен в данной выборке с частотой 100%.

Рис. 1.

Результаты электрофоретического разделения рестриктов для полиморфизма H3GA0051814 гена HEPH в 8.0%-ном ПААГ. М – маркер молекулярного веса (Jena Bioscience M-214S).

Для подтверждения результатов генотипирования полиморфизма H3GA0051814, проведенных с использованием ПЦР-ПДРФ, а также для возможности предоставить потенциальному кругу исследователей более разнообразный спектр методов, была использована технология KASP. Генотип был корректно определен после основного и дополнительного раундов амплификации для 45 образцов (15 образцов домашних свиней и 30 – диких кабанов), рис. 2.

Рис. 2.

2D-plot результатов аллельной дискриминации при генотипировании полиморфизма H3GA0051814 гена HEPH с использованием KASP-технологии (Bio-Rad CFX Manager, Bio-Rad, США). NA – отрицательный контроль.

Для определения нижнего предела детектируемого количества генетического материала в реакции ПЦР была использована серия разведений ДНК для девяти образцов с известным генотипом. Диапазон тестируемого количества ДНК в реакции ПЦР составил 1.0–50.0 нг/реакцию: концентрации 1.0, 2.0, 5.0, 10, 20, 50 нг/мкл. Результат генотипирования в виде графика аллельной дискриминации после основного раунда амплификации представлен на рис. 3,а. Для тех случаев, когда после основного раунда амплификации не представилось возможным определить генотип, производитель реагентов для KASP рекомендует провести раунд дополнительной амплификации. Результат генотипирования в виде графика аллельной дискриминации после дополнительного раунда амплификации представлен на рис. 3,б. Минимальное достаточное количество ДНК для корректного определения генотипа составило не менее 1.0 нг/реакцию при 42 циклах амплификации. Чувствительность и специфичность при генотипировании полиморфизма H3GA0051814 с использованием технологии KASP составила 100%.

Рис. 3.

2D-plot результатов аллельной дискриминации при генотипировании полиморфизма H3GA0051814 гена HEPH с использованием KASP-технологии на основании серии разведения ДНК (Bio-Rad CFX Manager, Bio-Rad, США). Квадраты, треугольники, кружки, крестики – различные генотипы.

Оценку дифференцирующего потенциала для полиморфизма H3GA0051814 (ген HEPH) проводили с использованием программы MDR v. 3.0.2. Точность дифференциации дикого кабана от домашней свиньи при анализе полиморфизма H3GA0051814 гена HEPH составляет 98.33%. Ни в одном случае образец домашней свиньи не был принят за дикого кабана – специфичность модели оказалась равной 100%. Таким образом, при наличии генотипов СТ или ТТ происхождение неизвестного образца с точностью не менее 99.99% (уровень статистической значимость p < 0.01) должно быть отнесено к дикому кабану (Sus scrofa scrofa). При наличии генотипа СС происхождение неизвестного образца с точностью не менее 99.99% (уровень статистической значимость p < 0.01) должно быть отнесено к домашней свинье (Sus scrofa domesticus).

Как акцентировалось ранее, на данный момент задача по дифференциации дикого кабана и домашней свиньи решается с использованием анализа двух SNP – c.367G>A (ген MC1R) и g.299084751C>T (ген NR6A1) [10].

Однако в Республике Беларусь на частных подворьях все интенсивнее происходит разведение домашних свиней азиатского происхождения, например вьетнамской вислобрюхой свиньи или мейшан и др. По гену окраски кожи и волосяного покрова для них характерен генотип по SNP c.367G>A (ген MC1R), идентичный для дикого кабана, так как имеет место темный окрас. Также по причине большего породного разнообразия среди домашних свиней в странах Азиатского региона остается неопределенной частота распространенности аллеля С для полиморфизма g.299084751C>T (ген NR6A1), характерного для дикого кабана. В данном контексте, т.е. только при анализе полиморфных вариантов c.367G>A (ген MC1R) и g.299084751C>T (ген NR6A1), как нам представляется, имеется довольно высокая вероятность ложноположительных результатов дифференциации, т.е. мясо домашней свиньи может быть ошибочно идентифицировано как мясо дикого кабана. Негативные последствия подобной ложной дифференциации трудно переоценить, тем более в контексте криминалистики.

В NCBI имеются геномы в формате SRA для домашних свиней азиатского происхождения следующих пород: Аба (A’ba Tibetan pig), Бамей (Bamei), Дянь Сяо Эр (Diannanxiaoer), Азиатская домашняя (Domestic pig, Asia), Тибетская Ганзи (Ganzi Tibetan pig), Чеджу (Jeju native), Чжан Вэй (Jiangquhai), Цзиньхуа (Jinhua), Корейская (Korean native), Мейшан (Meishan). С использованием биоинформационной обработки данных определен генотип для трех SNP – H3GA0051814 (ген HEPH), c.367G>A (ген MC1R) и g.299084751С>T (ген NR6A1) – для 70 животных домашней свиньи, табл. 1.

Таким образом, по данным генотипов c.367G>A (ген MC1R) и g.299084751С>T (ген NR6A1), согласно методике [10], из 70 домашних свиней, имеющих азиатское происхождение, 57.14% (40/70) отнесены к группе “Дикий кабан”, т.е. имеет место неправильная дифференциация (отмечены в табл. 1 как *). Для 21.43% (15/70) случаев не представилось возможным отнести особь ни к какой группе – ни к “Домашней свинье”, ни к “Дикому кабану” (отмечены в табл. 1 как #). В то же время, для всех особей домашних свиней азиатского происхождения для полиморфизма H3GA0051814 (ген HEPH) был определен генотип CC, т.е., как и ранее было показано на образцах домашних свиней из Беларуси, для домашних свиней азиатского происхождения был показан один генотип. Таким образом, возможное решение сложившейся ситуации – введение в существующую схему (включающую два SNP – c.367G>A (ген MC1R) и g.299084751C>T (ген NR6A1)) третьего SNP – H3GA0051814 (ген HEPH), дифференцирующий потенциал которого мы оценили в рамках данной работы.

На основании результатов генотипирования по полиморфизму H3GA0051814 (HEPH) в двух выборках – “Дикий кабан” (n = 150) и “Домашняя свинья” (n = 200), а также учитывая результаты, представленные в работе В.Н. Кипень с соавт. по полиморфным вариантам c.367G>A (MC1R) и g.299084751C>T (NR6A1) [11], с использованием MDR-анализа была охарактеризована модель по дифференциации дикого кабана от домашней свиньи с использованием трех SNP, рис. 4. Точность дифференциации дикого кабана от домашней свиньи при анализе полиморфизма трех SNP – H3GA0051814 (HEPH), c.367G>A (MC1R) и g.299084751C>T (NR6A1) – составила 99.14%. Ни в одном случае образец домашней свиньи не был принят за дикого кабана – специфичность модели оказалась равной 100%.

Рис. 4.

Графическое представление модели из трех ОНП в генах HEPH, MC1R и NR6A1 для дифференциации дикого кабана и домашней свиньи, адаптировано из ПО MDR v. 3.0.2 (абсолютные значения в любой клетке для первого столбца соответствуют количеству образцов дикого кабана, для второго образца – количеству образцов домашней свиньи).

Далее мы апробировали метод HRM для генотипирования полиморфных вариантов H3GA0051814 (HEPH), c.367G>A (MC1R) и g.299084751C>T (NR6A1). Цель этапа – дать исследователю простой, точный и доступный метод генотипирования в контексте описанной выше модели. Для деградированных образцов ДНК, как нам представляется, данный способ будет весьма актуален.

Генотипирование трех SNP проводилось с использованием Precision Melt Supermix for High Resolution Melt (HRM) Analysis (Bio-Rad, США) в трехкратной повторности. Результаты аллельной кластеризации были подтверждены с использованием ПЦР-ПДРФ и KASP. Результаты кластеризации для полиморфизма H3GA0051814 (HEPH) отражены на рис. 5,а, для SNP c.367G>A (MC1R) – рис. 5,б, для g.299084751C>T (NR6A1) – рис. 5,в.

Рис. 5.

Результат кластеризации генотипов в Precision Melt Analysis™ Software v. 1.3 (Bio-Rad, США) для полиморфизма: а – H3GA0051814 (HEPH); б – c.367G>A (MC1R); в – g.299084751C>T (NR6A1).

В рамках проведенного исследования решен ряд задач, направленных на повышение точности и специфичности имеющейся тест-системы (основанной на анализе двух SNP в генах MC1R и NR6A1) по дифференциации дикого кабана и домашней свиньи. Так, с использованием биоинформационной обработки данных определен SNP c высоким дифференцирующим потенциалом для различения дикого кабана и домашней свиньи – H3GA0051814 (HEPH), а также на практическом материале (образцы дикого кабана и семь основных пород домашней свиньи, разводимых в Республике Беларусь) подтвержден высокий дифференцирующий потенциал данного полиморфизма. Полученные с использованием метода ПЦР-ПДРФ результаты генотипирования SNP H3GA0051814 подтверждены с использованием технологии KASP. Дополнительно установлено, что полиморфизм H3GA0051814 также способен дифференцировать породы домашних свиней азиатского происхождения от особей дикого кабана. На этом основании предложена новая тест-модель из трех SNP – H3GA0051814 (HEPH), c.367G>A (MC1R) и g.299084751C>T (NR6A1), – точность которой составляет 99.14% при 100% специфичности. С использованием технологии HRM предложен легкий в исполнении, точный полуколичественный метод для генотипирования данных трех SNP.

Предложенная нами схема по дифференциации дикого кабана и домашней свиньи с использованием именно трех SNP выгодно отличается от имеющихся подходов, в первую очередь своей универсальностью (подходит для дифференциации в том числе и домашних пород свиней азиатского происхождения), а также высокими точностью и специфичностью. Анализ с использованием HRM призван сократить временные и финансовые затраты на молекулярно-генетическое тестирование, а также снизить риск кросс-контаминации, т.к. процесс является одностадийным (исключены этапы рестрикции и электрофореза).

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке Программы научных исследований на 2016–2020 гг., проект “Разработка методики ДНК-дифференциации биологических образцов животных вида кабан европейский (дикий и домашний)”.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.