Генетика, 2020, T. 56, № 9, стр. 1098-1102

Сравнительный протеомный и транскриптомный анализ устойчивого к нитрон-олигомицину мутантного штамма Streptomyces fradiae-nitR+bld

О. Б. Беккер 1*, А. А. Ватлин 1, Д. А. Мавлетова 1, Л. Н. Лысенкова 2, А. Е. Щекотихин 2, В. Н. Даниленко 1

1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
119991 Москва, Россия

2 Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе
119021 Москва, Россия

* E-mail: obbekker@mail.ru

Поступила в редакцию 11.10.2019
После доработки 01.11.2019
Принята к публикации 05.11.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Штамм Streptomyces xinghaiensis (fradiae) ATCC19609 чувствителен к антибиотикам различных химических классов и сверхчувствителен к макролидному антибиотику олигомицину A. Спонтанный мутант S. fradiae-nitR+bld, устойчивый к нитрон-олигомицину, несет мутацию в гене транскрипционного регулятора РadR. Проведен сравнительный протеомный анализ инвертированных мембранных везикул мутантного штамма и штамма дикого типа S. xinghaiensis (fradiae) ATCC19609. С помощью масс-спектрометрического анализа были выявлены в везикулах мутантного штамма количественные изменения фракций белков двух ABC-транспортеров, лейцил-аминопептидазы, щелочной фосфатазы и аланиндегидрогеназы по сравнению с везикулами штамма дикого типа. В результате транскрипционного анализа было зарегистрировано увеличение уровней экспрессии генов ABC-транспортеров, щелочной фосфатазы и лейцил-аминопептидазы и падение уровня экспрессии генааланиндегидрогеназы мутантного штамма S. fradiae-nitR+bld по сравнению со штаммом дикого типа. Это позволило сделать предположение, что ген padR, в котором была обнаружена мутация, может участвовать в процессах регуляции устойчивости к антибиотику и дифференцировки.

Ключевые слова: Streptomyces xinghaiensis (fradiae), padR, нитрон-олигомицин.

Штамм S. xinghaiensis (fradiae) ATCC19609 чувствителен к антибиотикам различных химических классов более других актинобактерий рода Streptomyces и сверхчувствителен к макролидному антибиотику олигомицину A и его производным [13]. Из штамма S. xinghaiensis (fradiae) ATCC19609 был получен спонтанный мутант со слаборазвитым воздушным мицелием (“лысый” (bаld)) S. fradiae-nitR+bld, устойчивый к нитрон-олигомицину. Сравнительный геномный анализ штаммов S. xinghaiensis (fradiae) ATCC19609 [4] и S. fradiae-nitR+bld выявил мутацию, которая привела к аминокислотной замене H(24)R в высококонсервативном ДНК-связывающем домене гена padR многофункционального транскрипционного регулятора [5].

В результате биоинформатического анализа генома S. xinghaiensis (fradiae) ATCC19609 был обнаружен сайт связывания транскрипционного регулятора PadR в области 13 пн выше стартового кодона гена фактора транскрипции marR. Индукция нитрон-олигомицином в логарифмической фазе роста культур S. fradiae-nitR+bld и штамма дикого типа приводит к значительному увеличению уровня экспрессии гена marR у мутантного штамма по сравнению со штаммом дикого типа [5].

Факторы транскрипции семейства MarR (множественный регулятор устойчивости к антибиотикам) могут регулировать оперон marRAB и участвовать в процессах устойчивости к множественным стрессам окружающей среды [6]. Белок DptR3 семейства MarR функционирует в качестве глобального регулятора, который положительно контролирует синтез антибиотика даптомицина и морфологическое развитие S. roseosporus [7].

Для визуализации качественных и количественных различий между белками штамма дикого типа и штамма S. fradiae-nitR+bld был проведен двумерный электрофорез в ПААГ фракций белков инвертированных мембранных везикул двух штаммов. Препараты инвертированных мембранных везикул растворяли в буфере, содержащем 8 М мочевину, 2 М тиомочевину, 16.7% раствора (30% CHAPS, 10% NP-40), 80 мМ ДТТ, 5% амфолиты (pH 3–10). Изоэлектрофокусировку проводили на 7 см IPG Strips (pH 3–10, Bio-Rad, США) с использованием PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad, США), согласно рекомендациям производителя. Во втором направлении использовали 12.5% SDS-ПААГ. Гели окрашивали CBB R-250. Качественные изменения были детектированы с помощью масс-спектрометрического анализа белковых фракций везикул в первой половине логарифмической фазы роста штаммов S. fradiae-nitR+bld и дикого типа. Образцы для масс-спектрометрии были получены методом, рекомендованным Promega (США) (In Gel Digest Protocol); масс-спектры – методом, рекомендованным Bruker Daltonics (США), с помощью аналитического масс-спектрометра Ultrafle Xtreme MALDI TOF/TOF Ms (Bruker Daltonics GmbH, Германия) в отделе протеомных исследований Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. Белки были идентифицированы с использованием программного обеспечения Mascot (www.matrixscience.com) и базы данных NCBI. Было зарегистрировано количественное увеличение фракций белков двух ABC-транспортеров, щелочной фосфатазы и лейцил-аминопептидазы, а также отсутствие белковой фракции аланиндегидрогеназы в штамме S. fradiae-nitR+bld по сравнению со штаммом дикого типа (табл. 1).

Таблица 1.

Спектр количественных изменений белков и их характеристика у мутанта S. fradiae-nitR+bld и S. xinghaiensis (fradiae) ATCC19609

Номер в GenBank Молекулярная масса, кДа Аннотация белка в GenBank Предполагаемая функция Количественные изменения белковой фракции в штаммах S. xinghaiensis (fradiae)
ATCC19609 nitR+bld
WP_043466588.1 PstS 39.319 Phosphate ABC transporter substrate-binding protein Включен в процессы транспорта фосфата и дифференцировки +
WP_043465859.1 OppA 59.683 Peptide ABC transporter substrate-binding protein Включен в процессы адгезии +
WP_043468956.1 PhoD-like 57.761 Alkaline
phosphatase
Включен в метаболизм неорганических ионов +
WP_043470568.1 Aminopeptidase A 51.676 Leucyl
aminopeptidase
Включен в процессы споруляции +
WP_043468956.1 Ald 39.366 Alanine
dehydrogenase
Включен в процессы споруляции +

Белки щелочной фосфатазы (WP_043468956.1) и лейцил-аминопептидазы (WP_043470568.1) находятся в одной и той же белковой фракции. Возникает вопрос: какой из двух генов мутантного штамма обладает повышенным уровнем экспрессии? Исследование экспрессии генов было проведено с использованием метода ПЦР в реальном времени. Определение количественного изменения уровней транскрипции двух генов ABC-транспортеров (WP_043466588.1, WP_043465859.1) и гена аланиндегидрогеназы (WP_043468956.1) также проводили с использованием метода ПЦР в реальном времени в пробах, отобранных в первой половине логарифмической фазы роста. Для синтеза кДНК использовали стандартные процедуры, установленные Invitrogen Company (США). Все ампликоны имели длину ~150 пн, все эксперименты были проведены в трех независимых повторах. Геноспецифичные праймеры, использованные в этом эксперименте, представлены в табл. 2. Для постановки реакций амплификации использовали мастер-смеси Power PCB SYBR® Green (Applied Biosystems), амплификатор Real-Time CFX96 (Bio-Rad). Экспрессия генов была нормализована на экспрессию генов “домашнего хозяйства” dna-polymerase I, gtp-ase. Изменение уровней экспрессии генов рассчитывали с использованием метода 2−ΔΔCt. Мы зарегистрировали 6-кратное и 3-кратное увеличение уровней экспрессии генов ABC-транспортеров pstS и opp, 2.5-кратное увеличение – гена щелочной фосфатазы phoD и 3-кратное увеличение – гена лейцил-аминопептидазы мутантного штамма (рис. 1). Уровень экспрессии гена аланиндегидрогеназы штамма S. fradiae-nitR+bld был многократно ниже по сравнению со штаммом дикого типа, что соответствует результатам масс-спектрометрического анализа.

Таблица 2.  

Праймеры, использованные в работе

Название гена Номер в GenBank Последовательности олигонуклеотидных праймеров
1 Phosphate ABC transporter substrate-binding protein PstS gi|759756058 CGACTGGAAGTACGAGGACG
ACCGAGTTGAGGTTGTTGCT
2 Peptide ABC transporter substrate-binding protein Oop gi|759755325 GTTGTCGCCCTTCTCCATCA
AAGGTCAAGGGCATGTACCG
3 Alanine dehydrogenase ald gi|759758444 TGCTGCTCAAGGTGAAGGAG
GGTCTCCACCGTCTCGTAGG
4 Alkaline phosphatase phoD-like gi|759752118 CAGGATGATCGTCGAGACCT
CAGCACCCGGTAGTGGATTT
5 Leucyl aminopeptidase gi|759760072 GAAGGACTTCGGGTGCAGG
AGAAGGACGACAAGAGCACG
6 dna-polymerase I WP_043463190.1 GAACGACCCGAACTGGTTGA
CGGAGAAGGTGCAGGAGAAG
7 gtp-ase WP_043460113.1 CATCCACGCCAACCTCTACA
GTCCTTGGCGACCTTCACAT
Рис. 1.

Изменение уровня экспрессии генов S. fradiae-nitR+bld в сравнении с S. xinghaiensis (fradiae) ATCC19609 в первой половине логарифмической фазы. Относительная экспрессия генов S. fradiae-nitR+bld по сравнению со штаммом S. xinghaiensis (fradiae) ATCC19609 была рассчитана с использованием сравнительного метода Ct (2–ΔΔCt), принимая экспрессию генов в S. xinghaiensis (fradiae) ATCC19609 за единицу. Экспрессия целевых генов была нормирована на экспрессию генов домашнего хозяйства.

Увеличение уровня синтеза белка лейцил-аминопептидазы может внести свой вклад в образование “лысого” (bаld) – фенотипа штамма S. fradiae-nitR+bld. Делеция гена лейцил-аминопептидазы у S. coelicolor привела к усилению споруляции у исследуемого штамма [8], следовательно увеличение уровня экспрессии гена, вероятно, приводит к ослаблению процесса спорообразования.

Увеличение количества белка щелочной фосфатазы может быть вызвано проблемами утилизации фосфора [9], что, по всей видимости, связано с процессами дифференцировки у стрептомицетов [10]. Клеточная стенка большинства грамположительных бактерий содержит равные количества пептидогликана и гликополимеров фосфат-богатой тейхоевой кислоты. Во время роста, лимитированного фосфатом, грамположительного модельного организма Bacillus subtilis-168 тейхоевая кислота терялась из клеточной стенки в результате ответа, опосредованного двухкомпонентной системой PhoPR, которая регулирует гены, участвующие в сохранении и приобретении фосфата. Считается, что тейхоевая кислота обеспечивает источник фосфора для поддержания роста в условиях голода [11].

PstS, мембраносвязанный липопротеин, необходим для высокоаффинного транспорта фосфатов в S. coelicolor [12]. PstS-1, 38-кДа M. tuberculosis, – маннозилированный гликолипопротеин. Опыт его ингибирования с использованием маннана и иммунопреципитации показал, что PstS-1 связывает рецептор маннозы [13]. Делетирование генов pstS у S. lividans и S. coelicolor нарушало транспорт фосфатов и ускоряло дифференцировку и споруляцию культур на твердых средах [14]. Исходя из этого, можно предположить, что увеличение уровня экспрессии pstS влияет на приобретение “лысого фенотипа” мутантным штаммом S. fradiae-nitR+bld.

Олигопептидпермеаза (Opp) – белок-связывающий АТФ-зависимый ABC-транспортер [15]. Кассета с олигопептид-пермеазой, система транспорта олигопептидов, относится к суперсемейству АТФ-связывающих кассет (ABC) и широко распространена у бактерий. У Streptococcus suis белки Opp играют важную роль в вирулентности патогена, делеция гена oppA значительно влияет на его рост и вирулентность. Темпы роста, а также способность к адгезии штамма с делетированным геномна эпителиальные клетки человека значительно уменьшаются по сравнению со способностью штамма дикого типа [16]. В работе [17] подтверждается роль OppAв стимуляции адгезии Lactobacillus casei и Lactococcus lactis на культуры эукариотических клеток.

Таким образом, результаты протеомного исследования и транскрипционного анализа объясняют bald-фенотип мутантного штамма. Мы можем предположить, что устойчивость к нитрон-олигомицину обусловливается процессами, связанными с метаболизмом фосфата в клетке.

Работа поддержана грантом РНФ № 15-15-00141П – “Изучение механизма действия и формирование резистентности к олигомицину А и его производным у актинобактерий.”

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Alekseeva M.G., Elizarov S.M., Bekker O.B. et al. F0F1 ATP synthase of streptomycetes: Modulation of activity and oligomycin resistance by protein Ser/Thr kinases // Biochem. Suppl. Ser. A Membr. Cell Biol. 2009. V. 3. № 1. P. 16–23. https://doi.org/10.1134/S1990747809010036

  2. Lysenkova L.N., Godovikov I.A., Korolev A.M. et al. Synthesis and anti-actinomycotic activity of the oligomycin A thiocyanato derivative modified at 2-oxypropyl side chain // Macroheterocycles. 2015. V. 8(4). P. 424–428. https://doi.org/10.6060/mhc151084s

  3. Lysenkova L.N., Saveljev O.Y., Grammatikova N.E. et al. Verification of oligomycin A structure: synthesis and biological evaluation of 33-dehydrooligomycin A // J. Antibiot. (Tokyo). 2017. V. 70(8). P. 871–877. https://doi.org/10.1038/ja.2017.48

  4. Bekker O.B., Klimina K.M., Vatlin A.A. et al. Draft genome sequence of Streptomyces fradiae ATCC19609, a strain highly sensitive to antibiotics // Genome Announcements. 2014. V. 2(6). e01247-14. https://doi.org/10.1128/genomeA.01247-14

  5. Vatlin A.A., Bekker O.B., Lysenkova LN. et al. A functional study of the global transcriptional regulator PadR from a strain Streptomyces fradiae-nitR+bld, resistant to nitrone-oligomycin // J. Basic. Microbiol. 2018. V. 58(9). P. 739–746. https://doi.org/10.1002/jobm.201800095

  6. Gong Z., Li H., Cai Y. et al. Biology of MarR family transcription factors and implications for targets of antibiotics against tuberculosis // J. Cell Physiol. 2019. V. 234(11). P. 19237–19248. https://doi.org/10.1002/jcp.28720

  7. Zhang Q., Chen Q., Zhuang S. et al. A MarR family transcriptional regulator, DptR3, activates daptomycin biosynthesis and morphological differentiation in Streptomyces roseosporus // Appl. Environ. Microbiol. 2015. V. 81(11). P. 3753–3765. https://doi.org/10.1128/AEM.00057-15

  8. Song E., Rajesh T., Lee B.R. et al. Deletion of an architectural unit, leucyl aminopeptidase (SCO2179), in Streptomyces coelicolor increases actinorhodin production and sporulation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. V. 97(15). P. 6823–6833. https://doi.org/10.1007/s00253-013-4847-4

  9. Solans M., Messuti M.I., Reiner G. et al. Exploring the response of Actinobacteria to the presence of phosphorus salts sources: Metabolic and co-metabolic processes // J. Basic. Microbiol. 2019. V. 59(5). P. 487–495. https://doi.org/10.1002/jobm.201800508

  10. Franco-Correa M., Quintana A., Duquea C., Suareza C. Evaluation of actinomycete strains for key traits related with plant growthpromotion and mycorrhiza helping activities // Appl. Soil. Ecol. 2010. V. 45. P. 209–217.https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2010.04.007

  11. Myers C.L., Li F.K., Koo B.M. et al. Identification of two phosphate starvation-induced wall teichoic acid hydrolases provides first insights into the degradative pathway of a key bacterial cell wall component // J. Biol. Chem. 2016. V. 9. № 291(50). P. 26066–26082. https://doi.org/10.1074/jbc.M116.760447

  12. Wehmeier S., Varghese A.S., Gurcha S. et al. Glycosylation of the phosphate binding protein, PstS, in Streptomyces coelicolor by a pathway that resembles protein O-mannosylation in eukaryotes // Mol. Microbiol. 2009. V. 71(2). P. 421–433. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2008.06536.x

  13. Esparza M., Palomares B., García T. et al. PstS-1, the 38-kDa Mycobacterium tuberculosis glycoprotein, is an adhesin, which binds the macrophage mannose receptor and promotes phagocytosis // Scand. J. Immunol. 2015. V. 81(1). P. 46–55. https://doi.org/10.1111/sji.12249

  14. Díaz M., Esteban A., Fernández-Abalos J.M., Santamaría R.I. The high-affinity phosphate-binding protein PstS is accumulated under high fructose concentrations and mutation of the corresponding gene affects differentiation in Streptomyces lividans // Microbiology. 2005. V. 151(Pt 8). P. 2583–2592. https://doi.org/10.1099/mic.0.27983-0

  15. Moutran A., Quaggio R.B., Balan A. et al. The oligopeptide permease (Opp) of the plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri // Curr. Microbiol. 2004. V. 48(5). P. 354–359. https://doi.org/10.1007/s00284-003-4206-2

  16. Zheng F., Shao Z.Q., Hao X. et al. Identification of oligopeptide-binding protein (OppA) and its role in the virulence of Streptococcus suis serotype 2 // Microb. Pathog. 2018. V. 118. P. 322–329. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2018.03.061

  17. Martín C., Escobedo S., Pérez-Martínez G. et al. Two alkaline motifs in the Lactobacillus salivarius Lv72 OppA surface are important to its adhesin function // Benef. Microbes. 2019. V. 8. № 10(1). P. 101–109. https://doi.org/10.3920/BM2018.0052

Дополнительные материалы отсутствуют.