Генетика, 2021, T. 57, № 10, стр. 1185-1193

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выборка для данного исследования включала 746 человек. Среди них мужчины составляли 305 человек (больные ЯБ – 188, контрольная группа – 117), а женщины – 441 человек (больные ЯБ – 211, контрольная группа – 230). Среди женщин, больных ЯБ, 149 индивидуумов имели язвенную болезнь желудка (70.61%) и 62 пациента – язвенную болезнь двенадцатиперстной кишки (29.39%). Среди мужчин, больных ЯБ, данные показатели составили 68 (36.17%) и 120 (63.83%) человек соответственно. Выборка для исследования формировалась из индивидуумов русской национальности, родившихся и проживающих в Центральном Черноземье РФ [15, 16], не состоящих в родстве между собой. Пациенты включались в исследование только после установления диагноза, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования [1]. Диагностика язвенной болезни проводилась на базе отделения гастроэнтерологии Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Всем пациентам было выполнено эндоскопическое исследование желудка и двенадцатиперстной кишки (гастродуоденоскопия) с последующей биопсией. Для определения Н. pylori проводилось морфологическое исследование биоптатов слизистой оболочки. Н. pylori была выявлена у 202 больных ЯБ (50.62% от всех больных), в том числе у 100 мужчин с ЯБ (53.19% от всех мужчин, больных ЯБ) и у 102 женщин с ЯБ (48.34% от всех женщин, больных ЯБ). В контрольную группу включались индивидуумы соответствующего группе больных пола, без клинических и эндоскопических признаков язвенной болезни, сопоставимые с больными по возрасту. Средний возраст изучаемой группы мужчин, больных ЯБ, и контрольной группы составил 48.24 ± 13.63 и 48.64 ± 13.52 лет соответственно (р > 0.05), среди женщин средний возраст был равен 49.04 ± 12.53 лет (больные ЯБ) и 49.23 ± ± 12.75 лет (контрольная группа) (р > 0.05). Исследование проводилось под контролем этического комитета медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета с информированного согласия всех обследуемых индивидуумов.

Материалом для молекулярно-генетического исследования послужили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови фенольно-хлороформным методом. Для исследования были отобраны десять полиморфных локусов генов матриксных металлопротеиназ: rs1799750 MMP1, rs243865 MMP2, rs679620 MMP3, rs1940475 MMP8, rs3918242, rs3918249, rs17576, rs3787268, rs2250889, rs17577 гена MMP9. Включенные в исследование локусы являются регуляторными полиморфными вариантами (rSNP) [17, 18], согласно базе данных HaploReg (v4.1.) (http://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) они имеют значимый регуляторный потенциал. Амплификацию полиморфных локусов проводили с помощью полимеразной цепной реакции на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad) методом TaqMan зондов (использовались наборы, синтезированные ООО “Тест-Ген” (Ульяновск)).

Ассоциации полиморфных локусов генов MMP с ЯБ изучались методом логистической регрессии (оценивались доминантная, рецессивная и аддитивная генетические модели взаимодействия аллелей) с использованием программы PLINK v 2.050 (http://pngu.mgh.harvard.edu/Èpurcell/plink). Характер ассоциаций оценивался на основе показателя отношения шансов (ОШ) и его 95%-ного доверительного интервала (95% ОШ). Коррекцию на множественные сравнения проводили с использованием адаптивного пермутационного теста (p_perm). Статистически значимым считали уровень p_perm < 0.05.

Для полиморфных локусов генов MMP, показавших значимые ассоциации с ЯБ, рассмотрены их эпигенетические эффекты (использовались базы данных HaploReg (http://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) и GTExportal (http://www.gtexportal.org/) по ранее представленной методике [19–22].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Данные по распределению частот генотипов и аллелей в исследуемых группах мужчин и женщин с ЯБ и контроля, а также в рассматриваемой выборке в целом представлены в табл. 1. По всем изученным десяти локусам генов MMP наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемому распределению согласно закону Харди–Вайнберга (p_bonf > 0.05).

Выявлены особенности ассоциации полиморфных локусов генов MMP с развитием ЯБ у мужчин и женщин (табл. 2). Так, у мужчин с формированием заболевания были ассоциированы два полиморфных локуса гена MMP9 – rs3918249, rs17576, тогда как у женщин с развитием заболевания связан полиморфный локус rs1799750 гена MMP1. При этом факторами риска возникновения ЯБ у мужчин были аллели С rs3918249 (согласно доминантной модели ОШ = 1.61, 95% ОШ 1.01–2.59, p = 0.047, p_perm = 0.048) и G rs17576 (согласно аддитивной модели ОШ = 1.48, 95% ОШ 1.06–2.07, p = 0.023, p_perm = 0.024 и рецессивной модели ОШ = 2.08, 95% ОШ 1.03–4.19, p = 0.040, p_perm = 0.042). У женщин аллель 2G rs1799750 гена MMP1 в соответствии с аддитивной моделью имеет протективное значение при развитии заболевания (ОШ = 0.74, 95% ОШ 0.57–0.96, p = 0.021, p_perm = 0.047). Таким образом, согласно полученным нами данным полиморфизм rs3918249 и rs17576 гена MMP9 определяет подверженность к развитию ЯБ у мужчин, а rs1799750 гена MMP1 – у женщин.

Проведенный анализ эпигенетической роли полиморфных локусов, вовлеченных в формирование ЯБ у мужчин и женщин, показал следующее. Во-первых, локусы rs3918249 и rs17576 гена MMP9 влияют на афинность мотивов ДНК к четырем и одному факторам транскрипции соответственно (Hmx, Hoxb8, Arid3a, Pax-5 и Pax-4 соответственно). Причем аллельные варианты этих локусов, ассоциированные с повышенным риском развития ЯБ у мужчин (аллели С rs3918249 и G rs17576), определяют более высокое сродство к транскрипционным факторам Hmx (ΔLOD scores для аллелей С и Т rs3918249 равен 1.9), Hoxb8 (ΔLOD = 2.9) и низкую афинность мотивов ДНК к Arid3a (ΔLOD = –0.7), Pax-5 (ΔLOD = –3.9) и Pax-4 (ΔLOD scores для аллелей G и A rs3918249 равен –2.1).

Во-вторых, полиморфный локус rs3918249 находится в регионе белков-гистонов, которые маркируют регуляторные области (промоторы, энхансеры) гена MMP9 в слизистой оболочке желудка (H3K4me1_Enh) и двенадцитиперстной кишки (H3K4me3_Pro), гладкой мускулатуре желудка (H3K4me3_Pro) и двенадцатиперстной кишки (H3K4me1_Enh и H3K4me3_Pro) взрослого организма. Выраженный регуляторный потенциал имеет и rs17576, локализованный в области промоторных и энхансерных участков гена MMP9 в различных отделах пищеварительной системы как плода (желудок – H3K4me1_Enh), так и взрослого организма: слизистая оболочка желудка (H3K4me1_Enh) и двенадцатиперстной кишки (H3K4me1_Enh и H3K4me3_Pro), гладкая мускулатура желудка (H3K4me1_Enh и H3K4me3_Pro) и двенадцатиперстной кишки (H3K4me1_Enh и H3K4me3_Pro).

В-третьих, однонуклеотидный полиморфизм rs3918249 гена MMP9 ассоциирован с экспрессией ряда генов (PLTP, NEURL2, RP3-337O18.9) в различных отделах пищеварительной системы: желудке (PLTP, β = –0.25, р = 1.7 × 10^–5, p_FDR ≤ 0.05), пищеводе (PLTP, β = –0.13, р = 6.2 × 10^–5, p_FDR ≤ ≤ 0.05), толстом кишечнике (PLTP, β = –0.25, р = = 1.7 × 10^–5, p_FDR ≤ 0.05; NEURL2, β = –0.22, р = 4.9 × × 10^–5, p_FDR ≤ 0.05; RP3-337O18.9, β = –0.28, р = = 3.5 × 10^–6, p_FDR ≤ 0.05). Важное eQTL значение для разных отделов пищеварительной системы имеет и полиморфизм rs17576 гена MMP9 – он связан с экспрессией трех генов PLTP, NEURL2, RP3-337O18.9 в пищеводе (PLTP, β = –0.15, р = 2.7 × × 10^–6, p_FDR ≤ 0.05; NEURL2, β = –0.25, р = 1.8 × × 10^–5, p_FDR ≤ 0.05; RP3-337O18.9, β = –0.23, р = = 7.4 × 10^–5, p_FDR ≤ 0.05) и толстом кишечнике (PLTP, β = –0.18, р = 5.6 × 10^–7, p_FDR ≤ 0.05; NEURL2, β = –0.23, р = 1.3 × 10^–5, p_FDR ≤ 0.05; RP3-337O18.9, β = –0.28, р = 1.9 × 10^–10, p_FDR ≤ 0.05). При этом обращает на себя внимание факт того, что аллельные варианты этих локусов, ассоциированные с повышенным риском развития ЯБ у мужчин (аллели С rs3918249 и G rs17576), связаны с более низкой экспрессией (β < 0) всех трех вышерассмотренных генов (PLTP, NEURL2, RP3-337O18.9) в разных отделах пищеварительного тракта.

В-четвертых, выраженные эпигенетические эффекты характерны и для полиморфного локуса rs1799750 гена MMP1, определяющего подверженность к развитию ЯБ у женщин: он влияет на сродство мотивов ДНК к 21 фактору транскрипции (AP-1, CHX10, DMRT2, Hoxb4, PLZF и др.), расположен в области модифицированных гистоновых белков, которые маркируют энхансеры (H3K4me1_Enh) и “активные” энхансеры (H3K27ac_Enh) в желудке и тонком кишечнике плода, слизистой оболочке желудка (H3K4me1_Enh) и двенадцатиперстной кишки (H3K4me1_Enh), гладкой мускулатуре желудка (H3K27ac_Enh) и двенадцатиперстной кишки (H3K27ac_Enh) взрослого организма, находится в регионе взаимодействия с двумя регуляторными белками – CFOS и GATA2. При этом следует отметить, что лишь для шести факторов транскрипции (AP-1, Dbx1, En-1, Evi-1, HMG-IY, Pou3f2) аллель 2G rs1799750 гена MMP1, связанный с низким риском развития ЯБ у женщин, повышает афинность ДНК (ΔLOD > 0), тогда как для подавляющего числа транскрипционных факторов – 16 (CHX10, DMRT2, Hoxb4, PLZF, Pax-4, Pax-6 и др.) данный полиморфизм снижает сродство регуляторных мотивов ДНК (ΔLOD < 0).

В-пятых, с транскрипционной активностью гена MMP1 в пищеварительной системе (пищевод) ассоциирован и rs1799750 гена MMP1 (β = –0.30, р = 2.8 × 10^–7, p_FDR ≤ 0.05). При этом аллель 2G rs1799750, имеющий протективное значение при развитии ЯБ у женщин, связан с более высоким уровнем экспрессии гена MMP1 (для референсного ему аллеля 1G β < 0).

Итак, полученные нами данные указывают на выраженные эпигенетические эффекты полиморфных локусов rs3918249 и rs17576 гена MMP9, и rs1799750 гена MMP1, которые они проявляют в различных отделах пищеварительной системы и в том числе органах-мишенях, поражаемых при язвенной болезни, – желудке и двенадцатиперстной кишке. Следует отметить, что полиморфные локусы rs3918249 и rs17576 гена MMP9 находятся на расстоянии 2.1 тыс. пн друг от друга и сильно сцеплены между собой (r² = 0.99, D' = 0.99), поэтому их функциональные эффекты могут перекрываться.

Следует отметить, что в доступной нам литературе представлены лишь единичные работы, посвященные изучению роли полиморфизма генов MMP в формировании язвенной болезни [13, 14, 23, 24], среди которых на модели российской популяции выполнено лишь одно исследование. Так, в работе Шаймардановой и др. [14] были изучены ассоциации с развитием ЯБ в популяции Республики Башкортостан трех из десяти изученных в нашей работе полиморфных локусов генов MMP: rs1799750 гена MMP1, rs3918242 и rs17576 гена MMP9. Для двух из этих трех полиморфных локусов авторы установили ассоциации с заболеванием: генотип 1G/2G rs1799750 гена MMP1 являлся фактором риска развития ЯБ у татар (OR = 1.94, p = 0.02), а rs17576 гена MMP9 ассоциирован с развитием ЯБ у татар (для генотипа А/A OR = 0.49, p = 0.007 и для генотипа А/G OR = 2.19, p = 0.003), формированием язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (для генотипа А/G OR = 1.57, p = 0.009) и развитием ЯБ у татар на фоне H. pylori инфекции (для генотипа А/A OR = 0.54, p = 0.03 и для генотипа А/G OR = 2.23, p = 0.009).

Полученные нами данныe о рисковом значении для развития ЯБ у мужчин аллеля G rs17576 и соответственно протективной роли в формировании заболевания референсного для него аллеля А полностью согласуются с результатами работы Шаймардановой и др. [14], но отличаются от материалов, полученных в исследованиях Yeh et al. [13] и Hellmig et al. [23]. В работе Yeh et al. [13] не выявлено значимых ассоциаций rs17576 MMP9 с развитием H. pylori-позитивной язвенной болезни желудка и язвенной болезни двенадцатиперстной кишки в тайваньской популяции, а в исследовании Hellmig et al. [23], проведенном в популяции Германии, наоборот, обнаружено рисковое значение для возникновения H. pylori-позитивной язвенной болезни желудка аллеля A rs17576. В работе Shan et al. [24], так же как и в нашем исследовании, не установлено статистически значимых связей rs3918242 гена MMP9 с формированием язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у детей в китайской популяции.

Имеются многочисленные исследования, указывающие на связь рассматриваемых в настоящей работе полиморфных локусов генов MMP1 и MMP9 с онкологическими заболеваниями пищеварительной системы [25–33]. Наибольшее количество данных, подтверждающих вовлеченность в формирование злокачественных заболеваний пищеварительного тракта, получено для rs1799750 гена MMP1: выявлена связь данного полиморфизма с раком пищевода (аденокарцинома пищевода) [25–28] и раком желудка [29–32]. В работе Okada et al. [33] показаны ассоциации rs17576 MMP9 с раком желудка как самостоятельно, так и в составе гаплотипа CAA rs3918242–rs17576–rs17577 MMP-9. Таким образом, можно сделать заключение о наличии общих генетических механизмов (в виде функционально значимых полиморфных локусов генов MMP1 и MMP9), определяющих предрасположенность как к язвенной болезни, так и к онкологическим заболеваниям пищеварительной системы.

Установлены гендерные особенности ассоциаций полиморфизма генов MMP с развитием ЯБ: rs3918249 и rs17576 гена MMP9 определяют подверженность к развитию ЯБ у мужчин, а rs1799750 гена MMP1 – у женщин. Факторами риска возникновения ЯБ у мужчин являются аллели С rs3918249 (ОШ = 1.61, p_perm = 0.048) и G rs17576 (ОШ = 1.48–2.08, p_perm ≤ 0.042) гена MMP9. У женщин протективное значение для развития заболевания имеет аллель 2G rs1799750 гена MMP1 (ОШ = 0.74, p_perm = 0.047). Полиморфные локусы, ассоциированные с ЯБ у мужчин и женщин, проявляют выраженные эпигенетические эффекты (влияют на афинность мотивов ДНК к различным транскрипционным факторам, расположены в регионе промоторов и энхансеров в желудке и двенадцатиперстной кишке, связаны с экспрессией генов в различных отделах пищеварительной системы).

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации для ведущих научных школ Российской Федерации (проект НШ-2609.2020.7).

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.