Генетика, 2021, T. 57, № 11, стр. 1333-1338

Публикации последних лет в области медицинской генетики предоставляют многочисленные свидетельства успешности и продуктивности применения полногеномного и экзомного секвенирования в клинической практике для персонализированной медицины [1]. Убедительно показана особенная ценность геномного секвенирования в трио пробанд–родители, как эффективного диагностического инструмента первого выбора в случаях сложных и труднодиагностируемых заболеваний, таких как детские неврологические заболевания [2] и задержки развития [3]. Так, недавний метаанализ релевантной литературы показал бесспорные преимущества секвенирования над методами геномного скрининга с помощью ДНК-чипов [4]. С активным развитием технологий геномного секвенирования стоимость такого анализа ежедневно сокращается, что делает метод все более доступным для клинической практики. Это в свою очередь побуждает ряд стран к разработке основ и правил внедрения этого типа анализа в государственные медицинские программы. Одним из таких примеров является прошлогодняя публикация результатов исследования одной из канадских организаций (Health Quality Ontario), разрабатывающих стандарты качества и рекомендации для здравоохранения, в которой представлена подробная оценка технологий здравоохранения относительно использования полногеномного секвенирования для пациентов с необъяснимыми нарушениями развития или множественными врожденными аномалиями [5].

В настоящем исследовании мы приводим одно из доказательств успешности применения геномного (в данном конкретном случае экзомного) секвенирования семейного трио – родителей и пробанда, в качестве первого метода геномного скриннинга случаев множественных необъясненных нарушений и задержек развития ребенка. Кроме того, мы показываем, что экзомное секвенирование позволяет успешно идентифицировать как потенциально патогенные однонуклеотидные варианты, так и клинически значимые структурные перестройки в геноме.

Участники исследования – семья славянского происхождения: родители и ребенок – девочка в возрасте 12 лет с нарушениями физического и психического развития неизвестной этиологии. На момент рождения ребенка возраст матери и отца был 34 и 30 лет соответственно. Беременность проходила без осложнений. Однако роды, наступившие на 42-ой неделе беременности, проходили с некоторыми осложнениями: применялась искусственная стимуляция родовой деятельности, у плода было обнаружено замедленное сердцебиение и жидкость в легких. Оценка новорожденного по шкале Апгар составляла 7–8 балов, вес при рождении – 2920 г, врожденных патологий отмечено не было. Мать с новорожденной были выписаны из родильного отделения на пятый день после родов.

С первых лет жизни у ребенка отмечались множественные нарушения и задержки физического и психического развития: замедленный рост, недостаток веса, задержка развития моторных функций, нарушение сна и кормления. В анамнезе ребенка присутствуют нарушения работы желудочно-кишечного тракта и дефекации, фебрильные судороги и афективно-респираторные приступы с потерей сознания, проблемы со зрением и слухом. Со стороны психоречевого развития у ребенка наблюдаются: сенсорно-моторная алалия, дислексия, синдром дефицита внимания и нарушения обучения. По результатам психологического тестирования уровень адаптивного поведения ребенка отстает от такового у сверстников, с наиболее выраженными проблемами в навыках самообслуживания. Значительное отставание было также отмечено в речевом и познавательном развитии, оцененными по шкалам PLS-5 [7] и MSEL [8] соответственно. В этих доменах общие показатели развития соответствовали пятилетнему уровню, т.е. на семь лет меньше биологического возраста ребенка.

Общая клиническая картина расстройств и задержек развития предполагала высокую долю генетической компоненты в этиологии нарушений. В семейной истории случаев патологий и нарушений развития не отмечено. Проведенный ранее анализ кариотипа ребенка патологий не выявил, был установлен нормальный женский кариотип 46,XX. Других типов молекулярной диагностики ребенку не назначалось; диагноз поставлен не был. Все это позволяло предположить наличие de novo микроизменений в геноме ребенка, не улавливаемых классическими цитогенетическими методами, что, в свою очередь, обусловливало необходимость полногеномного скриннинга ребенка и родителей. Будучи заинтересованы в таком анализе, родители проявили инициативу стать участниками нашего исследовательского проекта, нацеленного на геномные исследования нарушений развития c помощью методов секвенирования. Семья предоставила свое информированное согласие на использование геномных данных и последующую публикацию результатов.

Источником ДНК являлись образцы слюны от родителей и ребенка. Геномный скринниг семейного трио проводился методом полноэкзомного секвенирования. Для приготовления библиотек использовалась панель и набор реагентов для экзомного обогащения Illumina TruSeq Exome. Секвенирование проводилось на базе РЦ СПбГУ на платформе Illumina HiSeq4000. Для анализа данных секвенирования использовались хорошо апробированные и широко применяемые методы и инструменты. Контроль качества данных секвенирования выполнялся с помощью FastQC [9] и оценки распределения к-меров [10]. Выравнивание фрагментов и аннотирование к GRCh37/hg19 проводилось с использованием BWA [11] (версия 0.7.17-r1188) с последующей сортировкой, дедупликацией и повторной калибровкой в соответствии со стандартами и рекомендациями GATK Best Practices [12]. Обнаружение однонуклеотидных вариантов (Single Nucleotide Variant, SNV) проводилось с помощью HaplotypeCaller с последующей рекалибровкой вариантов с помощью VariantRecalibrator, а определение de novo SNV – с помощью VariantAnnotator (GATK 4.1.6). Кроме того, на основе данных экзомного секвенирования и с помощью алгоритмов сегментации cn.MOPS [13] были идентифицированы структурные геномные вариации или вариации числа копий (Copy Number Variation, CNV).

По результатам анализа данных секвенирования и аннотирования к референсному геному в семейном трио было обнаружено свыше 30 тыс. SNV. С помощью инструментов ANNOVAR [14] была проведена фильтрация SNV на основе основных моделей наследования (аутосомно-доминантного, рецессивного и X-сцепленного), с последующей функциональной аннотацией и приоритезацией вариантов в контексте ассоциации с фенотипом задержки развития. Потенциальных вариантов-кандидатов обнаружено не было. Сходный результат был получен для анализа de novo SNV в геноме ребенка. Таковых было обнаружено 23 SNV в состоянии гетерозиготы, 10 из которых являлись миссенс-мутациями, но только две из них: rs77696629 и rs1255143876 – замены в 10-ом экзоне гена карбоксилэфирной липазы CEL и 26-ом экзоне муцина MUC5B соответственно, могут быть отнесены ко вредным мутациям (табл. 1). Оба варианта являются достаточно редкими (Minor allele frequency – MAF < 0.05) и затрагивают гены, мутации в которых известно ассоциированы с развитием таких заболеваний как MODY-диабет (CEL), заболеваний дыхательной системы – астма и идиопатический легочный фиброз (MUC5B). Однако следует отметить, что ни один из выявленных de novo SNV не являлся клинически значимым согласно результатам аннотации к релевантной базе данных ClinVar [15].

При фактическом отсутствии патогенных SNV анализ структурных вариаций позволил установить несколько потенциально клинически значимых перестроек в геноме ребенка. Всего в семейном трио было выявлено 54 CNV, из них 22 – в геноме ребенка, включая 11 микроделеций и дупликаций de novo, отмеченных в восьми хромосомных сегментах (табл. 2). Большинство структурных вариаций может быть отнесено к распространенным полиморфным вариантам: например CNV в регионе сегментальной дупликации генов на хромосоме 1 (1q21.2) и в высокополиморфном локусе на хромосоме 6 (6p21.3), несущем гены главного комплекса гистосовместимости HLA. Однако микроделеции 15q11.2 и дупликации 17p11.2 могут являться маркерами клинически значимых структурных вариаций генома. Также следует отметить, что в данных хромосомных сегментах было обнаружено по два блока делеций и дупликаций соответственно (табл. 2), что при условии дискретности экзомных данных в контексте покрытия генома может являться маркером гораздо более крупных перестроек в данных сегментах.

Будучи выявлены как микроперестройки, не затрагивающие основные синдромальные гены-кандидаты, делеции 15q11.2 и дупликации 17p11.2 тем не менее пересекаются с регионами и типами структурных изменений, связаными с одноименными синдромами (табл. 2), проявляющимися прежде всего как множественные нарушения и задержки развития. Так, делеция NC_000015.9:g.23444002_23600066del была отмечена в районе дупликации гена HERC2, фланкирующего консервативный участок BP1–BP2 (Break Point) критического региона Прадера–Вилли/ Ангельмана 15q11-13. Делеция 300–500 тпн в этом участке, несущем неимпринтные гены CYFIP1, NIPA1, NIPA2 и TUBGCP5, связана с синдромом микроделеции 15q11.2. Выявленные инсерции 17p11.2 длиной 64 и 95 тпн пересекаются с CNV NC_000017.10:g.16757111-20219651)dup, обусловливающем классический синдром дупликации 17p11.2, или синдром Потоки–Люпски (табл. 2). Следует отметить, что комплекс нарушений, как при синдроме микроделеции 15q11.2 – неврологические дисфункции, задержка речевого и моторного развития и аутистическое расстройство, так и при синдроме Потоки–Люпски – задержки психо-физического развития, гипотонус мышц, проблемы с кормлением и расстройства поведения, в высокой степени соответствуют клиническому фенотипу исследованного ребенка.

Как следствие, CNV в 15q11.2 и 17p11.2 были рассмотрены в качестве ключевых для определения этиологии/диагностики данного случая нарушений развития. Полученные в результате нашего исследования данные позволили семье инициировать направленные клинические тесты. Было проведено молекулярно-цитогенетическое исследование хромосом 15 и 17 методом in situ FISH-гибридизации в одной из сертифицированных клинических лабораторий г. Москвы. Выявленные нами микроделеции в локусе 15q11.2 FISH-методом подтверждены не были, тогда как наличие у ребенка дупликации района 17p11.2 было подтверждено как присутствие двух копий локуса LIS и трех копий локуса RAI1 в каждом ядре [nuc ish(LISх2,RAI1х3); ДНК-зонд MD Miller-Dieker LIS (17p13)/MD Smith-Magenis RAI (17p11), KREATECH]. Помимо этого дупликация 17p11.2 была дополнительно валидирована другой диагностической лабораторией методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (MRC-Holland SALSA MLPA probemix P369-А2). Таким образом, она установлена как дупликация g.(?_16852223)_(20130903_?)dup (GRCh37/hg19), включающая гены TNFRSF13B, COPS3, MIR33B, TOM1L2, DRC3, LLGL1, PRPSAP2, MFAP4, ALDH3A1, AKAP10, SPECC1 и основные гены-кандидаты клинического фенотипа – FLCN и RAI1.

В результате, обследованному ребенку, на 13 году его жизни, был поставлен диагноз – вновь приобретенный синдром Потоки–Люпски, что для семьи означает определенность в прогнозах для здоровья и развития дочери и помощь в принятии решения о рождении второго ребенка. Потоки–Люпски (OMIM:610883) – это редкое (1:25 тыс. новорожденных) генетическое заболевание, впервые открытое в 1996 г. [22] и описанное в 2007 г. [23]. Прежде всего, оно связано с нарушением развития ЦНС и пороками сердца. Как многие другие генетические заболевания данная патология характеризуется вариативными клиническими фенотипами [24], что значительно усложняет диагностику в отсутствие генетического анализа.

Таким образом, нами еще раз показана успешность применения экзомного секвенирования для первичной диагностики множественных нарушений развития. Мы уверены, что в условиях постоянно снижающейся стоимости молекулярного и биоинформатического анализов, связанных с геномным секвенированием, подобное тестирование семейных трио в скором будущем найдет свое применение в широкой клинической практике. Также полагаем, что изложенные в данном сообщении результаты анализа СNV и значимости их валидации могут быть полезны для других коллективов, использующих в своих исследованиях методы таргетного экзомного секвенирования для выявления геномных вариаций.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ-17-29-02384, руководитель проекта Е.Л. Григоренко.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.