Генетика, 2021, T. 57, № 2, стр. 179-184

Анализ сцепления генов, контролирующих качественные признаки растений ячменя на хромосоме 6

В. П. Нецветаев *

Белгородский федеральный аграрный научный центр Российской академии наук
308001 Белгород, Россия

* E-mail: netsvetaev@yandex.ru

Поступила в редакцию 02.03.2020
После доработки 06.04.2020
Принята к публикации 08.07.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

На основе генетического анализа F2 по F3 комбинации М13 × r “e’’+o проведена оценка частот рекомбинации между генетическими факторами хромосомы 6 (=6H) у ячменя. Исследование включало следующие гены: r“e’’ (гладкие ости “e’’), sex 1 (щуплый эндосперм, ксения 1), о (оранжевая окраска цветковой чешуи), gs 4 (отсутствие воскового налета на колосе 4), Amy 1–7 (α-амилаза 1, тип 7). Локус Amy 1 идентифицировали путем разделения альфа-амилазы с помощью электрофореза при рН 8.3. На основе пятиточечного теста установлен следующий порядок расположения изученных локусов в хромосоме 6 (=6H): 6S–re (=raw 5) – gs 4 (=gsh 4) – o (=rob 1) cen– Sex 1 –Amy 1 – 6L. Оценка сцепления и анализ данных литературы свидетельствуют, что среди указанных генов локусы Sex 1 и Amy 1 находятся в длинном плече хромосомы 6, остальные генетические факторы ассоциированы с коротким плечом этой хромосомы. Центромера находится между генетическими факторами Sex 1 и o (=rob 1). В целом представленные данные свидетельствуют о необходимости корректировки генетической карты сцепления хромосомы 6 (= 6H) ячменя.

Ключевые слова: ячмень, рекомбинация, гены, карта сцепления, изоферменты альфа-амилаза, хромосома 6 (= 6H).

Альфа-амилаза (К.Ф. 3.2.1.1) зерновых обнаруживается в прорастающих семенах ячменя [13]. Следует отметить, что зрелые и прорастающие зерна обладают также бета-амилазной активностью (К.Ф. 3.2.1.2). Есть несколько физико-химических способов, позволяющих отличить α- и β-амилазы. Так, в присутствии мочевины происходит инактивация β-амилазы при сохранении α‑амилазной активности [3], что позволяет провести генетический анализ изоферментного состава α-амилазы. Для выявления вариантов альфа-амилазы ячменя используется изоэлектрофокусирование [4] или обычный электрофорез при рН 8.3 [5]. Изоферменты альфа-амилаз у ячменя контролируются двумя локусами Amy 1 и Amy 2. На основе анализа пшенично-ячменных дополненных линий установлено, что локус Amy1 находится в хромосоме 6 (=6H), а фактор Amy 2 в хромосоме – 1 (=7H) ячменя [4]. Анализ сцепления с маркерными генами хромосомы 1 (=7H) показал, что локус Amy 2 расположен в длинном плече хромосомы 1 на расстоянии 19.91 ± 3.55% рекомбинации от гена n (=nud1), обусловливающего голозерность зерна [6]. По данным G. Nielsen и O. Frydenberg [7] Amy 1 ориентирован в длинном плече хромосомы 6 в следующем порядке, относительно двух известных генов: o – xn – Amy 1. В сводной карте сцепления хромосомы 6 локус Amy 1 находится в длинном плече хромосомы 6 дистально по отношению к гену xn [8, 9].

Наши данные показали некорректность расположения локуса Amy 1 и известных генов на сводной карте сцепления хромосомы 6. В связи с этим приводим полученные нами результаты по корректировке места положения ряда известных генов, контролирующих морфологические признаки растений ячменя и локуса Amy 1, на карте сцепления хромосомы 6.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для картирования и локализации генов, ответственных за синтез этого фермента, исследовали гибридную комбинацию от скрещивания образцов ячменя, несущих маркерные гены, охватывающие хромосому 6 и отличающиеся по изоэнзимам α-амилаз. В комбинации скрещивания один родитель – Risø М13 (=RisØ 13) – являлся носителем следующих аллелей: Re” (Зазубренные ости “e”), sex 1 (=lys 5) (щуплый эндосперм, ксения 1), О (Соломенная окраска цветковой чешуи), Gs 4 (Наличие воскового налета на колосе 4), V (Двурядный колос), Amy 1–6 (α-амилаза 1 тип 6). Другой родитель r “e” + о нес, соответственно, следующие альтернативные генетические факторы: r e” (гладкие ости “e”), Sex 1 (Выполненный эндосперм), о (оранжевая окраска цветковой чешуи), gs 4 (отсутствие воскового налета на колосе 4), v (шестирядный колос), Amy 1–7 (α-амилаза 1 тип 7). По α-амилазе 2 родители не различались и несли вариант AMY 2–1 (рис. 1). Гены r e”, o, gs 4, sex 1 расположены в хромосоме 6, а – v находится в хромосоме 2 [8, 9].

Рис. 1.

Зимограммы α-амилаз отдельных зерен различных сортов ячменя: 1 – DoubletXXXHORDq; 2, 3 – Треби (к‑11835); 4, 5 – Харьковский 74; 6, 7 – Уссурийский 8 (к-18334); 8, 9 – Круглик 21 (к-13031); 10, 11 – Носовский 9; 12, 13 – Носовский 6 (к-19828); 14, 15 – Носовский 2 (к-19016); 16, 17 – Одесский 36.

Учитывая рекомендуемые изменения в символике обозначения используемых генов [10], в скобках привожу рекомендуемые их символы: r “e” (=raw 5) – гладкие ости 5, o (=rob 1) – оранжевая лемма 1, sex 1 – щуплый эндосперм, ксения 1, gs 4 (=gsh 4) – глянцевый 4. Наиболее распространенные старые названия генов приведены в табл. 1 и на рис. 2.

Таблица 1.

Оценка сцепления Amy 1 с генетическими факторами хромосомы 6 (=6H) (данные F2 по F3 М13 × × r “e” + o)

Аллели Фенотипы в F2 (F2 по F3) $\chi _{{\text{L}}}^{2}$ Рекомбинация, %
$\frac{A}{а}$ × $\frac{B}{b}$   BB Bb bb
АА
Аа
аа
21
5
0
8
36
1
1
7
0
55.52 16.23 ± 3.30
АА
Аа
аа
24
6
0
6
36
1
0
6
0
74.28 13.01 ± 2.90
АА
Аа
аа
6
14
0
14
29
1
10
5
0
2.59 Независимая
АА
Аа
аа
0
7
0
10
39
1
20
2
0
58.39 14.03 ± 3.01
$\frac{О}{о} \times \frac{{Gs\,4}}{{gs\,4}}$ АА
Аа
аа
26
4
0
0
41
2
0
0
6
127.40 3.88 ± 1.57
$\frac{О}{о} \times \frac{V}{{v}}$ АА
Аа
аа
6
9
5
15
27
2
5
9
1
1.02 Независимая
$\frac{О}{о} \times \frac{{Sex\,1}}{{sex\,1}}$ АА
Аа
аа
0
0
7
5
44
1
21
1
0
99.98 4.59 ± 1.68
$\frac{{Gs\,4}}{{gs\,4}} \times \frac{{Sex\,1}}{{sex\,1}}$ АА
Аа
аа
0
1
6
9
41
0
21
1
0
90.10 7.33 ± 2.13
$\frac{{Gs\,4}}{{gs\,4}} \times \frac{V}{{v}}$ АА
Аа
аа
7
9
4
16
26
2
7
8
0
1.68 Независимая
$\frac{V}{{v}} \times \frac{{Sex\,1}}{{sex\,1}}$ АА
Аа
аа
4
2
1
12
29
9
4
13
5
2.77 Независимая
АА
Аа
аа
15
44
1
15
4
0
23.81 23.08 ± 5.31
$\frac{О}{о} \times \frac{{Amy\,1{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 7}}{{Amy\,1{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 6}}$ АА
Аа
аа
13
39
8
13
6
0
16.17 24.26 ± 5.40
$\frac{{Sex\,1}}{{sex\,1}} \times \frac{{Amy\,1{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 7}}{{Amy\,1{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 6}}$ АА
Аа
аа
7
44
9
0
6
13
19.69 18.90 ± 4.89
$\frac{{Gs\,4}}{{gs\,4}} \times \frac{{Amy\,1{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 7}}{{Amy\,1{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 6}}$ АА
Аа
аа
17
37
6
13
6
0
11.79 29.37 ± 5.98
$\frac{V}{{v}} \times \frac{{Amy\,1{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 7}}{{Amy\,1{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 6}}$ АА
Аа
аа
14
35
11
6
9
4
0.11 Независимая
Рис. 2.

Карта сцепления пяти локусов хромосомы 6 (=6H) ячменя.

Зерно, предназначенное для электрофоретического анализа α-амилазы, проращивали в темноте при 20°С в течение 5–7 суток. Для экстракции фермента проросшую зерновку освобождали от пленок, помещали в толстостенную стеклянную пробирку, заливали раствором 0.2%-ного хлористого кальция с 20%-ной сахарозой и 0.03%-ного бромфенолового синего. После измельчения эндосперма палочкой из стекла или нержавеющей стали, суспензию настаивали 1 ч при комнатной температуре. После центрифугирования надосадочную жидкость использовали для электрофореза. Электрофоретическое разделение α-амилаз и выявление его изоферментного состава проводили по прописи В.П. Нецветаева [5]. С целью инактивации β-амилазы в гель вводили 5 М мочевины.

Для оценки сцепления использовали χ2-тест [11]. Величину рекомбинацию определяли методом максимального правдоподобия [12].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Типы изоферментов амилаз, контролируемых локусами Amy 1 и Amy 2 иллюстрирует рис. 1. Здесь приведены зимограммы этого энзима некоторых сортов ячменя. Как видно, зона изоферментов с медленной подвижностью контролируется локусом Amy 1, а синтез более подвижных энзимов обусловлен локусом Amy 2. Результаты по локализации Amy 2 в хромосоме 1 (=7H) представлены ранее [6].

На рис. 3 приведены зимограммы родителей и потомства F2 комбинации скрещивания Risø М13 × r “e” + o. Как видно, различия между изоферментами AMY 1–6 и AMY 1–7, контролируемые локусом Amy 1, затрагивают только верхнюю часть спектра. Risø М13 не имеет активности в самой верней части зимограммы. Напротив, у родителя r “e” + o в этой части спектра наблюдается энзиматическая активность (отмечено стрелкой).

Рис. 3.

Зимограммы α-амилаз зерна гибридов F2M13 × r “e” + o. М13 имеет зимограмму, подобную представленной на дорожке 4 (AMY 1–6), второй родитель – как на дорожке 3 (AMY 1–7). Стрелкой отмечен изоэнзим AMY 1, по которому наблюдалось различие.

Результаты расщепления потомства F2 (тестирование по F3) комбинации Risø М13 × r “e” + o и оценка сцепления между генами, по которым отличались родители, представлены в табл. 1. Как видно, гены хромосомы 6 (=6H) обнаружили между собой сцепление. С другой стороны, локус V (=Vrs1) двурядный колос, v (=vrs1) шестирядный колос находятся в хромосоме 2 (=2H) и, соответственно, показано независимое наследование со всеми генами хромосомы 6.

На основе полученных данных можно составить карту сцепления пяти изученных генов хромосомы 6 (рис. 2). Следует отметить, что порядок расположения исследуемых генов не совпадает с генетической картой этой хромосомы ячменя, представленной ранее [8, 9].

Из показанных на рис. 3 генов, фактор Oo подвергался телотрисомному анализу. В результате было установлено, что ген o (оранжевая окраска цветковой чешуи) находится в коротком плече хромосомы 6 [13]. В дальнейшем D. Falk [14, 15], пользуясь этим же методом, подтвердил положение локуса o в коротком плече хромосомы 6 и установил, что ген sex 1 находится проксимально, в длинном плече этой хромосомы. Следовательно, центромера ориентирована между генами o и Sex 1. Положение других представленных здесь генов этой хромосомы с помощью телотрисомного анализа по плечам не исследовано. На обобщенных картах сцепления этой хромосомы [8, 9] локусы e”, gs 4, Sex 1 расположены в длинном плече хромосомы 6. В частности R. Yoshimi и T. Konishi [16] при картировании локусов Aat и l9 относительно гена о отнесли его положение к длинному плечу хромосомы 6 проксимально. Они не учли более ранних сообщений [1315] о переносе положения гена о в короткое плечо этой хромосомы около центромеры. Соответственно в последнем описании этих генов и хромосомном положении их на картах сцепления указано длинное плечо хромосомы 6 (6L) [10].

К настоящему времени имеются достаточно подробные карты сцепления хромосомы 6 ячменя [17, 18]. К сожалению они охватывают только ДНК-маркеры, но не включают гены, отвечающие за морфологические признаки растений ячменя. В то же время следует отметить, что местоположение локуса Amy 1 относительно этих маркеров на хромосоме 6 указано. Так, по данным Х. Qi с соавт. [17] Amy 1 занимает положение в 84.9 сМ на карте хромосомы 6, но плечо не указано. P. Langridge с соавт. [18] отметили положение центромеры на этой хромосоме и показали, что локус Amy 1 находится на расстоянии в 19.6 сМ от центромеры в длинном плече хромосомы 6. При использовании картирующей функции D. Kozambi [19] оценка расстояния между генами Sex 1 и Amy 1 в нашем случае составила 20.00 ± 5.71 сМ. Если рассчитывать это расстояние на основе картирующей функции N. Bailey [20], оно будет равно 23.5 ± 7.86 сМ. Следовательно, учитывая ошибку оценки дистанции, в обоих случаях очевидно, что данные P. Langridge с соавт. [18] близки к нашим результатам. Тогда наиболее вероятно, что ген Sex 1 действительно может находиться в длинном плече вблизи центромеры хромосомы 6; это не противоречит приведенным выше данным, а также подтверждает сведения D. Falk [14, 15]. Расположение локусов Aat и l9 в длинном плече хромосомы 6 согласуется с полученными нами данными, и укладывается в карту сцепления этих генов относительно локусов Amy 1 и o.

Таким образом, на основе учета данных по величинам рекомбинации R. Yoshimi и T. Konishi [16] наиболее вероятен следующий порядок расположения представленных локусов: 6So– cen – Sex 1 – Amy 1 – Aat – l9 – 6L. Это допустимо при условии нахождения сегмента Aat – l9 в длинном плече хромосомы 6. К сожалению для картирования этого участка хромосомы недостаточно одного маркерного гена o, который использовали R. Yoshimi и T. Konishi [16].

При обобщении полученных нами результатов и представленных литературных данных наиболее вероятное расположение изученных нами генов относительно друг друга и по плечам на хромосоме 6 иллюстрирует рис. 2. Таким образом, на основе пятиточечного теста установлен порядок расположения пяти локусов в хромосоме 6 (=6H) ячменя: 6S – re” (=raw 5) – gs 4 (=gsh 4) – o (=rob 1) – cen – Sex 1 – Amy 1 – 6L.

Представленные данные свидетельствуют о необходимости корректировки генетической карты сцепления хромосомы 6 (=6H) ячменя. Эти изменения затрагивают четыре локуса, контролирующих морфологические признаки ячменя.

Работа выполнена по Госзаданию: № 007-00489-18-00.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Schwimmer S. The malt amylases // Brewers Digest. 1951. V. 26. P. 47–52.

  2. Harris G. The enzyme content and enzymatic transformation of malt // Barley and Malt / Ed. Cook A.H. N.Y., London, 1962. P. 583–894.

  3. Frydenberg O., NielsenG. Amylase isozymes in germinating barley seeds // Hereditas. 1966. V. 54. № 8. P. 123–139.

  4. Brown A.H.D., Jacobsen J.V. Genetic basis and natural variation of α-amylase isozymes in barley // Genet. Res. Cambr. 1982. V. 40. P. 315–324. https://doi.org/10.1017/S0016672300019182

  5. Нецветаев В.П. Расположение β-амилазного локуса (Bmy 1) в хромосоме 4 ячменя // Цитология и генетика. 1993. Т. 27. № 5. С. 74–78.

  6. Netsvetaev V.P. Chromosomal location of loci Estl2 and Amy2 in barley // Barley Genet. Newsletter. 1993. V. 22. P. 42–43.

  7. Nielsen G., Frydenberg O. Linkage between the loci Amy 1 (α-amylase), o (orange lemma) and xn (xanta seedling) // Barley Genet. Newsletter. 1974. V. 4. P. 53–54.

  8. Søgaard B., Von Wettstein-Knowless P. Barley: Genes and chromosomes // Carlberg Res. Communications. 1987. V. 52. № 2. P. 123–196.

  9. Tsuchiya T. Linkage maps of barley // Barley Genet. Newsletter. 1984. V. 14. P. 81–84.

  10. Franckowiak J.D., Lundqvist U. Descriptions of barley genetic stocks tables 2 and 3 (2018) // Barley Genet. Newsletter. 2018. V. 48. P. 13–189.

  11. Рокицкий П.Ф. Введение в статистическую генетику. Минск: Вышейшая школа, 1974. 442 с.

  12. Allard R.W. Formulas and tables to facilitate the calculation of recombination values in heredity // Hilgardia. 1956. V. 24. № 10. P. 235–278.

  13. Shahla A., Shim J.W., Tsuchiya T. Association of the gene o for orange lemma with the short arm of chromosome 6 (6S) in barley // Barley Genet. Newsletter. 1983. V. 13. P. 83–84.

  14. Falk D.E. Creation of a marked telo 6S trisomic for chromosome 6 // Barley Genet. Newsletter. 1993. V. 23. P. 32.

  15. Falk D.E. Coordinator’s report: Chromosome 6 // Barley Genet. Newsletter. 1993. V. 23. P. 154.

  16. Yoshimi R., Konishi T. Linkage analysis of several isozime loci in barley // Barley Genet. Newsletter. 1994. V. 24. P. 35–37.

  17. Qi X., Stam P., Lindhout P. Comparison and integration of four barley genetic maps // Genome. 1996. V. 39. P. 379–394. https://doi.org/10.1139/g96-049

  18. Langridge P., Karakousis A., Collins N. et al. A consensus linkage map of barley // Mol. Breeding. 1995. V. 1. P. 389–395.

  19. Kozambi D. The estimation of map distances from recombination values // Ann. Eugen. 1944. V. 12. P. 172–175.

  20. Bailey N.T.J. Introduction to the Mathematical Theory of Linkage. Oxford: Univ. Press, 1961. 56 p.

Дополнительные материалы отсутствуют.