1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 57, № 3, 2021

Генетика, 2021, T. 57, № 3, стр. 280-295

Вариабельность и экспрессия паралогов фитоинсинтазы (PSY) у видов перца клады Annuum

М. А. Филюшин 1, *, Е. А. Дьяченко 1, Г. И. Ефремов 1, Е. З. Кочиева 1, А. В. Щенникова 1

1 Институт биоинженерии, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия

* E-mail: michel7753@mail.ru

Поступила в редакцию 08.04.2020
После доработки 04.06.2020
Принята к публикации 08.07.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

В настоящем исследовании у пяти образцов трех видов перца (Capsicum annuum, C. chinense и C. frutescens), различающихся паттерном пигментации плода, идентифицированы гомологи генов PSY1 и PSY2, кодирующих ключевой фермент каротиногенеза – фитоинсинтазу. Внутри исследуемой группы перцев определена вариабельность геномных последовательностей PSY1 и PSY2 и кДНК. Последовательности белков PSY1 и PSY2 были сходны (82%) и различались N- и C-концевыми инделями NAGLRYSD и KLTSSSL, а также консервативными мотивами, характерными для групп гомологов PSY2 и PSY1. Экспрессия генов PSY1 и PSY2 проанализирована в листьях, чашелистиках, лепестках, завязи, а также в кожице и мякоти плодов в процессе созревания у анализируемых образцов перца. Показан максимальный уровень экспрессии PSY1 в лепестках, а также в перикарпе зрелых плодов образцов C. annuum и C. frutescens. У образца C. chinense Pimenta da Neyde ген PSY1 экспрессировался только в листьях. Транскрипты PSY2 обнаружены во всех анализируемых органах образцов перца, максимальный уровень – в листьях, минимальный – в перикарпе плодов. Полученные данные предполагают сохранение у видов перца гомологами PSY1 и PSY2 консервативных ключевых функций в синтезе каротиноидов в плодах (PSY1) и фотосинтезирующих тканях (PSY2).

Ключевые слова: фитоинсинтаза, PSY1, PSY2, Capsicum, виды перца, окраска плода.

Растения, за редким исключением, являются фотосинтезирующими организмами и для поглощения и преобразования световой энергии используют пигменты – хлорофиллы и каротиноиды, при этом каротиноиды задействованы также для защиты молекул хлорофилла от фотоокисления [1]. Более того, каротиноиды являются предшественниками фитогормонов (абсцизовой кислоты и стриголактонов), а их производные могут действовать как сигнальные молекулы в процессах развития растений и в ответ на воздействия окружающей среды [2–4]. Также растения используют каротиноиды как оптические сигналы при взаимодействии с насекомыми и другими животными, пигментируя цветковые органы и/или плоды [4].

Механизм биосинтеза каротиноидов консервативен, однако по мере эволюции растений к общей специализации данных пигментов добавлялись новые функции. Так, увеличение фотосинтезирующей поверхности при образовании плоского листа из радиально-симметричного стебля повысило необходимость фотозащиты [1]. Появление репродуктивных органов добавило необходимость окраски лепестков и тычинок для привлечения опылителей [5]. Преобразование сухого плода в сочный и окрашенный сделало его привлекательным для животных, что дало растениям большие возможности в распространении семян [6]. Такая многофункциональность продуктов каротиногенеза является следствием эволюционной дупликациии последующей диверсификации генов биосинтеза каротиноидов. Прежде всего это касается гена-предшественника фитоинсинтаз PSY (phytoene synthase), чьи продукты играют ключевую роль в инициации синтеза каротиноидов в различных органах растения [7, 8].

Фитоинсинтаза PSY локализуется в строме пластид и катализирует образование 15-цис-изомера фитоина, предшественника всех каротиноидов [7, 9]. Несколько последующих стадий приводят к синтезу ликопина, который в дальнейшем используется для синтеза α-каротина и β-каротина (оранжевый пигмент). В свою очередь, α-каротин и β-каротин могут превращаться в желтые пигменты лютеин и ксантофиллы [9, 10].

У растений описано от одного до трех паралогов PSY. Геном злаковых (Poaceae) и некоторых других видов однодольных содержит три гена PSY [11]. Двудольные виды в этом плане более разнообразны. К примеру, в геноме Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. присутствует только один ген PSY [12]. Для других двудольных описано, как минимум, два гена фитоинсинтазы. В то же время геном люцерны и томата содержит три гена PSY [3, 13].

Первый идентифицированный ген фитоинсинтазы растений, PSY1, специфичен в основном для хромопластов и задействован в пигментации сочного плода при его созревании [14]. При отсутствии транскрипции PSY1 не происходит синтеза каротиноидов в плодах, а суперэкспрессия PSY1 значительно увеличивает каротиногенез в запасающих органах (клубнях картофеля, плодах томата и т.д.) [15, 16]. Второй ген PSY2 специфичен, прежде всего, для хлоропластов и его экспрессия максимальна в фотосинтезирующей ткани [17]. Третий паралог, PSY3, идентифицирован не у всех видов. У томата, люцерны и зерновых PSY3 активен в корнях в ответ на стресс, индуцирует синтез апокаротиноидов (окисленных производных каротиноидов), участвующих в формировании симбиотических и паразитарных отношений, а также в адаптации к дефициту некоторых пищевых элементов [3, 18].

Белки PSY1 и PSY2 высоко гомологичны, однако различаются по биохимическим свойствам [7, 19]. Тем не менее нельзя говорить об их строгой тканеспецифичности: оба гена транскрибируются в одинаковых тканях, но значительно различаются (до 100 раз) уровнями транскрипции [3]. Это обусловлено тем, что эффективность PSY1 в каротиногенезе ниже, чем PSY2, поэтому для синтеза большого количества каротиноидов в плодах необходим более высокий уровень транскрипции PSY1 [20].

Наиболее удобной и изученной моделью для исследования созревания сочных плодов, включая синтез вторичных метаболитов и вероятную эволюцию соответствующих генетических механизмов, считаются виды и сорта томата (секция Lycopersicon рода Solanum) [21]. Виды томата формируют цветки с желтыми лепестками, но различаются окраской зрелых плодов [22]. У томата овощного S. lycopersicum L. оба гена, PSY1 и PSY2, задействованы в определении окраски лепестков [7]. Это свидетельствует об изначально общей роли PSY1 и PSY2 в окраске лепестков и о более раннем происхождении PSY2 по отношению к PSY1, с приобретением PSY1 позднее новой функции – пигментация плодов [23]. Теоретически полученные знания могут быть применены к другим формирующим сочные плоды культурам.

Род Capsicum (Solanaceae) включает более 35 видов, объединенных по морфофизиологическим признакам в несколько филогенетических клад. Виды C. annuum L., C. chinense Jacq., C. frutescens L. (клада Annuum) и C. baccatum L. (клада Baccatum) были доместицированы [24, 25]. Перец формирует сочный плод, окраска которого различается у видов и сортов [26]. Как и у томата, перикарп плодов перца по мере созревания проходит стадию замещения хлоропластов хромопластами, в которых и накапливаются синтезируемые каротиноиды [27]. На сегодняшний день у C. annuum L. обнаружено два паралога гена фитоинсинтазы – PSY1 и PSY2 [28]. В отличие от томата, формирующего цветки с желтыми лепестками, цветки видов Capsicum имеют белую или антоциановую пигментацию, акаротиноидный путь в плодах Capsicum идет дальше синтеза ликопина и каротинов (обычных для плодов томата) и доходит до ксантофиллов β-каротинового пути, из которых под действием специфичного для видов Capsicum фермента капсантинка- псорубинсинтазы (CCS) образуются красные пигменты капсантин и капсорубин [26]. Состав каротиноидов в плодах перца значительно отличается от такового у томата и представлен в основном капсантином и капсорубином, а также β-каротином, β-криптоксантином, лютеином, зеаксантином, антраксантином и виолаксантином, различное сочетание и соотношение которых определяет многообразие оттенков окраски плодов [29]. Суммарное содержание каротиноидов в плодах перца значительно превышает их количество в плодах томата [26, 30]. Учитывая вышесказанное, можно предположить, что прямой перенос данных по каротиногенезу у видов томата на другие виды с сочными плодами, в частности перец, не совсем корректен и необходимы дополнительные уточняющие исследования.

Целью настоящей работы стала оценка вариабельности паралогов фитоинсинтазы у видов Capsicum клады Annuum. Для этого гены, гомологичные PSY1 и PSY2, были идентифицированы у видов перца Capsicum annuum L. (сорта Сибиряк, Сиреневый куб и Отелло), C. frutescens L. (сорт Самоцвет) и C. chinense Jacq. (сорт Pimenta da Neyde). Была охарактеризована структура и филогения идентифицированных генов и определен профиль их экспрессии в листьях, чашелистиках, лепестках, завязи, а также в кожице и мякоти плодав процессе созревания, а также возможные корреляции уровня экспрессии PSY1 и PSY2 с содержанием каротиноидов в плоде в процессе созревания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В работе были использованы образцы трех родственных видов перца, формирующих кладу Annuum: C. annuum (сорта Сибиряк, Сиреневый куб и Отелло), C. frutescens (сорт Самоцвет) и C. chinense (сорт Pimenta da Neyde) (рис. 1). Растения были выращены в пленочной теплице в Федеральном научном центре овощеводства (Московская область). Набор тканевых препаратов для каждого анализируемого образца включал молодые листья, чашелистики, лепестки, завязь, а также кожицу и мякоть плода на трех стадиях созревания: незрелый плод финального размера (MF, mature fruit); бланжевый плод (IR, intermediate ripe; соответствует переходу к зрелости с постепенной сменой окраски); плод биологической спелости (RF, ripe fruit). Выбранные для работы сорта представляют два основных паттерна изменения окраски плода в процессе созревания у видов перца комплекса Annuum. Для сорта Сибиряк (C. annuum) последовательность изменения окраски следующая: зеленая (стадия MF), мозаичная зелено-красная (стадия IR), глубокая красная (стадия RF). Для сортов Отелло и Сиреневый куб (C. annuum) – это фиолетовая (стадия MF), красная/фиолетово-красная (стадия IR), глубокая красная (стадия RF). Для вида C. frutescens (Самоцвет): фиолетовая (стадия MF), бледно-желтая (стадия IR) и красная (стадия RF). Образец C. chinense (Pimenta da Neyde) формировал плоды фиолетовые на всех стадиях развития, при этом стадия биологической спелости (RF) у данного сорта не выражена, поэтому были взяты только плоды стадий MF и IR (рис. 1). Индивидуальные ткани растений каждого образца собирали одновременно, измельчали в жидком азоте и хранили при –80°С.

Рис. 1.

Плоды анализируемых сортов перца: а – Сибиряк (C. annuum), б – Сиреневый куб (C. annuum), в – Отелло (C. annuum), г – Самоцвет (C. frutescens), д – Pimenta da Neyde (C. chinense). Цифрами обозначены стадии созревания плодов: 1 – незрелый плод финального размера (MF, mature fruit); 2 – бланжевый плод (IR, intermediate ripe; соответствует переходу к зрелости с постепенной сменой окраски); 3 – плод биологической спелости (RF, ripe fruit). Масштабная линия равна 1 см.

Таким образом, для характеристики межвидовой вариабельности генов фитоинсинтазы были взяты образцы перца с типичными для перцев паттернами пигментации плода и один сорт (Pimenta da Neyde) с аномальной каротиноидной пигментацией.

Биохимический анализ тканей анализируемых образцов перца. Содержание суммы каротиноидов в плодах исследуемых образцов перца определяли методом спектрофотометрии в хлороформ-метанольных экстрактах, согласно [31, 32], в двух биологических и трех технических повторах.

Идентификация гомологов генов PSY1 и PSY2. Из ткани листа каждого из пяти анализируемых образцов перца выделяли геномную ДНК методом СТАВ [33] и использовали (100 нг) в качестве матрицы для амплификации ДНК-последовательностей, гомологичных PSY1 и PSY2. Праймеры для амплификации и секвенирования фрагментов полноразмерных генов разрабатывали на основе доступных в базе данных NCBI полногеномных последовательностей C. annuum PSY1 (LOC107868281 bifunctional 15-cis-phytoene synthase, chromoplastic, Gene ID: 107868281) и PSY2 (LOC107859651 phytoene synthase 2, chloroplastic, Gene ID: 107859651) (табл. 1). Использовали праймеры CaPSYF/R и следующие условия ПЦР: исходная денатурация (94°C 10 мин); 36 циклов денатурации (94°C 40 с), отжига (56°C 40 с) и синтеза (65°C 4 мин); финальное достраивание фрагментов (65°C 7 мин). Гены амплифицировали с использованием полимеразы LongAmp® Hot Start Taq DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, США) и термоциклера C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, США). ПЦР-продукты ожидаемой длины очищали с помощью QIAEX® II Gel Extractionkit (QIAGEN, Hilden, Германия), клонировали в вектор pGEM®-T Easy (Promega, Madison, WI, США) и секвенировали (2–4 клона для каждого образца) на ABI Prism 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Waltham, MA, США).

Таблица 1.

Список использованных в работе праймеров

Ген Праймер Последовательность (5' → 3') Назначение
PSY1 CaPSY1F TCAGAATGTCTGTTGCCTTG Амплификация, секвенирование
CaPSY1ex3F ATGGTGCAGGAGAACAGAC
CaPSY1ex3R AACTGTGTCGGACAAAGCAG
CaPSY1ex5R CATCTACTAGCTGCGCTCAA
CaPSY1ex5F TTAGCACAGGCAGGTCTATC
CaPSY1R TCCTGATTTCATGTTCTTGTAGA
CaPSY1ex1R ACATCATATACCATCYGTTC
PSY2 CaPSY2F AGCATGTCTGTTGCTTTGTTG
CaPSY2ex3F CTGATGAGCTTGTTGATGGC
CaPSY2ex3R AATCTGGAAACGGTATCGG
CaPSY2ex4F CTCTATTGTTACTATGTCGCTG
CaPSY2ex5R AATCCTCCACTTATCAGTCAC
CaPSY2R CTTCATTCATGTCTTTGYTAGTG
CaPSY2ex1R CAACACCACATCATACACC
PSY1 PSY1-F
PSY1-R		 GTGAAGAGACAGCTGAGATCG
TCTCCGGAGTCATTAGCATCG 		РВ-ПЦР
PSY2 PSY2-F
PSY2-R		 AAGGAGTCGCAGAACTGAGC
GTCGTTCGCTTCAATCTCATCTAA
Actin7 Actin7-F
Actin7-R		 CATTGTGCTCAGTGGTGGTTC
TCTGCTGGAAGGTGCTAAGTG

Структурный анализ гомологов генов PSY1 и PSY2 и кодируемых ими белков. Анализ и выравнивание полученных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы MEGA 7.0 (https://www.megasoftware.net/) в сравнении с известными последовательностями C. annuum PSY1 (Gene ID: 107868281) и PSY2 (Gene ID: 107859651), а также с S. lycopersicum PSY1 (Gene ID: 543988) и PSY2 (Gene ID: 543964). Кроме того, был проведен биоинформационный поиск гомологичных генов в секвенированных геномах видов перца C. baccatum и C. chinense, обнаруженные последовательности были использованы в сравнительном структурном анализе. Положение нуклеотидных и аминокислотных замен определяли внутри группы Capsicum и относительно S. lycopersicum PSY1 и PSY2. Консервативные домены и мотивы в кодируемых белках определяли с помощью программ NCBI-CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) и MEME 5.1.1 (http://meme-suite.org/tools/meme). Влияние аминокислотных замен на структуру и функции белков предсказывали с помощью программы PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php). Структуру белков анализировали с использованием программы Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index). Молекулярную массу и значение изоэлектрической точки (pI) определяли с помощью программы Isoelectric Point Calculator (http://isoelectric.org/).

Филогения генов PSY1 и PSY2. Для филогенетического анализа эволюционных отношений, как идентифицированных генов, так и видов перца, использовали известные последовательности генов, кДНК и белков PSY томата S. lycopersicum (PSY1, Gene ID: 543988; CDS ID: EU021055.1 (cv. Red Setter) и EF157835.1; PSY2, Gene ID: 107859651; CDS ID: EU021055.1 (cv. Red Setter)) и видов перца C. annuum cv. Zunla-1 (PSY1, NC_029980.1:c205334820–205328571; PSY2, NC_029978.1:142877052–142881261), C. annuum cv. Valencia (PSY1, GU085273.1), C. baccatum isolate PBC81 (PSY1, CM008446.1:19444825–19449400; PSY2, CM008444.1:141318038–141337266) и C. chinense isolate PI159236 (PSY1, CM008434.1:12099868–12105776; PSY2, CM008432.1:150147614–150156089). Анализ проводили с помощью метода ближайших соседей (NJ; модель подбирали в программе Modeltest) пакета программ MEGA 7.0.

Профиль ко-экспрессии гомологов генов PSY1 и PSY2. Препараты суммарной РНК выделяли из отобранного растительного материала, очищали от примесей ДНК и использовали для синтеза первой цепи кДНК (наборы RNeasy Plant Mini Kit и RNase free DNasy set; QIAGEN, Германия; GoScriptтм Reverse Transcription System (Promega, США).

Профиль экспрессии PSY1 и PSY2 определяли методом количественной ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) c использованием набора “Реакционная смесь для проведения РВ-ПЦР в присутствии SYBR GreenI и ROX” (ООО “Синтол”, Россия) и термоциклера CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США). Праймеры для РВ-ПЦР были разработаны ранее, на основе доступных в базе данных NCBI последовательностей мРНК C. annuum PSY1 (X68017) и PSY2 (XM_016704726.1) [34] (табл. 1). Для нормализации уровня транскрипции генов использовали экспрессию референсного гена Actin7 [35]. Реакции проводили в трех технических повторах в следующих условиях: 95°C – 5 мин; 40 циклов (95°C – 15 с, 62°C – 50 с). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Graph Pad Prism v. 7.02 (https://www.graphpad.com).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация и анализ структуры гомологов PSY1 и PSY2 у образцов трех видов перца

У образцов видов перца C. annuum (сорта Сибиряк, Сиреневый куб и Отелло), C. frutescens (сорт Самоцвет) и C. chinense (сорт Pimenta da Neyde) были определены геномные последовательности генов PSY1 и PSY2, гомологичные известным генам PSY1 и PSY2 C. annuum (NC_029980.1; NC_029978.1). Последовательности были идентифицированы, начиная с ATG-кодона, без нетранслируемых областей 5'- и 3'-UTR, где у PSY1 и PSY2 S. lycopersicum находятся нетранслируемые экзоны. Основные характеристики полученных генов приведены в табл. 2.

Таблица 2.

Характеристики гомологов генов PSY1 и PSY2 у видов и сортов Capsicum в сравнении с S. lycopersicum

Образец перца Ген NCBI ID Длина экзона/интрона, пн Ген, пн кДНК, пн Белок, а.о. MW/pI
I II III IV V VI
C. annuum сорт Сибиряк PSY1 MT313932 448/96 51/261 173/328 236/250 193/649 159 2844 1260 419 47.140/8.25
PSY2 MT313937 466/101 51/744 173/193 236/219 193/429 180 2985 1299 432 48.535/8.53
C. annuum сорт Сиреневый куб PSY1 MT313933 448/96 51/261 173/328 236/291 193/649 159 2885 1260 419 47.066/8.14
PSY2 MT313938 466/101 51/744 173/193 236/219 193/429 180 2985 1299 432 48.430/8.60
C. annuum сорт Отелло PSY1 MT313934 448/96 51/261 173/328 236/250 193/649 159 2844 1260 419 47.094/8.25
PSY2 MT313939 466/101 51/744 173/193 236/219 193/429 180 2985 1299 432 48.405/8.43
C. frutescens сорт Самоцвет PSY1 MT313935 448/96 51/261 173/328 236/250 193/649 159 2844 1260 419 47.126/8.25
PSY2 MT313940 466/101 51/744 173/193 236/219 193/429 180 2985 1299 432 48.434/8.60
C. chinense сорт Pimenta da Neyde PSY1 MT313936 448/96 51/261 173/328 236/291 193/649 159 2885 1260 419 47.052/8.14
PSY2 MT313941 466/101 51/753 173/193 236/219 193/433 180 2998 1299 432 48.362/8.43
S. lycopersicum сорт Red Setter* PSY1 EF534740.1 412/120 51/423 173/313 236/518 193/689 174 3302 1239 413 46.615/8.10
PSY2 EU021055.1 484/107 51/710 173/267 242/227 193/398 180 3032 1317 438 49.326/8.05

Примечение. MW – молекулярная масса белков, кДа; pI – изоэлектрическая точка. * Последовательности из базы NCBI.

Длина генов PSY1, содержащих шесть экзонов, составила 2844 пн (C. annuum cv. Сибиряк и Отелло; C. frutescens cv. Самоцвет) и 2885 пн (C. chinense cv. Pimenta da Neyde; C. annuum cv. Сиреневый куб) (табл. 2). Разница в размере генов была обусловлена присутствием вставки 41 пн в интроне IV. Интересно, что в отличие от Pimenta da Neyde в известной последовательности PSY1 образца C. chinense (CM008434.1:12099868–12105776) такой вставки нет. Последовательность PSY1 у C. baccatum (CM008446.1:19444825–19449400) имела длину 2846 пн, а у S. lycopersicum (EF157835.1) – 3302 пн (от ATG до стоп-кодона).

Длина гомологов PSY2 у исследуемых видов/сортов перца составила 2985 пн, за исключением C. chinense cv. Pimenta da Neyde (2998 пн, за счет двух вставок – 9 и 4 пн в интронах II и V). У вида C. baccatum длина гена PSY2 составляла 2994 пн (CM008444.1:141318038–141337266), а у S. lycopersicum – 3032 пн (EU021055.1). Аналогично PSY1 ген PSY2 содержит шесть экзонов, размеры которых идентичны у анализируемых образцов перца.

В сравнении с PSY1 и PSY2 S. lycopersicum в последовательностях PSY1 и PSY2 исследуемых образцов Capsicum было обнаружено 955 и 847 мононуклеотидных вариабельных сайтов SNPs (28.24 и 27.09% от выровненных длин), из которых только 128 (13.40%) и 97 (11.45%) были локализованы в кодирующей последовательности. Между собой геномные последовательности PSY1/PSY2 образцов перца различались числом SNPs: 75 (2.60%)/51 (1.70%), больше трети которых находились в кДНК (24 (32.00%)/19 (37.25%)). При этом большая часть SNPs была локализована в экзоне I: 16 (66.70% всех экзонных замен) у PSY1 и 14 (73.70%) у PSY2.

Размер кДНК PSY1 и PSY2 у всех исследуемых образцов перца составил 1260 и 1299 пн соответственно (табл. 2). Различие в размере кДНК двух паралогов PSY обусловлено большей длиной экзонов I и VI гена PSY2.

Длина белков PSY1 и PSY2 была инвариантна у всех исследуемых образцов клады Annuum и составила 419 и 432 а.о. соответственно (табл. 2; рис. 1 и 2 в Приложении) и отличалась от последовательностей генов фитоинсинтазы C. baccatum (клада Baccatum) четырьмя (D194G, R91Q, C/Y59W, G/A40V – PSY1) и одним (V15F – PSY2) замещениями а.о. (рис. 2), которые, тем не менее, имели нейтральный характер (согласно PROVEAN). В последовательности PSY1 сорта Отелло обнаружено всего одно замещение а.о., которое внутри группы анализируемых образцов может иметь радикальный характер (согласно PROVEAN) – M207V. В последовательности PSY2 сортов Сиреневый куб и Pimenta da Neyde также было обнаружено по одному предположительно радикальному замещению а.о. – S136I и N186T соответственно.

Рис. 2.

Замещения аминокислотных остатков в последовательностях гомологов PSY1 и PSY2 у видов Capsicum в сравнении друг с другом и с референсными последовательностями PSY1 и PSY2 S. lycopersicum.

В сравнении с PSY1 томата все идентифицированные гомологи PSY1 Capsicum имели вставку R53InsQ64 (RWSFGSCLGGAQ) и делецию на С‑конце A408_R412del (ASLQR). В последовательности PSY2 Capsicum, в сравнении с гомологичным белком S. lycopersicum, выявлена делеция L32_F37del (LESSRF) (рис. 2). Анализ инделей в программе PROVEAN показал, что они носят нейтральный характер и не должны существенно изменить конформацию и функцию белка.

Несколько радикальных замещений а.о. было обнаружены при сравнении PSY1 и PSY2 перца с соответствующими белками S. lycopersicum (S. lycopersicum vs. Capsicum spp.): Q79R, P106K, G125S, M195V и W357L – для PSY1 и G71D/G, S142I, N192T и D335G – для PSY2 (рис. 2).

В целом идентифицированные последовательности перца PSY1 и PSY2 были высоко гомологичны (идентичность 82%). Главным отличием PSY2 от PSY1 стало присутствие вставок на N- и C‑конце белка: NAGLRYSD (в положении 58–65 а.о.) и KLTSSSL (в положении 423–429 а.о.).

Дополнительно с использованием МЕМЕ 5.1.1 был проведен анализ возможных консервативных мотивов, специфичных для белков PSY1 и PSY2 (рис. 3). Всего было выявлено 14 достоверных мотивов, 11 из которых были общими для всех последовательностей. Были выявлены мотивы 10 и 13, характерные для клады PSY2, и мотив 11, характерный для клады PSY1. Отсутствие мотива 11 в последовательности PSY1 S. lycopersicum было обусловлено отсутствием специфичной для Capsicum вставки R53InsQ64, о которой упоминалось выше.

Рис. 3.

Схема консервативных мотивов, характерных для клад PSY1 и PSY2 Capsicum и S. lycopersicum (МЕМЕ 5.1.1). Для анализа использованы последовательности идентифицированных в данной работе фитоинсинтаз PSY1 и PSY2 сортов Самоцвет (C. frutescens), Отелло (C. annuum) и Pimenta da Neyde (C. chinense), а также видов C. baccatum (CM009446.1; CM08444.1) и S. lycopersicum (EF534740.1; EU021055.1).

Согласно результатам анализа в программе NCBI-CDD все анализируемые белки перца PSY1 (c 75 по 405 а.о.) и PSY2 (с 92 по 430 а.о.) содержат консервативный домен фитоинсинтазы. Это подтверждает принадлежность идентифицированных гомологов PSY1 и PSY2 к ферментам биосинтеза изопреноидов (Isoprenoid Biosynthesis enzymes, Class 1), входящим в суперсемейство синтаз и терпеновых циклаз (trans-isoprenyl diphosphate synthases IPPS and class I terpene cyclases).

Проведенный анализ структуры гомологов PSY1 и PSY2 в программе Phyre2 позволил предсказать возможную трехмерную структуру данных белков. С достоверностью >90% моделированы 68% (PSY1) и 67% (PSY2) аминокислотных остатков с использованием четырех структурных матриц: c4hd1A_ (129–390/135–396 а.о., 62/60%-ное покрытие; squalene synthase HpnC, Alicyclobacillus acidocaldarius); c5iysA_ (126–412/132–419 а.о., 68/66%; phytoene synthase, Enterococcus hirae dehydrosqualene synthase); c3we9A_ (126–405/131–411 а.о., 66/64%; YisP, Bacillus subtilis); c2zcpA_ (3W7F; 126–411/132–418 а.о., 68/66%; c(30) carotenoid dehydrosqualene synthase CrtM, Staphylococcus aureus) [36]. Оставшиеся 143 а.о. (в основном на N-конце) были моделированы ab initio. Было выявлено, что фолдинг PSY-белков имеет преимущественно спиральный характер (60–63%), 2% последовательности приходится на β-складки, а структура 26% неупорядочена. Гомологи обоих фитоинсинтаз имели большую центральную полость, наблюдаемую и в других изопреноидных синтазах, использующих данную полость для пристраивания туда продукта [36]. Единичные случаи обнаруженных нами радикальных миссенс-мутаций (PSY1, Отелло; PSY2, Сиреневый куб и Pimenta da Neyde) никак не влияли на фолдинг и активные центры белков.

Филогенетический анализ

Для оценки филогении исследуемых сортов и видов перца был проведен кластерный анализ и построены дендрограммы на основе полногеномных, кодирующих и белковых последовательностей идентифицированных гомологов PSY1 и PSY2. Для сравнения в анализе были использованы известные последовательности гомологов PSY1 и PSY2 томата S. lycopersicum, а также гомологичные последовательности видов перца C. annuum, C. chinense и C. baccatum из базы данных NCBI.

Все три полученные дендрограммы были конгруэнтны и группировали образцы в два больших кластера, объединяющих последовательности гомологов PSY1 и PSY2 (рис. 4). Внутри каждого кластера последовательности S. lycopersicum формировали сестринскую ветвь кладе Capsicum. Клады PSY1 и PSY2 Capsicum организовывались сходным образом: последовательности C. annuum, C. chinense и C. frutescens формировали группу, сестринскую ветвь к которой образовывал образец C. baccatum (рис. 4).

Рис. 4.

Филогенетический анализ полногеномных последовательностей гомологов PSY1 и PSY2 томата S. lycopersicum и видов перца C. baccatum, C. annuum, C. frutescens и C. chinense (MEGA7.0, метод NJ, Tajima-Nei model, bootstrap 1000). Значения bootstrap для 1000 выборок показаны в основании ветви.

Профиль ко-экспрессии генов PSY1 и PSY2

Экспрессия генов PSY1 и PSY2 была впервые проанализирована в листьях, чашелистиках, лепестках, завязи, а также в кожице и мякоти плодов на трех стадиях (MF, IR, RF) созревания у образцов трех видов перца (рис. 5).

Рис. 5.

Относительная экспрессия гена PSY1 (a) и PSY2 (б) в листьях (Л), чашелистиках (Ч), лепестках (ЛЕ), завязи (З), кожице (К) и мякоти (М) плодов на трех стадиях созревания (1 – незрелый плод финального размера (MF), 2 – бланжевый плод (IR), 3 – плод биологической спелости (RF)) образцов перца C. annuum (Сибиряк, Сиреневый куб, Отелло), C. frutescens (Самоцвет) и C. chinense (Pimenta da Neyde). Значения, не имеющие достоверного отличия (Pvalue > > 0.05): PSY1 – ЛЕ vs. М3 (Сибиряк, Сиреневый куб), К1 vs. М1 (Отелло); PSY2 – К2 vs. М2 и К2 vs. М3 (Сибиряк), М1 vs. К3, М1 vs. М3 и К3 vs. М3 (Сиреневый куб), М1 vs. М3 (Отелло), Л vs. З (Самоцвет).

У сортов Сибиряк, Отелло, Сиреневый куб (C. annuum) и Самоцвет (C. frutescens) транскрипты PSY1 были обнаружены во всех анализируемых органах, при этом уровни транскрипции значительно варьировали между разными органами одного образца и однотипными тканями разных образцов. Максимальные уровни экспрессии PSY1 были выявлены в лепестках (на сходном уровне), а также в перикарпе зрелых плодов (стадия 3, RF). И кожица, и мякоть плода данных сортов содержали лишь следовые количества транскриптов PSY1 на стадии 1 незрелого плода (MF) и характеризовались их резким ростом в зреющих плодах (стадии 2 и 3, IR и RF). Мякоть зрелого плода сорта Отелло имела самый высокий уровень транскрипции PSY1 (в 10 раз выше, чем у остальных образцов), однако в кожице уровень экспрессии PSY1 был сопоставим с таковой у других образцов перца (рис. 5).

В листьях анализируемых образцов перца экспрессия PSY1 была на уровне либо следовых количеств (у сортов Отелло и Сиреневый куб), либо достигала 0.06–0.08 (у сортов Самоцвет, Сибиряк и Pimenta da Neyde). В отличие от остальных образцов перца у сорта Pimenta da Neyde (C. chinense) экспрессия PSY1 выявлена исключительно в листьях (рис. 5).

Экспрессия гена PSY2 была выявлена во всех анализируемых органах всех пяти сортов перца (рис. 5). Как ожидалось, максимальный уровень транскрипции был выявлен в листьях и несколько ниже – в чашелистиках и завязи, а в кожице и мякоти плодов уровень экспрессии PSY2 был минимален. У сортов Сиреневый куб, Самоцвет и Pimenta da Neyde значительные количества транскриптов PSY2 были детектированы в лепестках, при этом у первых двух сортов уровни транскрипции были сопоставимы (0.017 и 0.019), а у сорта Pimenta da Neyde – ниже в 2 раза (0.009).

Следует отметить, что анализируемые образцы значительно различались по уровню экспрессии PSY2 в листьях. Так, самый высокий уровень транскрипции PSY2 в листьях был показан для сорта Сибиряк, тогда как остальные сорта имели в 2–4 раза меньшее количество транскриптов PSY2. В целом экспрессия PSY2 в листьях сортов C. annuum была выше, чем у C. chinense и C. frutescens (рис. 5). Интересно, что в чашелистиках (другой фотосинтезирующий орган) и завязи уровни экспрессии PSY2 также различались, но при этом не коррелировали с уровнями экспрессии в листьях (рис. 5).

Содержание пигментов в перикарпе плодов анализируемых образцов видов Capsicum; взаимосвязь содержания суммы каротиноидов и уровня экспрессии PSY

Содержание суммы каротиноидов было определено в перикарпе (кожице и мякоти) плодов в процессе созревания (три стадии: незрелый плод; бланжевая спелость; биологическая спелость) пяти образцов исследуемых видов перца (рис. 6).

Рис. 6.

Содержание суммы каротиноидов (мкг/г сырой массы) в кожице (К) и мякоти (М) плодов анализируемых сортов перца на трех стадиях созревания (1 – незрелый плод финального размера (MF), 2 – бланжевый плод (IR), 3 – плод биологической спелости (RF)).

Спелый плод образцов перца, за исключением сорта Pimenta da Neyde, характеризовался высоким содержанием каротиноидов в кожице (236–514 мкг/г сырой массы) и мякоти (121–723 мкг/г) (рис. 6). В спелых плодах Pimenta da Neyde были обнаружены только следовые количества каротиноидов (менее 2 мкг/г). Можно предположить, что красный спелый плод четырех анализируемых сортов содержит типичные для перцев красные пигменты – каротиноиды капсантин и капсорубин [8, 26], при этом принадлежность к определенному виду Capsicum (C. annuum или C. frutescence) никак не связана с количеством накапливаемых каротиноидов. В зрелом плоде сорта Pimenta da Neyde (C. chinense) пигментация исключает каротиноиды и формируется за счет антоцианов [37].

Полученные результаты сравнивали с профилем экспрессии гомологов гена PSY1, экспрессия которого характерна преимущественно для созревающих плодов. Было показано, что увеличение уровней транскрипции PSY1 в перикарпе плодов перца сопровождается увеличением содержания каротиноидов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Образцы перца, исследуемые в настоящей работе, представляют три близкородственных вида – C. annuum, C. chinense и C. frutescens, которые вместе составляют кладу Annuum [24, 25]. Самыми близкими к Annuum являются виды клады Baccatum, объединяющей C. baccatum, C. baccatum var. praetermissum (Heiser & P.G. Sm.) Hunz. и C. chacoense Hunz. [24]. Геном C. baccatum секвенирован, что дало нам возможность использовать в сравнительном структурном анализе последовательности PSY1 и PSY2 C. baccatum в качестве представителя другой клады перцев.

Для видов комплекса Annuum, кроме красной финальной окраски плода, характерны два паттерна изменения окраски плода в процессе созревания: от зеленого к красному (основной паттерн); от фиолетового к красному [24, 25]. Из взятых в анализ сортов первый паттерн характерен для сорта Сибиряк (C. annuum). Второй паттерн наблюдается у сортов Отелло и Сиреневый куб (C. annuum), Самоцвет (C. frutescens). У сорта Pimenta da Neyde окраска зрелого плода не меняется и остается фиолетовой (рис. 1), так как в кожице и мякоти не происходит накопления окрашенных каротиноидов. В результате в анализ были взяты четыре сорта с типичным для видов перца комплекса Annuum каротиноидным паттерном пигментации плода и один сорт с аномальной каротиноидной пигментацией.

Нами были идентифицированы гены PSY1 и PSY2 у пяти сортов перца видов клады Annuum. Сравнительный анализ выявил низкий уровень нуклеотидной вариабельности для гомологов каждого гена. Необычным оказалось то, что большая часть (>30%) выявленных SNPs была сконцентрирована в экзонах. Однако при этом какие-либо критичные структурные различия гомологов как между видами Annuum, так и в сравнении с C. baccatum отсутствовали. Последовательности генов не содержали никаких нонсенс-мутаций. При этом единичные случаи радикальных миссенс-мутаций (PSY1, Отелло; PSY2, Сиреневый куб и Pimente da Neyde) не влияли на фолдинг и активные центры белков (согласно Phyre2) и не входили в список мутаций, выявленных ранее при анализе 94 образцов перца и присутствие которых могло бы изменить активность фитоинсинтаз [38].

В целом идентифицированные последовательности перца PSY1 и PSY2 были высоко гомологичны (идентичность 82%), и основным отличием PSY1 от PSY2 стало отсутствие на его N- и С14-конце вставок 8 и 7 а.о. соответственно. Подобные различия характерны и для PSY-белков других видов растений. Так, ранее для фитоинсинтаз злаковых было предположено, что отсутствие/наличие таких вставок может коррелировать с локализацией белков в пластидах конкретного типа [18]. С другой стороны, данное мнение частично опровергается тем фактом, что PSY2 может компенсировать отсутствие PSY1 в плоде перца и, следовательно, PSY2 может работать не только в хлоропластах, но и в хромопластах [38, 39].

Выявленное высокое структурное сходство белков PSY1 и PSY2 у видов перца, в том числе у видов разных клад, предполагает, что и функции гомологов данных белков высоко консервативны среди сортов/видов перца. С достаточной степенью уверенности можно сказать, что по аналогии с тканеспецифичным каротиногенезом у томата S. lycopersicum идентифицированные нами гены перца могут определять биосинтез каротиноидов в созревающих плодах (гомологи PSY1), фотосинтезирующих тканях (гомологи PSY2) и лепестках (PSY1 и PSY2 совместно).

Различные сорта Capsicum классифицируются в основном по морфологическим характеристикам плода, в частности по его окраске, определяемой пигментами, главным образом присутствием и соотношением различных каротиноидов [29]. Динамика изменения окраски меняется по мере созревания плода, при этом синтез каротиноидов идет постоянно. До стадии MF окраска плода либо зеленая (хлоропласты преобладают и хлорофиллы маскируют присутствие каротиноидов), либо фиолетовая (помимо хлоропластов с хлорофиллом и каротиноидами в вакуолях накапливаются антоцианы). По мере созревания (стадии IR, RF) в образующихся хромопластах накапливается сложная смесь каротиноидов, от состава которой зависит окончательная окраска зрелого плода – зелено-коричневая, желтая, оранжевая, красная и/или темно-красная [29, 40].

Среди сортов, взятых в настоящее исследование, Сибиряк (C. annuum) формирует зеленый MF плод, а четыре остальных сорта – фиолетовый. По мере созревания плод сорта Сибиряк меняет окраску с зелено-красной (IR-плод) на темно-красную (RF-плод). Исходно фиолетовые плоды сортов Отелло, Сиреневый куб (оба – C. annuum) и Самоцвет (C. frutescens) меняют окраску с красного/оранжевого оттенка (IR) на красный (RF). Окраска плода у сорта Pimenta da Neyde (C. chinense) – фиолетовая на всех стадиях созревания.

Изменение окраски плода по мере его созревания может определяться различной активностью фитоинсинтазы PSY1. Однако у всех пяти анализируемых образцов, вне зависимости от паттерна пигментации плода и видовой принадлежности, какие-либо радикальные структурные различия между идентифицированными PSY1 отсутствуют. Это предполагает, что разный уровень биосинтеза каротиноидов в плодах данных образцов зависит не от активности фермента PSY1, а от уровня транскрипции кодирующего его гена. И действительно, уровень экспрессии гомологов гена PSY1 в плодах анализируемых сортов перца прямо коррелировал с содержанием каротиноидов и приобретаемой ими по мере созревания окраской. Так, отсутствие транскриптов PSY1 и крайне низкая экспрессия PSY2 в плодах Pimenta da Neyde (C. chinense) коррелирует с зеленой окраской мякоти плода и следовыми количествами каротиноидов. В то же время наиболее высокий уровень экспрессии PSY1 в перикарпе плода сорта Отелло (C. annuum) соответствует темно-красной окраске зрелого плода, по-видимому, за счет более активного синтеза и накопления красных каротиноидов.

Считается, что PSY1 является хромопласт-специфичной фитоинсинтазой [14]. Однако в нашем случае существенная экспрессия PSY1 наблюдалась в листьях и чашелистиках у ряда образцов (Сибиряк, Самоцвет и Pimenta da Neyde). При этом образцы различались по уровню экспрессии гена (рис. 5). Полученные результаты на перцах совпадают с данными по томату и люцерне, где также была показана транскрипция PSY1 в фотосинтезирующих органах [3]. С учетом сказанного, а также принимая во внимание способность PSY2 компенсировать PSY1 [39], можно предположить аналогичные возможности PSY1 по отношению к PSY2 и говорить о влиянии совокупного уровня экспрессии PSY2 и PSY1.

Интересно, что полученные нами паттерны экспрессии PSY1 в тканях перца в целом повторяют профиль транскрипции PSY1 S. lycopersicum [7], чего нельзя сказать о PSY2 (рис. 5). Максимальное число транскриптов PSY2 присутствует в лепестках томата, при этом в листьях, чашелистиках и завязи данный ген экспрессируется заметно слабее [7]. У перца же наибольший уровень транскрипции PSY2 был обнаружен нами в листьях (рис. 5). Мы полагаем, что подобные различия лежат в основе разной пигментации лепестков цветка томата (желтые) и перца клады Annuum (белые/фиолетовые) [23, 29]. Дополнительным тому подтверждением является то, что подавление экспрессии генов PSY1 и PSY2 приводит к почти белой окраске лепестков цветка томата [41].

Таким образом, в настоящем исследовании у пяти образцов трех видов перца клады Annuum идентифицированы и охарактеризованы гомологи генов фитоинсинтаз PSY1 и PSY2, определен профиль ко-экспрессии этих генов в вегетативных и репродуктивных органах и проведена оценка его корреляции с содержанием каротиноидов в плодах. Высокое структурное сходство гомологов между собой свидетельствует о сохранении ими консервативных ключевых функций фитоинсинтаз в синтезе каротиноидов. Отсутствие замещений в функционально значимых участках анализируемых гомологов PSY свидетельствует о корректном транспорте, фолдинге и активности этих ферментов. Показана экспрессия PSY1 не только в плодах, но также и в фотосинтезирующих органах. Предполагается, что изменения в экспрессии PSY1 и PSY2 связаны с полиморфизмом регуляторных областей. Сделано предположение о существовании взаимной функциональной компенсации ферментами PSY1 и PSY2 функций друг друга. Подтверждена прямая корреляция между уровнем экспрессии гена PSY1 и содержанием каротиноидов и, как следствие, с каротиноидной пигментацией плода в процессе созревания.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 19-16-00016, с использованием экспериментальной установки искусственного климата (ЭУИК, ФИЦ Биотехнологии РАН).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Рис. S1.

Аминокислотные последовательности PSY1 анализируемых сортов перца и сорта Zunla-1 (C. annuum; NP_013111896.1).

Рис. S2.

Аминокислотные последовательности PSY2 анализируемых сортов перца и сорта Zunla-1 (C. annuum; XP_016560212.1).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Hashimoto H., Uragami C., Cogdell R.J. Carotenoids and photosynthesis // In Carotenoids in Nature / Ed. Stange C. Basel, Switzerland: Springer, 2016. P. 111–139.

  2. Nambara E., Marion-Poll A. Abscisic acid biosynthesis and catabolism // Annu. Rev. Plant Biol. 2005. V. 56. P. 165–185.

  3. Stauder R., Welsch R., Camagna M. et al. Strigolactone levels in dicot roots are determined by an ancestral symbiosis-regulated clade of the PHYTOENE SYNTHASE gene family // Front Plant Sci. 2018. V. 9. Article 255. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00255

  4. Sun T., Li L. Toward the ‘golden’ era: The status in uncovering the regulatory control of carotenoid accumulation in plants // Plant Sci. 2020. V. 290. Article 110331. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2019.110331

  5. Rudall P.J. Colourful cones: how did flower colour first evolve? // J. Exp. Bot. 2020. V. 71. № 3. P. 759–767. https://doi.org/10.1093/jxb/erz479

  6. Dardick C., Callahan A.M. Evolution of the fruit endocarp: Molecular mechanisms underlying adaptations in seed protection and dispersal strategies // Front Plant Sci. 2014. V. 5. Article 284. https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00284

  7. Giorio G., Stigliani A.L., D’Ambrosio C. Phytoene synthase genes in tomato (Solanum lycopersicum L.) – new data on the structures, the deduced amino acid sequences and the expression patterns // FEBS J. 2008. V. 275. № 3. P. 527–535. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2007.06219.x

  8. Rodriguez-Uribe L., Guzman I., Rajapakse W. et al. Carotenoid accumulation in orange-pigmented Capsicum annuum fruit, regulated at multiple levels // J. Exp. Bot. 2012. V. 63. № 1. P. 517–526. https://doi.org/10.1093/jxb/err302

  9. Liu L., Shao Z., Zhang M., Wang Q. Regulation of carotenoid metabolism in tomato // Mol. Plant. 2015. V. 8. P. 28–39. https://doi.org/10.1016/j.molp.2014.11.006

  10. Yoo H.J., Park W.J., Lee G.M. et al. Inferring the genetic determinants of fruit colors in tomato by carotenoid profiling // Molecules. 2017. V. 22. № 5. Article E764. https://doi.org/10.3390/molecules22050764

  11. Ahrazem O., Diretto G., Argandoña Picazo J. et al. The specialized roles in carotenogenesis and apocarotenogenesis of the phytoene synthase gene family in saffron // Front Plant Sci. 2019. V. 10. Article 249. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00249

  12. Zhou X., Welsch R., Yang Y. et al. Arabidopsis OR proteins are the major posttranscriptional regulators of phytoene synthase in controlling carotenoid biosynthesis // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2015. V. 112. № 11. P. 3558–3563. https://doi.org/10.1073/pnas.1420831112

  13. Tomato Genome Consortium (Sato S., Tabata S., Hirakawa H. et al.). The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution // Nature. 2012. V. 485. P. 635–641.

  14. Bartley G.E., Viitanen P.V., Bacot K.O., Scolnik P.A. A tomato gene expressed during fruit ripening encodes an enzyme of the carotenoid biosynthesis pathway // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 5036–5039.

  15. Ducreux L.J., Morris W.L., Hedley P.E. et al. Metabolic engineering of high carotenoid potato tubers containing enhanced levels of b-carotene and lutein // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 81–89.

  16. Fraser P.D., Enfissi E.M., Halket J.M. et al. Manipulation of phytoene levels in tomato fruit: effects on isoprenoids, plastids, and intermediary metabolism // Plant Cell. 2007. V. 19. P. 3194–3211.

  17. Bartley G.E., Scolnik P.A. cDNA cloning, expression during development, and genome mapping of PSY2, a second tomato gene encoding phytoene synthase // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 25718–25721.

  18. Gallagher C.E., Matthews P.D., Li F., Wurtzel E.T. Gene duplication in the carotenoid biosynthetic pathway preceded evolution of the grasses // Plant Physiol. 2004. V. 135. №3. P. 1776–1783.

  19. Fraser P.D., Schuch W., Bramley P.M. Phytoene synthase from tomato (Lycopersicon esculentum) chloroplasts – partial purification and biochemical properties // Planta. 2000. V. 211. P. 361–369.

  20. Cao H., Luo H., Yuan H. et al. A neighboring aromatic-aromatic amino acid combination governs activity divergence between tomato phytoene synthases // Plant Physiol. 2019. V. 180. № 4. P. 1988–2003. https://doi.org/10.1104/pp.19.00384

  21. Giovannoni J., Nguyen C., Ampofo B. et al. The epigenome and transcriptional dynamics of fruit ripening // Annu. Rev. Plant Biol. 2017. V. 68. P. 61–84. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-042916-040906

  22. Peralta I.E., Spooner D.M. History, origin and early cultivation of tomato (Solanaceae) // Genetic Improvement of Solanaceous Crops. V. 2: Tomato / Eds Razdan M.K., Mattoo A.K. Science Publ. Enfield. CT, 2007. P. 1–27.

  23. Galpaz N., Ronen G., Khalfa Z. et al. A chromoplast-specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed by cloning of the tomato white flower locus // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 1947–1960.

  24. Carrizo García C., Barfuss M.H., Sehr E.M. et al. Phylogenetic relationships, diversification and expansion of chili peppers (Capsicum, Solanaceae) // Ann. Bot. 2016. V. 118. № 1. P. 35–51. https://doi.org/10.1093/aob/mcw079

  25. Barboza G.E., Carrizo García C., Leiva González S. et al. Four new species of Capsicum (Solanaceae) from the tropical Andes and an update on the phylogeny of the genus // PLoS One. 2019. V. 14. Article e0209792. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209792

  26. Berry H.M., Rickett D.V., Baxter C.J. et al. Carotenoid biosynthesis and sequestration in red chilli pepper fruit and its impact on colour intensity traits // J. Exp. Bot. 2019. V. 70. № 10. P. 2637–2650. https://doi.org/10.1093/jxb/erz086

  27. Deruère J., Römer S., d’Harlingue A. et al. Fibril assembly and carotenoid overaccumulation in chromoplasts: a model for supramolecular lipoprotein structures // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 119–133.

  28. Kilcrease J., Rodriguez-Uribe L., Richins R.D. et al. Correlations of carotenoid content and transcript abundances for fibrillin and carotenogenic enzymes in Capsicum annum fruit pericarp // Plant Sci. 2015. V. 232. P. 57–66. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2014.12.014

  29. Mohd Hassan N., Yusof N.A., Yahaya A.F. et al. Carotenoids of Capsicum fruits: Pigment profile and health-promoting functional attributes // Antioxidants (Basel). 2019. V. 8. № 10. Article E469. https://doi.org/10.3390/antiox8100469

  30. Fraser P.D., Truesdale M.R., Bird C.R. et al. Carotenoid biosynthesis during tomato fruit development (evidence for tissue-specific gene expression) // Plant Physiol. 1994. V. 105. № 1. P. 405–413. https://doi.org/10.1104/pp.105.1.405

  31. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes // Methods Enzymol. 1987. V. 148. P. 350–382. https://doi.org/10.1016/0076-6879(87)48036-1

  32. Solovchenko A.E., Chivkunova O.B., Merzlyak M.N., Reshetnikova I.V. A spectrophotometric analysis of pigments in apples // Rus. J. Plant Phys. 2001. V. 48. № 5. P. 693–700.

  33. Puchooa D. A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from lychee (Litchi chinensis Sonn.) // Afr. J. Biotech. 2004. V. 3. P. 253–255.

  34. Филюшин М.А., Джос Е.А., Щенникова А.В., Кочиева Е.З. Зависимость окраски плодов перца от соотношения основных пигментов и профиля экспрессии генов биосинтеза каротиноидов и антоцианов // Физиол. растений. 2020. T. 67. № 6. С. 644–653.

  35. Bemer M., Karlova R., Ballester A.R. et al. The Tomato FRUITFULL homologs TDR4/FUL1 and MBP7/FUL2 regulate ethylene-independent aspects of fruit ripening // Plant Cell. 2012. V. 24. P. 4437. https://doi.org/10.1105/tpc.112.103283

  36. Liu C.I., Liu G.Y., Song Y. et al. A cholesterol biosynthesis inhibitor blocks Staphylococcus aureus virulence // Science. 2008. V. 319. P. 1391–1394.

  37. Филюшин М.А., Джос Е.А., Щенникова А.В., Кочиева Е.З. Особенности экспрессии гена фактора транскрипции anthocyanin2 и его влияния на содержание антоцианов у образцов Capsicum chinense Jacq. с различной окраской плода // Генетика. 2020. Т. 56. № 10. С. 1161–1170.

  38. Jeong H.B., Kang M.Y., Jung A. et al. Single-molecule real-time sequencing reveals diverse allelic variations in carotenoid biosynthetic genes in pepper (Capsicum spp.) // Plant Biotechnol. J. 2019. V. 17. № 6. P. 1081–1093. https://doi.org/10.1111/pbi.13039

  39. Jang S.J., Jeong H.B., Jung A. et al. Phytoene synthase 2 can compensate for the absence of Psy1 in Capsicum fruit // J. Exp. Bot. 2020. Article eraa155. https://doi.org/10.1093/jxb/eraa155

  40. Liu Y., Lv J., Liu Z. et al. Integrative analysis of metabolome and transcriptome reveals the mechanism of color formation in pepper fruit (Capsicum annuum L.) // Food Chem. 2020. V. 306. Article 125629. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125629

  41. Fray R.G., Grierson D. Identification and genetic analysis of normal and mutant phytoene synthase genes of tomato by sequencing, complementation and co-suppression // Plant Mol. Biol. 1993. V. 22. P. 589–602.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал