Генетика, 2021, T. 57, № 3, стр. 345-357

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В общей сложности проанализировали 62 последовательности 16S рРНК и дополнительно по 24 последовательности генов 16S рРНК, Co-1 и Cyt-b для 14 видов, относящихся к семи родам семейства Pleuronectidae. Латинские имена даны в соответствии с классификацией [1]. Пробы (2–5 образцов мышечной ткани, подвергнутой фиксации этанолом, 95%) взяты из имеющейся коллекции Лаборатории молекулярной систематики, а ваучерные экземпляры самих рыб находятся на ответственном хранении в музее ННЦМБ ДВО РАН. Выделение ДНК проводили с помощью коммерческих наборов (“ДНК Экстран-2”, Синтол, Россия).

Фрагмент последовательности гена 16S рРНК амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью праймеров 16Sbr-H и 16Sar-L. Реакцию ПЦР проводили в объеме 25 мкл раствора, содержащего: дистиллированную деионизированную воду – 17.8 мкл; dNTP (ЗАО “Евроген”, Москва, Россия) – 0.5 мкл; 5× Buffer (Evrogen) – 5 мкл; праймеры в концентрации 10 мкМ/мкл – по 0.3 мкл для каждого; Taq-полимераза – 0.1 мкл. Использовали следующую тепловую программу: денатурирование при 93°С в течение 1 мин, отжиг при 55°С в течение 1 мин и элонгация при 72°С в течение 1 мин для 33 циклов. Для определения локализации и порядка расположения нуклеотидов в последовательностях продукты ПЦР (ДНК-образцы) подвергали циклическому секвенированию с помощью набора для секвенирования циклов BrightDye Terminator по следующей программе: денатурирование при 96°С – 10 с, отжиг при 45°С – 10 с, элонгация при 60°С – 2 мин.

Двунаправленные последовательности цепей ДНК генов 16S рРНК были получены для каждого ДНК-образца. Эти последовательности затем объединяли вместе для получиния консенсусных последовательностей каждого образца. Данная процедура выполнена с использованием программного пакета Geneious, Free Trial [17].

Так как длина полученных последовательностей варьировала довольно значительно, в диапазоне от 355 пар нуклеотидов (пн) до 642 пн, то для более точного дальнейшего анализа составили два набора последовательностей. Один набор представлял собой все полученные последовательности, а другой включал только наиболее длинные последовательности. Соответственно преобразованию данных набор 1 содержал 62, а набор 2 – 27 последовательностей. После проведения процедуры выравнивания и удаления гэпов (инделов) длина последовательностей двух наборов составила 291 и 617 пн соответственно.

Выравнивание последовательностей для всех таксонов было выполнено с использованием программного пакета (ПП) MEGA-X (http://megasoftware.net/) [18] на основе модуля ClustalW [19], как интегрированного продукта MEGA. Штрафы за открытие пропусков и за удлинение пропусков были установлены размером 15.0 и 5.0 соответственно (для других настроек программы выравнивания использовали параметры по умолчанию). После первого этапа выравнивания большие пробелы были удалены вручную, и окончательное выравнивание на втором этапе выполнено с уменьшенными уровнями штрафов (5.0 и 0.5 для двух опций соответственно). Все пробелы были затем снова удалены вручную.

Для увеличения информационной емкости кроме гена 16S рРНК в анализ включены последовательности генов Co-1 и Cyt-b, ранее использованные в анализе [10]; в совокупности эти данные составили третий набор последовательностей, включающий всего 24 образца длиной 2926 пн.

Для дальнейшего анализа последовательностей и построения генных деревьев подобрали оптимальную модель замены нуклеотидов для полученного набора последовательностей. Лучшая модель эволюции, которая соответствовала полученным данным, оценена посредством специального модуля программы MEGA. Для набора гена 16S рРНК с короткими последовательностями (291 пн) наилучшей моделью оказалась K2P + G (двухпараметрическая модель М. Кимуры с гамма-распределением замен) [20], для набора этого гена с длинными последовательностями (617 пн) лучшей была модель JC + G (модель Джукса–Кантора с гамма-распределением замен) [21], для набора последовательностей трех генов наилучшей моделью оказалась HKY + G (модель Хасегава–Кишино–Яно с гамма-распределением замен) [22].

Генные деревья были построены посредством четырех методов реконструкции: на основе байесовского анализа (BA), максимального правдоподобия (ML), ближайшего соседства (NJ) и минимальной эволюции (ME). Они были выполнены в MrBayes 3.2.7 (http://nbisweden.github.io/MrBayes/download.html) [23, 24] и MEGA-X [18]. Моделирование процесса реконструкции деревьев в BA проводили в течение одного миллиона поколений n (n = 10⁶). Три другие реконструкции ML, NJ, ME проводили с повторностями равными k = 1000 копий бутстрепа (бутстреп-поддержки).

В качестве внешней группы при укоренении деревьев выбрали ветвь Platichthys stellatus, представитель которой по данным для полного митогенома (мтДНК) ранее был отнесен к внешней ветви в семействе Pleuronectidae [10]. Филогенетические деревья визуализировали и редактировали при необходимости с помощью программного обеспечения FigTree [25] и MEGA-X [18].

Все полученные последовательности по гену 16S рРНК были зарегистрированы в GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/); часть не опубликованных ранее последовательностей Co-1 и Cyt-b также включена в статью (табл. 1).

Статистический анализ нуклеотидного состава выполнен с использованием ПП MEGA-X. Дополнительно с помощью программного пакета Statistica 6 [29] провели однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) нуклеотидного состава отдельно по каждому гену.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ строили, базируясь на последовательностях трех представленных ранее наборов данных. Полная длина участка гена 16S рРНК (полноразмерные последовательности “от праймера до праймера”) составляет 596–631 пн. Номера полноразмерных участков гена 16S рРНК следующие: MN888911, MN888895, MN888908, MN888877, MN888901, MN888894, MN888893, MN888892, MN888917, MN888916, MN888915, MN888903, MN888924, MN888918, MN888912, MN888904, MN888905, MN888868, MN888873, MN888898, MN888899, MN888902, MN888927, MN888909, MN888907, MN888884, MN888883, MN888876.

Однако не все полученные последовательности достигли полного размера. Разница в длине последовательностей обусловлена некачественным секвенированием некоторых образцов, что привело к большему “обрезанию” участков рядом с праймерами при формировании консенсусных последовательностей. Эти погрешности секвенирования возможны в связи с тем, что часть образцов тканей хранились до анализа несколько лет. Однако короткие фрагменты не обязательно плохие для оценки изменчивости в близких таксонах и сопоставления степени их сходства-различия для реконструкции генного дерева. В связи с этим для анализа материал разбили на две группы, включающие длинные (1) и короткие (2) последовательности гена. В соответствии с изложенными подходами (в разделе “Материалы и методы”) построено четыре типа деревьев: BA, ML, NJ и ME.

Анализ всех последовательностей 16S рРНК

На рис. 1 показано укорененное ML-дерево, полученное на основе набора последовательностей гена 16S рРНК длиной 291 пн. Поддержки на деревьях указаны в следующем порядке: BA/ME/ NJ/ML.

Рис. 1.

Укорененное генное дерево, показывающее филогенетические взаимосвязи на основе 62 коротких нуклеотидных последовательностей участка 16S рРНК. Топология представлена на основе ML-реконструкции. В узлах даны значения поддержки для четырех способов реконструкции деревьев в порядке: BA/ME/NJ/ML. Для BA-дерева показаны апостериорные вероятности (%, n = 10⁶ поколений), а для трех других реконструкций даны бутстреп-поддержки (k = 1000 реплик).

Ветвь с образцами Limanda sakhalinensis вошла в состав подсемейства Hippoglossoidinae, образуя отдельную, топологически неразрешенную ветвь (узел) вместе с Cleisthenes pinetorum подсемейства Hippoglossoidinae. Отдельная, также неразрешенная ветвь сформирована представителями трех номинальных видов палтусовидных камбал рода Hippoglossoides. Lepidopsetta mochigarei, представитель трибы Microstomini, имеет для всех пяти соответствующих ветвей на дереве неразрешенную топологию. Отдельный узел на древе формируют представители тихоокеанского белокорого палтуса Hippoglossus stenolepis из подсемейства Hippoglossinae.

Анализ более длинных последовательностей 16S рРНК

На рис. 2 представлено укорененное NJ-дерево, полученное на основе набора последовательностей гена 16S рРНК длиной 617 пн. Ветвь Limanda sakhalinensis включена в подсемейство Hippoglossoidinae, располагаясь в одном кластере с Cleisthenes pinetorum. Последовательности, представляющие подсемейство Hippoglossinae, образуют отдельный узел. Lepidopsetta mochigarei, как и ранее по короткому фрагменту, формирует неразрешенный узел, но топологически входит в трибу Microstomini.

Рис. 2.

Топология укорененного NJ-дерева, показывающая филогенетические взаимоотношения на основании данных для 27 последовательностей участка гена 16S рРНК. В узлах даны значения поддержек для BA-древа (n = 10⁶ поколений) и трех других реконструкций в общем порядке: BA/ME/ML/NJ (k = 1000 реплик бутстрепа для трех последних методов реконструкции).

Анализ реконструкции генных деревьев по объединенным последовательностям трех генов

Для данного анализа были сопоставлены выровненные последовательности участка гена 16S рРНК, а также генов Co-1 и Cyt-b. Последовательности были конкатенированы в MEGA-X и затем подвергнуты дальнейшему анализу. Согласно полученным данным ветвь Limanda sakhalinensis включена в подсемейство Hippoglossoidinae (рис. 3). Ветвь Cleisthenes pinetorum также включена в подсемейство Hippoglossoidinae (рис. 3).

Рис. 3.

Укорененное ML-дерево, показывающее филогенетические взаимоотношения на основании данных для 24 конкатенированных последовательностей участка гена 16S рРНК, Co-1 и Cyt-b. В узлах даны значения поддержек для BA-древа (n = 10⁶ поколений) и для трех других реконструкций в общем порядке: BA/NJ/ME/ML (k = 1000 реплик бутстрепа для трех последних методов реконструкции).

Нуклеотидный состав

Соотношение пиримидинов (T, C) и пуринов (A, G) в генах 16S рРНК, Co-1 и Cyt-b отклонялись от соотношения 50 : 50 (Приложение, рис. 4). В последовательностях 16S рРНК нет больших различий в соотношении пиримидинов (T, C) и пуринов (A, G), но можно наблюдать общую гетерогенность состава нуклеотидов с преобладанием С- и А-нуклеотидов (рис. 4,а). В случае Co-1 и Cyt-b наблюдается статистически значимое отклонение в соотношении пиримидинов к пуринам с преобладанием пиримидинов (рис. 4,б, в).

Рис. 4.

Средние значения состава (%) четырех нуклеотидов в 24 исследованных последовательностях генов 16S рРНК (а), Co-1 (б) и Cyt-b (в). По результатам однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Вертикальные линии отмечают 95%-ный доверительный интервал.

ANOVA по каждому гену обнаружил, что различия для четырех нуклеотидов статистически значимые: для 16S рРНК – F = 2147.9, d.f. = 3; 92, P < 0.0001; для Co-1 – F = 3673.3, d.f. = 3; 92, P < < 0.0001; для Cyt-b – F = 4320.7, d.f. = 3; 92, P < < 0.0001. Доля (T + C) : (A + G) для 16S рРНК, Co-1 и Cyt-b составила 45.4 : 54.6, 56.5 : 43.5 и 61.1 : : 38.9% соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

Как отмечено во введении, крупнейшим подсемейством в семействе является Pleuronectinae. Это подсемейство представлено двумя трибами – Microstomini и Pleuronectini. Согласно полученным данным по 16S рРНК они не образуют монофилетические ветви (см. рис. 1, 2). Таким образом, систематика на уровне подсемейств нуждается в дальнейшем уточнении. Например для большего информационного сигнала необходимо увеличить число как ядерных, так и митохондриальных маркеров при исследовании. Это поможет уменьшить число неразрешенных топологически узлов полученных деревьев.

Как отмечалось, Дж. Купер и Ф. Чаплау [1] в своей ревизии этого семейства на основе традиционных признаков морфологии обосновали, что Pleuronectidae представляет монофилетическую группу. Монофилия камбаловых, установленная на основе классического подхода, соответствует во многих случаях молекулярно-филогенетическим реконструкциям в исследованиях этого семейства по таким маркерам как 12S рРНК, 16S рРНК, а также по генам Cо-1 и Cyt-b [4–6, 8, 9] и полному митогеному [10].

В подсемейство Hippoglossoidinae в наиболее представительном в работе материале вошли два из трех родов Cleisthenes (C. pinetorum) и Hippoglossoides (H. dubius Schmidt, 1904, H. elassodon Jordan & Gilbert, 1180, H. robustus Gill & Townsend, 1897) (рис. 3). Виды рода Hippoglossoides образуют смешанный кластер на BA-дереве (рис. 3). На основании чего можно предположить, что два таксона H. elassodon и H. robustus являются синонимами одного вида. Синонимия H. elassodon и H. robustus уже предлагалась ранее на основании морфологических и молекулярно-филогенетических данных [4, 27–31]. По принципу старшинства можно принять валидным таксон видового ранга H. elassodon Jordan & Gilbert, 1180, а H. robustus Gill & Townsend, 1897 считать младшим синонимом этого вида. Предложение о сведении в синонимию H. elassodon и H. robustus уже сделано ранее, как отмечено выше. Однако К.А. Винников с соавт. [31] в своем двустороннем анализе (морфология + + генетика) предлагают вновь ввести синонимию. Но синонимия так и не введена. В базах данных эти два таксона до сих пор фигурируют как самостоятельные виды. Одна из задач представленной статьи – заострить этот вопрос, с тем чтобы в специальной публикации наконец разрешить этот казус.

Отдельного обсуждения заслуживают данные для рода Limanda. Последовательности вида Limanda sakhalinensis оказались, как отмечено в результатах и представлено на рис. 1–3, включены в ветвь подсемейства Hippoglossoidinae. В сравнительном анатомическом исследовании Дж. Купера и Ф. Чаплау [1] монофилия этого рода не была подтверждена. В нашем же исследовании, как и в предыдущих молекулярно-филогенетических исследованиях [4, 5, 10], Limanda sakhalinensis Hubbs, 1915 оказалась включена в подсемейство Hippoglossoidinae. Учитывая все эти данные, вполне уместно рекомендовать пересмотреть позицию Limanda sakhalinensis Hubbs, 1915, переместив ее в род Hippoglossoides с именем Hippoglossoides (Limanda) sakhalinensis в составе подсемейства Hippoglossoidinae. Соответственно, необходима ревизия морфологии и видовых признаков, а также диагностических ключей, что предполагается выполнить в самостоятельной работе.

Род Lepidopsetta (L. mochigarei) оказался включенным в трибу Pleuronectini, подсемейства Pleuronectinae, тогда как в работе [1] этот род рассматривался исключительно в составе трибы Microstomini подсемейства Pleuronectinae. В молекулярно-филогенетических исследованиях на основе Co-1 и Cyt-b [4, 5, 10] род Lepidopsetta рассматривался в трибе Pleuronectini. Таким образом, род Lepidopsetta предпочтительнее рассматривать в составе трибы Pleuronectini. Однако этот вопрос, учитывая слабый топологический сигнал для данной ветви по маркеру 16S рРНК в работе, требует дальнейшего уточнения с использованием большего числа генов.

Смещение в соотношении (T + C) : (A + T) хорошо описано в литературе для многих белок-кодирующих генов [4, 32]. Представленный анализ (рис. 4, Приложение) показывает, что смещение для генов Co-1 и Cyt-b в соотношении пуринов к пиримидинам значительно отличается от смещения для гена 16S рРНК. Очевидно, что обнаруженное смещение нуклеотидного состава для изученных в работе структурных генов отражает гидрофобные свойства кодируемых ими белков [33]. Выяснение причины неоднородности нуклеотидного состава в последовательностях 16S рРНК требует дальнейшего исследования.

Исследование финансово поддержано грантом РФФИ 15-29-02456-офи по направлению исследования генетических основ биоразнообразия, а также Дальневосточным отделением РАН – грант ДВ № 18-4-040 по тематике “Комплексное исследование биоразнообразия рыб и беспозвоночных животных на основе ДНК-штрих кодирования, разработки и поддержки баз данных и биобанкинга”.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.